ApoE-LDLR双基因缺失小鼠炎症相关基因表达：洞察动脉粥样硬化炎症机制

ApoE/LDLR双基因缺失小鼠炎症相关基因表达：洞察动脉粥样硬化炎症机制一、引言1.1研究背景与意义动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）作为一种发生于动脉血管的慢性进行性疾病，严重危害着人类健康。它是导致冠心病、心肌梗塞、脑卒中等心脑血管疾病的主要原因，在全球范围内，尤其是西方发达国家和我国，一直是主要的死亡原因之一。据世界卫生组织（WHO）统计数据显示，每年因心脑血管疾病死亡的人数占全球总死亡人数的比例高达30%以上，而动脉粥样硬化作为这些疾病的主要病理基础，其重要性不言而喻。AS的发病机制极为复杂，是多种遗传因素与外界因素共同作用的结果。目前，普遍认为AS是由血脂代谢异常、高血压、糖尿病、肥胖、吸烟等多种因素引发的一种慢性炎症性疾病。炎症在AS的发生、发展过程中起着关键作用，涉及多种细胞类型和生物学过程。在动脉粥样硬化的起始阶段，血脂代谢异常导致血液中脂质成分，尤其是低密度脂蛋白（LDL）水平升高。这些过多的LDL会进入血管内膜下，被氧化修饰形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有很强的细胞毒性，它能够诱导内皮细胞表达多种粘附分子，如血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1），使得血液中的单核细胞和T淋巴细胞能够粘附并迁移到血管内膜下。单核细胞在内膜下分化为巨噬细胞，巨噬细胞通过其表面的清道夫受体大量摄取ox-LDL，逐渐转化为泡沫细胞，这是动脉粥样硬化早期病变的重要特征。随着炎症反应的持续进行，泡沫细胞不断聚集，形成脂纹。同时，炎症细胞如巨噬细胞和T淋巴细胞会释放大量的炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等。这些炎症因子不仅能够进一步激活内皮细胞和巨噬细胞，促进炎症反应的放大，还能刺激平滑肌细胞从动脉中膜迁移到内膜，并增殖合成大量的细胞外基质，如胶原蛋白、弹性蛋白等，逐渐形成纤维斑块。在纤维斑块的发展过程中，炎症反应使得斑块内的细胞成分发生变化，巨噬细胞和T淋巴细胞持续浸润，平滑肌细胞逐渐减少，同时，炎症细胞释放的蛋白水解酶会降解细胞外基质，导致纤维帽变薄，斑块变得不稳定。当不稳定斑块破裂时，会暴露其内部的促凝物质，引发血小板聚集和血栓形成，最终导致血管急性闭塞，引发急性心脑血管事件，如心肌梗死和脑卒中等。载脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）和低密度脂蛋白受体（LowDensityLipoproteinReceptor，LDLR）在脂质代谢过程中扮演着重要角色。ApoE是一种多态性载脂蛋白，主要由肝脏合成，它能够与LDLR和极低密度脂蛋白受体（VLDLR）结合，参与血浆中脂蛋白的代谢和清除。LDLR则是一种细胞膜表面的糖蛋白，能够特异性地识别和结合LDL，通过内吞作用将LDL摄入细胞内，进行代谢和降解，从而调节血液中胆固醇的水平。ApoE/LDLR双基因缺失（ApoE-/-/LDLR-/-）小鼠由于ApoE和LDLR双基因缺失，导致ApoE及其主要受体途径受阻。在普通饮食条件下，这种小鼠就能表现出显著的高脂血症和AS病变，其病理特征与人AS的各个阶段非常相似，是目前研究AS常用的动物模型之一。研究ApoE/LDLR双基因缺失小鼠，对于深入理解AS的发病机制，尤其是炎症在其中的作用机制，具有重要意义。通过对该模型小鼠的研究，可以更清晰地观察到基因缺失引发的脂代谢紊乱与血管炎症损伤之间的关系，以及在AS发生发展过程中，炎症相关基因的动态时序表达特征和它们之间的相互作用机理。这不仅有助于揭示AS的发病本质，为开发新的治疗策略提供理论基础，还能为临床早期诊断和预防AS相关疾病提供潜在的生物标志物和干预靶点。1.2研究目的与主要问题本研究旨在通过对ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的深入探究，揭示炎症相关基因在动脉粥样硬化发生发展过程中的表达规律及其作用机制，为动脉粥样硬化的防治提供新的理论依据和潜在治疗靶点。具体而言，本研究拟解决以下关键问题：ApoE/LDLR双基因缺失小鼠炎症相关基因的表达特征：利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）以及实时定量RT-PCR技术，检测不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠与野生型小鼠肝脏和主动脉中炎症相关重要基因，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）等的时序表达差异，明确这些基因在ApoE/LDLR双基因缺失小鼠中的表达模式，包括表达量的变化趋势、表达高峰出现的时间等，以及与野生型小鼠相比的差异。炎症相关基因表达与血脂及血清炎症因子的关联：同步检测ApoE/LDLR双基因缺失小鼠血脂（如总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等）和血清中炎症因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）的变化，分析炎症相关基因表达水平与血脂异常、血清炎症因子水平之间的相关性，探究它们在动脉粥样硬化发生发展过程中的相互作用关系，例如炎症基因的高表达是否会导致血脂代谢进一步紊乱，或者血脂异常是否会诱导炎症基因的过度表达。