DB42T 1590-2020 H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条抗原检测方法

ICS65.020.30CCSB4142ColloidalgoldstripstestfordetectingofH7subtypeavianinfluenzaI前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4检测原理 5检测条件 6检测方法 7结果判定 附录A（规范性）试剂配制 附录B（资料性）H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备 附录C（资料性）胶体金试纸条的制备 8附录D（资料性）样品处理注意事项 9本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由华中农业大学提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司。本文件主要起草人：金梅林、范俊青、李冉、董俊、王园园、但汉并、邹忠、董晓辉、徐高原。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话邮箱：hbsnab@126.com；华中农业大学，联系电话邮箱：xys@。对本文件的有关修改意见建议请反馈至华中农业大学，电话邮箱：jml8328@126.com。禽流感（avianinfluenza,AI）是由甲型流感病毒感染引起的禽类急性传染病。按照致病力的强弱可分为无致病性禽流感、低致病性禽流感、中致病性禽流感和高致病性禽流感。禽流感病毒H7亚型属于高致病性禽流感，OIE将高致病性禽流感列为必须上报的传染病，我国将其列为是优先防治和重点防范的人兽共患病。目前，检测H7亚型禽流感病毒的方法主要是荧光定量PCR方法，该方法的优点是敏感性高，缺点是对操作人员的专业素养要求高，试验条件苛刻，仪器使用昂贵。H7亚型禽流感病毒的胶体金检测方法，是一种现场快速检测H7亚型禽流感病毒的方法，该方法有利于该病的早发现、早报告、早处置，为防控节省时间；同时给临床检测提供一种简单，便捷的检测工具，使高通量检测成为可能，从而切实为实际生产提供便利。1H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条抗原检测方法本文件规定了H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条抗原检测的术语和定义、检测原理、检测条件、检测方法、结果判定。本文件适用于H7亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4检测原理本文件采用双抗夹心检测抗原的方法制备胶体金试纸条，属于一步式固相膜反应。首先制备两株具有夹心效果的H7亚型禽流感病毒单克隆抗体，一株单抗包被在硝酸纤维素膜上，另一株单抗进行胶体金标记，固定在金垫上。在加样孔处（A）加入待检样品时，待检样品中的抗原先与胶体金标记的单抗进行反应，形成肉眼可见的红色金标抗体-抗原结合物。然后，经毛细管作用，该红色结合物继续层析向前移动，与硝酸纤维素膜上的单抗结合，在观察窗口的检测线（T）处，红色结合物中的抗原被此处预先包被在纤维素膜上的抗体捕获并截留下来，随着红色结合物截留量增多，逐渐形成一条红线，因此根据红色T线的出现即可判定样品为阳性。如果样品中没有抗原，则不形成红色金标抗体-抗原结合物，流过T线时，不发生捕获截留，T线保持白色，判定样品为阴性。（检测时质控线（C）处出现红线检测结果有效）胶体金试纸条结构如图1所示：SASCTCT注：A：加样孔；S：检测区；T：检测线；C：质控线图1胶体金试纸条结构示意图25检测条件5.1仪器与耗材Ⅱ级生物安全柜或者超净工作台、冷冻离心机（转速12,000r/min）、电子天平（0.01g-300g）、玻璃匀浆器（5mL）、微量可调移液器（200µL、1mL）、枪头（200µL、1mL）、离心管（1.5mL、2mL、5mL）。5.2试剂H7亚型禽流感病毒单克隆抗体、样本处理液、生理盐水试剂配制方法见附录A。H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备、纯化及鉴定见附录B。6检测方法6.1样品处理6.1.1泄殖腔拭子检测样本的处理将采集的泄殖腔棉拭子插入到含有处理液的离心管中，充分混合，置低温冷冻离心机4℃、12,000r/min离心10min，取上清待检。6.1.2内脏组织检测样本的处理称取内脏组织块0.5g，置于匀浆器中，加生理盐水1mL，研磨完全后取出组织浸出液至离心管中，然后置低温冷冻离心机4℃、12,000r/min离心10min，取上清待检。