炎症相关基因表达与肝脏和主动脉内膜病理形态改变的关系：通过组织病理学方法，观察不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏和主动脉内膜的病理形态改变，如肝脏脂肪变性、炎症细胞浸润，主动脉内膜脂质沉积、斑块形成等情况，并将这些病理变化与炎症相关基因的表达水平进行关联分析，明确炎症相关基因表达在动脉粥样硬化病理进程中的作用，判断炎症基因的表达变化是否能预示肝脏和主动脉内膜的病理损伤程度，以及病理形态改变对炎症基因表达的反馈调节机制。ApoE和LDLR双基因缺失引发的脂代谢紊乱与血管炎症损伤的内在联系：结合上述实验结果，深入探讨ApoE和LDLR双基因缺失引发的脂代谢紊乱如何启动和促进血管炎症损伤，以及血管炎症损伤又如何反过来影响脂代谢过程，从而全面揭示动脉粥样硬化早期的发病机制，为早期干预和预防动脉粥样硬化提供理论支持，寻找在脂代谢紊乱与血管炎症损伤之间起关键调控作用的炎症相关基因或信号通路，为开发新的治疗策略提供潜在靶点。1.3研究方法与技术路线本研究将采用多种实验方法，全面深入地探究ApoE/LDLR双基因缺失小鼠炎症相关基因的表达情况，具体方法如下：动物模型的建立与分组：选取健康的ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠，按照不同年龄段（如14天龄、1月龄、2月龄、3月龄等）进行分组，每组设置多个重复样本，以确保实验结果的可靠性和统计学意义。小鼠饲养于标准的动物饲养环境中，给予普通饮食或特定的高脂饮食，定时监测小鼠的体重、饮食量和一般健康状况。RNA提取与逆转录：采用Trizol试剂法从小鼠的肝脏和主动脉组织中提取总RNA。通过紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.1之间，以保证RNA的质量。随后，利用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA，为后续的PCR反应提供模板。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：设计针对炎症相关基因（如TNF-α、IL-1、IL-6、CRP等）以及内参基因（如β-actin）的特异性引物，引物的设计遵循相关的引物设计原则，确保引物的特异性和扩增效率。以逆转录得到的cDNA为模板，进行RT-PCR反应。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液等。反应条件经过优化，一般包括预变性、变性、退火、延伸等步骤，通过不同的温度和时间循环，实现对目的基因的扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，利用凝胶成像系统观察并拍照记录条带的位置和亮度，初步分析炎症相关基因的表达情况。实时定量RT-PCR：在RT-PCR的基础上，进一步采用实时定量RT-PCR技术对炎症相关基因的表达进行精确定量分析。使用荧光定量PCR仪，以SYBRGreen染料法或TaqMan探针法进行反应。反应体系除了包含RT-PCR所需的成分外，还加入了荧光染料或探针，通过检测荧光信号的强度和增长速率，实时监测PCR反应的进程。采用标准曲线法或比较CT值法对目的基因的表达量进行计算和分析，以准确评估不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠与野生型小鼠肝脏和主动脉中炎症相关基因的表达差异。血脂及血清炎症因子检测：采集不同年龄段小鼠的血液样本，通过离心分离血清。采用全自动生化分析仪检测血清中的血脂指标，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等。同时，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测血清中炎症因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）的浓度，分析血脂异常与炎症因子水平之间的关系，以及它们与炎症相关基因表达的关联。组织病理学观察：将小鼠的肝脏和主动脉组织进行固定、脱水、包埋等处理，制成石蜡切片。通过苏木精-伊红（HE）染色、油红O染色等方法，对切片进行染色，观察肝脏脂肪变性、炎症细胞浸润，主动脉内膜脂质沉积、斑块形成等病理形态改变。采用图像分析软件对病理切片进行定量分析，如测量斑块面积、炎症细胞浸润程度等指标，并将这些病理变化与炎症相关基因的表达水平进行相关性分析，明确炎症相关基因表达在动脉粥样硬化病理进程中的作用。本研究的技术路线如图1所示，首先建立ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠模型，并进行分组饲养；然后在不同时间点采集小鼠的肝脏、主动脉组织和血液样本；对组织样本进行RNA提取、逆转录和RT-PCR、实时定量RT-PCR分析，以检测炎症相关基因的表达；对血液样本进行血脂和血清炎症因子检测；同时对肝脏和主动脉组织进行病理学观察；最后综合分析所有实验数据，探讨ApoE/LDLR双基因缺失小鼠炎症相关基因的表达特征及其与血脂、血清炎症因子以及病理形态改变的关系，揭示动脉粥样硬化早期的发病机制。[此处插入技术路线图，图中清晰展示从动物模型建立到各项实验检测及数据分析的流程][此处插入技术路线图，图中清晰展示从动物模型建立到各项实验检测及数据分析的流程]二、理论基础与研究现状2.1ApoE和LDLR基因的功能与作用机制载脂蛋白E（ApoE）是一种多功能的载脂蛋白，在脂质代谢、神经功能以及免疫调节等方面发挥着关键作用。ApoE主要由肝脏合成和分泌，此外，巨噬细胞、星形胶质细胞等也能少量合成。在脂质代谢过程中，ApoE作为一种重要的配体蛋白，能够与多种脂蛋白受体结合，如低密度脂蛋白受体（LDLR）、极低密度脂蛋白受体（VLDLR）以及乳糜微粒残粒受体等。通过与这些受体的特异性结合，ApoE参与了血浆中脂蛋白的代谢和清除过程。例如，富含甘油三酯的脂蛋白，如乳糜微粒（CM）和极低密度脂蛋白（VLDL）在脂解过程中产生的残粒，可通过ApoE与相应受体的相互作用，被肝脏等组织摄取和代谢，从而维持血浆中脂质的平衡。ApoE基因具有多态性，常见的等位基因有ε2、ε3和ε4，分别编码ApoE2、ApoE3和ApoE4三种异构体。不同异构体在结构和功能上存在一定差异，其中ApoE3是最常见的亚型，被认为是正常的野生型。ApoE2与受体的结合能力较弱，而ApoE4与ApoE3相比，仅在一个氨基酸位点上存在差异，却表现出不同的生物学特性。ApoE4与受体的亲和力虽然与ApoE3相近，但在脂质代谢和神经生物学功能方面却有显著不同。临床研究表明，携带ApoE4等位基因的个体，患动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等疾病的风险明显增加。在动脉粥样硬化的发生发展过程中，ApoE不仅参与脂质代谢，还具有抗炎、抗氧化等作用。ApoE可以抑制炎症细胞的活化和炎症因子的释放，减少氧化应激损伤，从而对血管内皮细胞起到保护作用。缺乏ApoE的小鼠，由于脂质代谢紊乱，血液中胆固醇和甘油三酯水平显著升高，容易在血管壁形成脂质沉积，进而引发炎症反应和动脉粥样硬化病变。低密度脂蛋白受体（LDLR）是一种细胞膜表面的糖蛋白，在胆固醇代谢中起着核心调控作用。LDLR主要在肝脏、肾上腺皮质、性腺等组织细胞表面高度表达。其结构包括富含半胱氨酸的配体结合结构域、表皮生长因子前体同源结构域、糖基化结构域、跨膜结构域和胞质结构域。LDLR的主要功能是识别和结合血液中的低密度脂蛋白（LDL），通过受体介导的内吞作用，将LDL摄入细胞内，进行代谢和降解。具体过程如下：LDLR的配体结合结构域能够特异性地识别LDL颗粒表面的载脂蛋白B-100（ApoB-100），二者结合形成LDL-LDLR复合物。随后，该复合物被细胞膜内陷形成的有被小窝包裹，进而形成有被小泡进入细胞内。有被小泡迅速脱去外被蛋白，与早期内体融合。在早期内体的酸性环境下，LDL与LDLR分离，LDLR返回细胞膜表面，重新参与LDL的摄取过程；而含有LDL的内体则与溶酶体融合，LDL被溶酶体中的水解酶降解，释放出胆固醇等物质。细胞内的胆固醇水平对LDLR的表达具有负反馈调节作用。当细胞内胆固醇含量升高时，会抑制胆固醇合成相关基因的表达，同时也会抑制LDLR基因的转录，减少LDLR的合成，从而减少细胞对LDL的摄取，维持细胞内胆固醇的稳态。相反，当细胞内胆固醇水平降低时，会激活相关的信号通路，促进LDLR基因的表达，增加LDLR的合成，使细胞能够摄取更多的LDL，以满足细胞对胆固醇的需求。LDLR基因的突变或缺陷会导致LDLR功能异常，使血液中LDL无法正常被清除，从而导致血浆中LDL水平升高，胆固醇沉积在血管壁，增加动脉粥样硬化和心血管疾病的发病风险。家族性高胆固醇血症就是一种由于LDLR基因突变导致的遗传性疾病，患者体内LDLR数量减少或功能异常，血液中胆固醇水平显著升高，常伴有早发性动脉粥样硬化和冠心病。2.2动脉粥样硬化与炎症的关系动脉粥样硬化（AS）并非单纯的脂质沉积性疾病，越来越多的研究表明，炎症贯穿于AS发生、发展的全过程，是其重要的病理特征。炎症细胞和炎症因子在这一过程中扮演着关键角色，它们相互作用，形成复杂的炎症网络，共同推动AS病变的进展。在AS的起始阶段，血管内皮细胞受损是关键的触发因素。多种危险因素，如血脂异常、高血压、高血糖、吸烟等，均可导致血管内皮细胞功能障碍。受损的内皮细胞会发生形态和功能的改变，其屏障功能减弱，通透性增加，使得血液中的脂质成分，特别是低密度脂蛋白（LDL）更容易进入血管内膜下。同时，内皮细胞还会表达多种粘附分子，如血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和E-选择素等。这些粘附分子能够与血液中的炎症细胞表面的相应受体结合，介导炎症细胞向血管内膜下的粘附和迁移。单核细胞是最早被招募到血管内膜下的炎症细胞之一，在粘附分子和趋化因子的作用下，单核细胞穿过内皮细胞间隙，进入内膜下组织，并分化为巨噬细胞。巨噬细胞具有强大的吞噬能力，它通过表面的清道夫受体大量摄取进入内膜下的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），逐渐转化为泡沫细胞。泡沫细胞的形成是AS早期病变的重要标志，这些细胞在血管内膜下不断聚集，形成脂纹，标志着AS的开始。随着AS病变的发展，炎症反应逐渐加剧，更多的炎症细胞被募集到病变部位。T淋巴细胞是参与AS炎症反应的另一类重要细胞。