6.1.3鸡胚分离病毒尿囊液样本的处理收集尿囊液至离心管中，置低温冷冻离心机4℃、12,000r/min离心2min，取上清待检。6.1.4细胞培养病毒样本的处理细胞培养液可直接用于检测或者冻融一次后检测。6.1.5样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护，具体注意事项见附录D。6.2加样取出2℃~8℃保存的胶体金试纸条，并恢复至15℃~25℃。取100µL经样品稀释液处理好的上清加入加样孔A中，水平放置15min，观察结果。胶体金试纸条的制备过程见附录C。7结果判定7.1阳性结果在试纸条上出现两条红色条带（T检测线和C质控线）（见图2）。7.2阴性结果在试纸条上仅出现一条红色条带（C质控线见图3）。7.3无效结果无红色条带出现（见图4）。3图2阳性结果图3阴性结果图4无效结果4试剂配制A.1样本处理液Trisbase24.2g，Triton-x1000.1mL，加蒸馏水至1000mL，调pH值为9.0。A.2生理盐水氯化钠（NaCl）8.5g，加蒸馏水至1000mL。5（资料性）H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备B.1单克隆抗体的制备B.1.1免疫原禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原，加入pH值7.4的PBS2mL溶解，重悬后的溶液加入等体积饱和硫酸铵搅匀，置2℃~8℃作用15h后，2℃~8℃8000r/min离心40min，收集沉淀物加入原病毒液1/20体积的生理盐水溶解，装透析袋内，用PBS透析15h除盐。最后，利用超微量核酸蛋白测定仪测定浓缩抗原液的蛋白含量，加入终浓度为0.04％硫柳汞钠，并调整病毒液的蛋白浓度至2±0.05mg/mL，同时用HA试验检测该病毒液的效价，当其HA效价≥28即可作为免疫原。B.1.2小鼠免疫首次免疫取免疫原与弗氏完全佐剂按照体积1:1进行乳化，6周龄～8周龄雌性BALB/c小鼠3只，皮下分点注射200μg/只，每个点约注射20μg。以后每间隔2周免疫一次，第二、三次免疫将免疫原与弗氏不完全佐剂乳化，皮下分点注射100μg/只。第三次免疫后一周后，自小鼠尾静脉采血用ELISA法检测血清抗体效价，选择效价高的小鼠在融合前3天腹腔注射抗原（不含佐剂）约200μg进行加强免疫。B.1.3骨髓瘤细胞的培养融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，培养在含20%胎牛血清的RPMI1640培养基中。选择处于对数生长期的SP2/0，以RPMI1640培养基洗涤两次后，用约10mLRPMI1640培养基将其吹下。收集于50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，轻轻敲打管底使细胞松散，加入10mLRPMI1640培养基重悬细胞。将细胞悬液10倍稀释后计数，准备融合。B.1.4免疫脾细胞的制备取加强免疫4天后的小鼠，摘取眼球眼眶放血，获得阳性血清，脱颈无菌取出脾脏，先用RPMI1640培养基洗涤数次，去除附着的结缔组织；再将脾脏移入另一置有300目微孔滤网的新鲜RPMI1640培养基中，眼科剪刀剪开一个小口，用研磨棒轻轻挤压，释放脾细胞，制成脾细胞悬液，移至10mL离心管中，置37℃,含5%二氧化碳的培养箱内自然沉降10min，吸取上层细胞悬液于50mL离心管中，再加入3mLRPMI1640培养基重复洗涤2次。以1000r/min离心10min，弃上清液。加入10mLRPMI1640培养基重悬细胞。将细胞悬液10倍稀释后计数。B.1.5饲养细胞的制备取空白BALB/c小鼠一只，摘取眼球眼眶放血，获得阴性血清无菌取出脾脏，先用RPMI1640培养基洗涤2次，去除附着的结缔组织；再将脾脏移入另一置有200目微孔滤网的RPMI1640培养基中，眼科剪刀剪开一个小口，用研磨棒轻轻挤压，释放脾细胞，制成脾细胞悬液，移至10mL离心管中，置37℃,含5%二氧化碳的培养箱内自然沉降10min，吸取上层细胞悬液于50mL离心管中，再加入3mLRPMI1640培养基重复洗涤2次。以1000r/min离心10min，弃上清液。加入10mLRPMI1640培养基重悬细胞。B.1.6细胞融合将一瓶含20%胎牛血清、1%HAT的RPMI1640培养基、1mL50%PEG1450、放入37℃温箱中预热。将重6悬后的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞在50mL离心管中混匀，1000r/min离心10min，弃去上清液，用滤纸将管壁上残留的液体吸干，用手指尖轻轻弹管底，使两种细胞充分混匀。吸取预热的PEG溶液0.8mL，向细胞沉淀（离心管置于37℃水浴中）缓缓滴加，边滴边轻轻搅拌，在1min内加完。