T淋巴细胞主要以CD4+辅助性T细胞（Th）为主，它们能够识别抗原呈递细胞（如巨噬细胞）表面的抗原肽-MHCⅡ类分子复合物，被激活后分化为不同的亚型，如Th1、Th2、Th17等。Th1细胞主要分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，这些细胞因子能够激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤能力，同时也能促进炎症反应的进一步放大。Th17细胞则主要分泌白细胞介素-17（IL-17），IL-17可以招募中性粒细胞和单核细胞到炎症部位，促进炎症细胞的浸润和活化，还能刺激血管平滑肌细胞增殖和迁移，参与AS斑块的形成和发展。而Th2细胞分泌的细胞因子，如白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）等，主要参与体液免疫反应，在AS中的作用相对较为复杂，既有可能通过抑制Th1细胞的功能而发挥抗炎作用，也可能在一定条件下促进AS的发展。炎症因子在AS的炎症反应中起着核心调节作用。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种具有广泛生物学活性的促炎细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和T淋巴细胞分泌。TNF-α可以通过多种途径促进AS的发展。它能够上调内皮细胞表面粘附分子的表达，增加炎症细胞的粘附和迁移；激活巨噬细胞，使其分泌更多的炎症因子，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等，形成炎症因子的级联放大反应；还能诱导血管平滑肌细胞凋亡，影响斑块的稳定性。白细胞介素-1（IL-1）也是一种重要的促炎细胞因子，主要由单核巨噬细胞产生。IL-1可以促进内皮细胞表达粘附分子，吸引炎症细胞聚集；刺激血管平滑肌细胞增殖和迁移，促进细胞外基质合成，导致血管壁增厚；同时还能激活肝脏细胞合成C反应蛋白（CRP）等急性时相蛋白，CRP作为一种炎症标志物，也参与了AS的炎症反应，它可以与补体系统相互作用，增强炎症反应，还能促进血小板聚集，增加血栓形成的风险。白细胞介素-6（IL-6）同样在AS的炎症过程中发挥着关键作用。IL-6主要由巨噬细胞、T淋巴细胞和内皮细胞等产生，它能够诱导肝脏合成急性期反应蛋白，如CRP、血清淀粉样蛋白A（SAA）等，参与全身炎症反应；促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化和增殖，调节免疫反应；还能刺激血管平滑肌细胞增殖和迁移，促进AS斑块的形成。此外，IL-6还可以通过与其他炎症因子相互作用，如与TNF-α协同作用，进一步增强炎症反应的强度。除了上述炎症细胞和炎症因子外，还有许多其他因素也参与了AS的炎症反应。例如，趋化因子是一类能够吸引炎症细胞定向迁移的小分子蛋白质，在AS中，多种趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、RANTES（调节激活正常T细胞表达和分泌的因子）等的表达上调，它们能够特异性地吸引单核细胞、T淋巴细胞等炎症细胞向血管内膜下迁移，参与AS病变的发展。补体系统作为固有免疫的重要组成部分，也在AS的炎症反应中发挥作用。补体激活后产生的一系列裂解产物，如C3a、C5a等，具有趋化作用，能够吸引炎症细胞到病变部位，同时还能激活炎症细胞，增强炎症反应。此外，氧化应激在AS的炎症反应中也起着重要的促进作用。氧化应激产生的大量活性氧（ROS），如超氧阴离子、过氧化氢等，能够氧化修饰LDL，形成ox-LDL，ox-LDL不仅具有细胞毒性，还能作为一种抗原，激活炎症细胞，促进炎症反应的发生和发展。在AS病变的不同阶段，炎症反应呈现出不同的特点和作用。在早期的脂纹阶段，炎症细胞的浸润和炎症因子的释放相对较少，主要以泡沫细胞的形成为主。随着病变的进展，进入纤维斑块阶段，炎症反应逐渐加剧，炎症细胞大量浸润，炎症因子的分泌也明显增加。此时，炎症反应不仅促进了血管平滑肌细胞的增殖和迁移，以及细胞外基质的合成，使得纤维斑块不断增大和增厚，还影响了斑块内细胞的代谢和功能，导致斑块内出现坏死、出血等病理改变。在晚期的粥样斑块阶段，炎症反应进一步激化，炎症细胞持续释放大量的炎症因子和蛋白水解酶，这些酶能够降解细胞外基质，使得纤维帽变薄，斑块变得不稳定。当不稳定斑块破裂时，会暴露其内部的促凝物质，引发血小板聚集和血栓形成，导致血管急性闭塞，从而引发急性心脑血管事件，如心肌梗死、脑卒中等。因此，炎症在AS的发生、发展过程中起着至关重要的作用，深入研究炎症相关机制，对于揭示AS的发病本质，寻找有效的防治策略具有重要意义。2.3ApoE/LDLR双基因缺失小鼠模型在研究中的应用ApoE/LDLR双基因缺失小鼠模型在动脉粥样硬化研究中具有不可替代的重要作用，为深入探究动脉粥样硬化的发病机制、疾病进展以及治疗策略提供了关键的研究工具。在动脉粥样硬化研究领域，该小鼠模型的应用极为广泛。由于ApoE和LDLR双基因缺失，导致小鼠体内ApoE及其主要受体途径受阻，在普通饮食条件下即可出现显著的高脂血症。研究表明，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠血液中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平相较于野生型小鼠显著升高，且这种血脂异常在小鼠出生后不久即可检测到，并随着年龄的增长逐渐加剧。例如，在14天龄的ApoE/LDLR双基因缺失小鼠中，其血清TC水平可能已经达到野生型小鼠的数倍，且随着月龄的增加，如在1月龄、2月龄时，血脂水平持续攀升，呈现出明显的时间依赖性变化。这种高脂血症状态为动脉粥样硬化的发生发展提供了病理基础，使得小鼠血管壁容易出现脂质沉积，进而引发一系列的炎症反应和病理改变。从病变特征来看，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的动脉粥样硬化病变与人AS的各个阶段具有高度的相似性。在疾病早期，小鼠主动脉内膜下可见大量脂质条纹形成，这些脂质条纹主要由泡沫细胞聚集而成，与人类AS早期的病理特征一致。随着年龄的增长，病变逐渐进展为纤维斑块，斑块内不仅有大量的脂质沉积，还包含平滑肌细胞、炎症细胞以及细胞外基质等成分。在病变后期，小鼠的动脉粥样硬化斑块会出现不稳定的特征，如纤维帽变薄、斑块内出血、坏死等，这些病变特征与人类AS晚期易引发急性心脑血管事件的不稳定斑块极为相似。通过对不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠动脉粥样硬化病变的观察和分析，可以深入了解AS在不同阶段的病理变化过程，为研究AS的发病机制和疾病进展提供了直观的模型。作为研究动脉粥样硬化的理想模型，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠具有诸多优势。与其他动脉粥样硬化小鼠模型相比，如单纯ApoE基因敲除小鼠或LDLR基因敲除小鼠，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的血脂异常更为显著，动脉粥样硬化病变出现的时间更早、程度更严重。这使得研究者能够在较短的时间内观察到明显的病变，大大缩短了研究周期，提高了研究效率。此外，该模型能够更全面地模拟人类AS的发病过程，因为ApoE和LDLR在脂质代谢中均起着关键作用，双基因缺失更接近人类AS患者体内复杂的基因缺陷和脂质代谢紊乱状态。同时，小鼠作为实验动物，具有繁殖周期短、饲养成本相对较低、易于进行基因操作等优点，方便研究者进行大规模的实验研究和基因功能分析。例如，研究者可以通过对ApoE/LDLR双基因缺失小鼠进行特定基因的过表达或敲低实验，进一步探究基因之间的相互作用以及它们在AS发病机制中的作用，为寻找新的治疗靶点和开发有效的治疗药物提供有力的实验依据。2.4炎症相关基因的研究进展炎症相关基因在机体的炎症反应过程中发挥着至关重要的作用，它们参与了炎症的启动、发展以及消退等多个环节，其表达水平的变化能够敏感地反映炎症状态的改变。对这些基因的深入研究，不仅有助于我们深刻理解炎症的发生机制，还为炎症相关疾病的诊断、治疗以及预防提供了重要的理论依据和潜在的治疗靶点。C反应蛋白（CRP）基因是炎症相关基因中的重要一员。CRP作为一种经典的急性时相反应蛋白，由CRP基因编码产生。在健康状态下，机体中CRP的含量极低，通常处于纳克每毫升的水平。然而，一旦机体受到感染、创伤、炎症等刺激，CRP基因的表达会迅速上调。这是因为炎症刺激会激活一系列细胞内信号通路，如核因子-κB（NF-κB）信号通路。激活的NF-κB会进入细胞核，与CRP基因启动子区域的特定序列结合，从而促进CRP基因的转录，使得CRP的合成和分泌大量增加。研究表明，在急性炎症反应中，CRP的血浆浓度可在短时间内（数小时至数天）升高数十倍甚至数百倍。CRP主要通过与补体系统相互作用，激活补体经典途径，从而促进炎症细胞的趋化、吞噬以及免疫复合物的清除。CRP还能与多种细胞表面的受体结合，调节细胞的功能和活性。例如，CRP可以与巨噬细胞表面的Fcγ受体结合，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进炎症反应的发展。CRP在炎症反应中的作用广泛而复杂，其作为炎症标志物，在临床诊断中具有重要价值。临床上，常通过检测血清中CRP的水平来辅助诊断炎症相关疾病，如感染性疾病、自身免疫性疾病等。高水平的CRP往往提示机体存在炎症状态，且CRP水平的变化还可用于评估疾病的严重程度和治疗效果。在细菌感染性疾病中，CRP水平通常会显著升高，且其升高程度与感染的严重程度相关。通过监测CRP水平的变化，医生可以及时了解患者的病情进展，调整治疗方案。白细胞介素-1β（IL-1β）基因在炎症反应中也扮演着关键角色。IL-1β是白细胞介素家族中的重要成员，由IL-1β基因编码。IL-1β主要由单核巨噬细胞产生，在炎症刺激下，巨噬细胞内的IL-1β基因被激活表达。与CRP基因类似，炎症刺激会激活细胞内的信号通路，如NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。这些信号通路的激活会导致转录因子的活化，进而结合到IL-1β基因的启动子区域，启动IL-1β基因的转录。新合成的IL-1β最初以无活性的前体形式存在，需要经过半胱天冬酶-1（Caspase-1）的切割加工，才能转化为具有生物学活性的成熟IL-1β。成熟的IL-1β释放到细胞外，通过与靶细胞表面的IL-1受体结合，启动下游的信号转导，引发一系列炎症反应。IL-1β可以促进血管内皮细胞表达粘附分子，如血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1），从而增强炎症细胞与血管内皮细胞的粘附，促进炎症细胞向炎症部位的迁移和浸润。