静置30秒，之后3min内加入预热的RPMI1640培养基3mL，终止PEG的作用。余下的17mL培养基在2min内加完。融合完成后，1000r/min离心10min，弃上清液。将沉淀的细胞轻轻悬浮于20%胎牛血清、1%HAT的RPMI1640培养基中，加入适量的饲养细胞后，置于96孔细胞培养板中，约200μL/孔，置37℃,含5%二氧化碳的培养箱内培养。第五天补加1滴HAT培养基，第8天弃去孔中液体，补加200μLHAT培养基，待融合集落长至孔底面积的1/4时，取上清进行抗体检测。B.1.7阳性杂交瘤细胞筛选用禽流感病毒H7亚型HI试验筛选阳性杂交瘤细胞。将细胞上清作为待检样品加入反应板中，同时设定SP2/0细胞培养上清作为阴性对照，免疫小鼠血清做为阳性对照。B.1.8有竞争效果的细胞株的筛选用禽流感病毒H7亚型HI试验筛选出阳性血清1份，阴性血清1份。将筛选出的阳性血清和阴性血清用样品稀释液2倍稀释，加入包被好的酶标板中，100μL/孔，37℃作用30min。弃去孔中液体，洗涤5次，每孔加入100μL，37℃作用30min。洗涤5次，拍干，每孔加底物显色液100μL，室温显色15min。每孔加入50μL终止液，用酶标仪进行测定各孔OD450nm值。B.1.9杂交瘤细胞的亚克隆采用有限稀释法对连续3次检测均为阳性且HI抗体效价高者进行亚克隆。首先制备小鼠饲养细胞，铺于96孔细胞板中，100μL/孔；将阳性孔中的杂交瘤细胞用培养基吹下，细胞计数，用有限稀释法按照5:3:1的比例(即96孔板的前四排细胞数为5个/孔，中间四排细胞数为3个/孔，最后四排细胞数为1个/孔)加入96孔板，置37℃,含5%二氧化碳的培养箱内培养，第7日用新的培养基置换出96孔板中培养基，以后每天观察，待上清变黄对出现单个细胞克隆孔用ELISA方法进行检测；连续3次亚克隆且检测阳性者可以定株。将定株的单克隆细胞扩大至24孔板，长满后转至6孔板，最后扩大培养至25cm2细胞培养瓶中，一部分冻存，每株杂交瘤细胞保存6份；一部分扩大培养用于制备腹水。B.1.10腹水法制备单克隆抗体选用8周龄～10周龄BALB/c雌性小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后腹腔注射用PBS稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，1×105个/只；7日～10日后采集腹水，1200r/min离心10min，去除脂肪组织，吸取上清，-70℃及以下保存备用。B.2单克隆抗体的纯化及验证B.2.1腹水单克隆抗体的纯化将上述腹水取1mL，加入4mLpH值4.5醋酸缓冲液，加入辛酸25μL，搅拌30min，静置2h。12000r/min离心10min；弃沉淀，上清用滤纸过滤后将pH值调至7.4，缓慢逐滴加入上述液体体积45%的饱和硫酸铵溶液，继续搅拌30min，在2℃~8℃静置2h；以12000r/min离心30min，弃上清。用原腹水1/2体积的10mmol/LTris-HCL（pH值9.0）将沉淀重悬，转入透析袋中，在10mmol/LTris-HCL（pH值9.0）中2℃~8℃透析15h。超微量核酸蛋白测定仪测定单克隆抗体浓度，分装，-70℃及以下保存。B.2.2单克隆抗体的鉴定7B.2.3浓度将纯化后的单克隆抗体用超微量核酸蛋白测定仪测定蛋白浓度，浓度为4.2mg/mL。B.2.4纯度用SDS电泳检测单抗纯度，结果见图B.1。电泳显示结果应为两条清晰的目的条带（在50KD和25KD附近各有一条清晰的目的条带，分别为重链和轻链），无其他杂带。图B.1单克隆抗体的纯度鉴定8FORMTEXTDB42/T丄FO（资料性）胶体金试纸条的制备C.1胶体金的制备向洁净的锥形瓶中加入100mL注射用水，再加入1mL1%氯金酸溶液（氯金酸1g，溶于100mL蒸馏水中放于微波炉内，中火加热至沸腾，快速加入1.8mL的1.05%柠檬酸三钠溶液后继续加热至溶液颜色为稳定的酒红色，室温下自然冷却，最后用双蒸水定容至100mL，即为胶体金溶液。C.2金标抗体的制备将所得的胶体金用0.2mol/L碳酸钾调节pH值到9.0，加入单克隆抗体，每1mL胶体金溶液的最适单抗标记量为8.0ug，缓慢搅拌45min，得单克隆抗体-胶体金标记物，在搅拌下加入0.5mL5%PEG20000溶液封闭30min。将标记好的胶体金溶液8000rpm离心30min后用10mMTris-HCl（pH9.0）重悬。即获得金标抗体。C.3胶体金结合垫的制备C.3.1配制金垫处理液10mMTris-HCl，0.45%PVP-40，0.45%Tween-20，0.5%SDS-L+SDS-F，3%海藻糖，搅拌混匀后0.22uM滤器过滤备用。C.3.2金垫制备将玻璃纤维素膜浸泡在上述处理液中30min，37℃鼓风箱中烘干。将制备的金标抗体喷