IL-1β还能刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化和增殖，增强机体的免疫反应。IL-1β在炎症反应中具有很强的促炎作用，其过度表达与多种炎症相关疾病的发生发展密切相关。在类风湿性关节炎患者中，关节滑膜组织中IL-1β的表达明显升高，导致关节炎症的持续发展和组织损伤。针对IL-1β的靶向治疗，如使用IL-1β拮抗剂，已在临床上用于治疗一些炎症相关疾病，并取得了一定的疗效。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因同样是炎症相关基因研究的重点。TNF-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，由TNF-α基因编码。TNF-α主要由活化的巨噬细胞和T淋巴细胞产生。在炎症过程中，TNF-α基因的表达受到多种因素的调控。炎症刺激信号通过激活细胞内的信号通路，如NF-κB、MAPK等，促使转录因子与TNF-α基因的启动子区域结合，从而诱导TNF-α基因的转录和表达。TNF-α具有强大的促炎作用，它可以通过多种途径参与炎症反应。TNF-α能够上调内皮细胞表面粘附分子的表达，促进炎症细胞的粘附和迁移。它还能激活巨噬细胞，使其分泌更多的炎症因子，如IL-1、IL-6等，形成炎症因子的级联放大反应。TNF-α还能诱导细胞凋亡，影响组织的修复和再生。在动脉粥样硬化的发生发展过程中，TNF-α的过度表达会导致血管内皮细胞损伤、炎症细胞浸润和泡沫细胞形成，促进斑块的形成和发展。TNF-α在炎症反应中的作用十分关键，其异常表达与许多疾病的发生发展密切相关。临床上，针对TNF-α的生物制剂，如英夫利昔单抗、阿达木单抗等，已广泛应用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病，通过阻断TNF-α的生物学活性，减轻炎症反应，改善患者的症状和病情。除了上述基因外，还有许多其他炎症相关基因也在炎症反应中发挥着重要作用。白细胞介素-6（IL-6）基因编码的IL-6是一种多功能细胞因子，在炎症、免疫调节和急性期反应中具有重要作用。IL-6基因的表达受到炎症刺激的诱导，其产物IL-6可以促进B淋巴细胞的分化和抗体分泌，调节T淋巴细胞的功能，还能刺激肝脏合成急性期反应蛋白，如CRP等。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因编码的MCP-1是一种重要的趋化因子，能够吸引单核细胞、T淋巴细胞等炎症细胞向炎症部位迁移。在炎症反应中，MCP-1基因的表达上调，使得MCP-1的分泌增加，从而在炎症细胞的募集和炎症反应的发展中发挥重要作用。随着研究的不断深入，越来越多的炎症相关基因及其作用机制被揭示。目前，对于炎症相关基因的研究已不仅仅局限于基因的表达调控和蛋白产物的功能研究，还涉及到基因多态性与炎症相关疾病易感性的关系、炎症相关基因之间的相互作用网络以及基于炎症相关基因的靶向治疗等多个方面。基因多态性研究发现，某些炎症相关基因的单核苷酸多态性（SNP）与个体对炎症相关疾病的易感性密切相关。例如，CRP基因的某些SNP位点可能影响CRP的表达水平和功能，从而增加个体患心血管疾病、糖尿病等炎症相关疾病的风险。在炎症相关基因的相互作用网络研究中，发现这些基因之间存在复杂的调控关系，它们通过相互激活或抑制，形成一个精密的调控网络，共同调节炎症反应的进程。对炎症相关基因的研究仍在不断深入，未来有望通过对这些基因的深入了解，开发出更加有效的炎症相关疾病的诊断方法和治疗策略。三、实验设计与方法3.1实验动物与饲养环境本实验选用的ApoE/LDLR双基因缺失小鼠由[具体来源，如某知名实验动物中心]提供，其品系背景为[详细品系背景信息]。同时，选取同背景的野生型小鼠作为对照，野生型小鼠同样来源于[具体来源]。所有小鼠在实验开始时均健康状况良好，无明显疾病症状。小鼠饲养于符合SPF（无特定病原体）级标准的动物房内。动物房的温度严格控制在22±2℃之间，这样的温度范围能够保证小鼠处于较为舒适的环境中，避免因温度过高或过低对小鼠的生理状态产生影响。相对湿度维持在50%±10%，适宜的湿度有助于防止小鼠呼吸道疾病的发生，同时也有利于保持动物房内的卫生条件。动物房内采用12小时光照/12小时黑暗的循环光照制度，模拟自然的昼夜节律，以维持小鼠正常的生物钟和生理节律。小鼠饲养在经过严格消毒处理的塑料笼具中，每个笼具内饲养[X]只小鼠，以确保小鼠有足够的活动空间。笼具内铺垫经过高温高压消毒的玉米芯垫料，垫料需定期更换，一般每周更换2-3次，以保持笼内的清洁卫生，减少微生物滋生。小鼠自由摄取经过辐照灭菌处理的标准啮齿类动物饲料，饲料的营养成分符合小鼠生长发育的需求，包含适量的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质等。同时，小鼠可自由饮用经过高温灭菌的纯净水，保证其水分摄入充足且安全。在实验过程中，每天定时观察小鼠的饮食、饮水、活动情况以及精神状态等，详细记录小鼠的体重变化，每周至少测量一次体重，以便及时发现小鼠的健康问题和生长发育异常情况。3.2实验分组与样本采集本实验按照小鼠的年龄和基因型进行分组，具体分组情况如下：将ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠分别分为14天龄组、1月龄组、2月龄组和3月龄组，每组各设置10只小鼠。这样的分组方式能够全面地反映不同年龄段以及不同基因型小鼠在炎症相关基因表达等方面的差异。在样本采集时间方面，14天龄组小鼠在出生后第14天进行样本采集；1月龄组小鼠在出生后满1个月（30天左右）时采集样本；2月龄组小鼠在出生后满2个月（60天左右）进行样本采集；3月龄组小鼠则在出生后满3个月（90天左右）时采集样本。严格按照这些时间点采集样本，有助于确保实验数据的准确性和可靠性，避免因样本采集时间的差异而对实验结果产生干扰。对于样本采集部位，主要选取小鼠的肝脏和主动脉组织。肝脏是脂质代谢的重要器官，ApoE和LDLR双基因缺失可能会对肝脏的脂质代谢和炎症反应产生显著影响，因此肝脏组织对于研究炎症相关基因在脂质代谢异常背景下的表达变化具有重要意义。主动脉作为动脉粥样硬化的好发部位，其内膜的病变情况能够直观地反映动脉粥样硬化的发生发展进程，所以采集主动脉组织可以深入研究炎症相关基因表达与动脉粥样硬化病变之间的关系。在样本采集方法上，首先使用过量的戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔注射麻醉，待小鼠完全失去知觉后，迅速打开胸腔和腹腔。对于肝脏样本的采集，用眼科剪从肝脏左叶或右叶剪下约0.5-1g的组织块，放入预先装有RNA保护液的冻存管中，标记好样本信息后，立即放入液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱中保存，以防止RNA降解，确保后续实验中RNA的质量。对于主动脉样本的采集，小心地分离出主动脉，从主动脉弓开始，一直到腹主动脉分叉处，完整地取出主动脉，用预冷的PBS缓冲液冲洗掉血管表面的血液和杂质，将主动脉剪成约0.5-1cm长的小段，同样放入装有RNA保护液的冻存管中，标记后液氮速冻，再转移至-80℃冰箱保存。在采集血液样本时，使用一次性注射器从心脏采血约1-2ml，将血液注入无抗凝剂的离心管中，室温静置30min，使血液充分凝固后，以3000r/min的转速离心15min，分离出血清，将血清转移至新的离心管中，标记好后放入-80℃冰箱保存，用于后续血脂和血清炎症因子的检测。3.3主要实验技术与检测指标逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是检测基因表达的重要技术，其原理基于RNA的逆转录和DNA的聚合酶链式反应。在实验中，首先从采集的小鼠肝脏和主动脉组织样本中提取总RNA。这一步骤使用Trizol试剂，利用其能迅速裂解细胞并抑制RNA酶活性的特性，有效地从组织细胞中释放出RNA。提取的总RNA中包含mRNA、rRNA、tRNA等多种类型，而我们关注的是mRNA，它携带了基因表达的信息。随后，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，以Oligo（dT）或随机引物为引导，将mRNA反转录成互补DNA（cDNA）。逆转录酶具有依赖RNA的DNA聚合酶活性，能够以RNA为模板合成cDNA的第一条链。这一过程将RNA信息转化为DNA形式，便于后续的PCR扩增。在完成cDNA合成后，进行PCR扩增。PCR反应体系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液等。引物是根据目标炎症相关基因（如TNF-α、IL-1、IL-6、CRP等）的特定序列设计的，具有高度的特异性，能够准确地与目标基因的特定区域结合。dNTPs提供了合成DNA所需的原料，TaqDNA聚合酶则催化DNA的合成反应。PCR反应条件经过精心优化，一般预变性步骤在94-95℃下进行3-5分钟，目的是使DNA模板完全解链，形成单链DNA，为后续引物结合提供条件。变性步骤在94℃左右进行30秒，使双链DNA解旋为单链。退火温度根据引物的Tm值（解链温度）而定，通常在55-65℃之间，持续30秒左右，这一步骤中引物与单链DNA模板特异性结合。延伸步骤在72℃下进行，TaqDNA聚合酶在这一温度下活性最高，它以dNTPs为原料，按照碱基互补配对原则，从引物的3'端开始合成新的DNA链，延伸时间根据目标基因片段的长度而定，一般每延伸1kb需要1分钟左右。经过30-35个循环的变性、退火和延伸，目标基因片段得以大量扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，琼脂糖凝胶具有分子筛的作用，在电场的作用下，不同长度的DNA片段在凝胶中迁移速度不同，较短的片段迁移速度快，较长的片段迁移速度慢。在凝胶中加入核酸染料（如EB或SYBRGreen），DNA片段会在紫外光下发出荧光，通过凝胶成像系统观察并拍照记录条带的位置和亮度，条带的亮度与基因表达量相关，亮度越高，说明该基因在样本中的表达量相对越高，从而初步分析炎症相关基因的表达情况。实时定量RT-PCR技术则是在RT-PCR基础上，能够对基因表达进行精确定量分析的先进技术。其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比。在本实验中，采用SYBRGreen染料法，SYBRGreen能够与双链DNA特异性结合，当DNA扩增时，结合的SYBRGreen染料数量增加，荧光信号增强。反应体系除了包含RT-PCR所需的成分外，还加入了SYBRGreen染料。反应在荧光定量PCR仪中进行，仪器能够实时监测荧光信号的变化。通过标准曲线法对目的基因的表达量进行计算，首先制备一系列已知浓度的标准品，进行实时定量RT-PCR反应，得到不同浓度标准品的Ct值（Cyclethreshold，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数），以Ct值为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。对于未知样本，通过实时定量RT-PCR得到其Ct值，然后根据标准曲线计算出样本中目的基因的相对含量。采用比较CT值法，即ΔΔCt法，首先计算目的基因与内参基因（如β-actin）的Ct值之差（ΔCt），然后计算实验组与对照组的ΔCt之差（ΔΔCt），最后根据公式2-ΔΔCt计算出目的基因在实验组相对于对照组的表达倍数变化。这样可以准确评估不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠与野生型小鼠肝脏和主动脉中炎症相关基因的表达差异。在血脂检测方面，采用全自动生化分析仪对采集的小鼠血清样本进行检测。血清样本在检测前需在室温下解冻，并轻轻混匀，避免产生气泡。全自动生化分析仪利用特定的化学反应和光学检测原理，能够准确测定血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等指标。对于TC的检测，通常采用酶法，即胆固醇氧化酶将胆固醇氧化为胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与4-氨基安替比林和酚反应，生成红色醌亚胺染料，通过比色法测定其吸光度，根据标准曲线计算出血清中TC的含量。TG的检测同样采用酶法，甘油三酯脂肪酶将甘油三酯水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶的作用下磷酸化生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在磷酸甘油氧化酶的作用下氧化为磷酸二羟丙酮和过氧化氢，后续反应与TC检测类似，通过比色法测定吸光度并计算TG含量。LDL-C和HDL-C的检测则利用特殊的试剂和反应体系，通过选择性沉淀或表面活性剂作用，将LDL和HDL与其他脂蛋白分离，然后采用与TC检测类似的酶法测定其胆固醇含量。对于血清炎症因子的检测，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒。ELISA试剂盒的原理基于抗原抗体特异性结合的免疫反应。以检测TNF-α为例，首先将抗TNF-α抗体包被在酶标板的微孔表面，形成固相抗体。加入待检测的血清样本后，样本中的TNF-α会与固相抗体特异性结合。然后加入酶标记的抗TNF-α抗体，形成固相抗体-TNF-α-酶标抗体复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入酶底物，酶标抗体上的酶催化底物发生显色反应，产生有色产物。通过酶标仪测定吸光度，吸光度与样本中TNF-α的浓度成正比，根据标准曲线即可计算出血清中TNF-α的浓度。同样的方法用于检测IL-1、IL-6等其他炎症因子，通过准确测定血清中这些炎症因子的浓度，分析它们与炎症相关基因表达的关联。在肝脏和主动脉内膜病理形态观察方面，将采集的肝脏和主动脉组织进行固定、脱水、包埋等处理。固定采用4%多聚甲醛溶液，组织在固定液中浸泡24-48小时，以保持组织的形态和结构。脱水过程使用梯度酒精溶液，依次经过70%、80%、90%、95%和100%的酒精浸泡，每个梯度浸泡时间根据组织大小而定，一般为1-3小时，目的是去除组织中的水分。包埋使用石蜡，将脱水后的组织放入融化的石蜡中，经过浸蜡处理后，将组织包埋在石蜡块中，制成石蜡切片。切片厚度一般为4-6μm，通过切片机切成薄片。对切片进行苏木精-伊红（HE）染色，苏木精能够使细胞核染成蓝色，伊红使细胞质和细胞外基质染成红色。染色步骤包括脱蜡、水化、苏木精染色、水洗、分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明和封片。脱蜡使用二甲苯，将石蜡切片浸泡在二甲苯中10-15分钟，使石蜡溶解。水化则通过梯度酒精溶液从高浓度到低浓度依次浸泡切片，使组织重新吸收水分。苏木精染色时间一般为5-10分钟，染色后水洗去除多余的苏木精。分化使用1%盐酸酒精溶液，时间约为3-5秒，目的是去除细胞核中过多的苏木精，使染色更加清晰。返蓝使用自来水或弱碱性溶液，使细胞核重新变为蓝色。伊红染色时间为3-5分钟，染色后依次经过95%酒精、100%酒精脱水，再用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。通过HE染色，观察肝脏脂肪变性情况，如肝细胞内是否出现脂肪空泡，以及脂肪空泡的大小和数量；观察炎症细胞浸润情况，判断炎症细胞的类型（如巨噬细胞、淋巴细胞等）和浸润程度。对于主动脉内膜，观察脂质沉积情况，如是否有脂质条纹、粥样斑块形成，以及斑块的大小、形态和位置；观察内膜增厚程度、平滑肌细胞的增生情况等。采用油红O染色检测组织中的脂质，油红O是一种脂溶性染料，能够特异性地使脂质染成红色。染色前需将冰冻切片固定在4%多聚甲醛溶液中10-15分钟，然后用60%异丙醇溶液漂洗。将切片浸入油红O染液中染色10-15分钟，染色后用60%异丙醇溶液分化，去除多余的染料，直至背景清晰。最后用苏木精复染细胞核，水洗后用甘油明胶封片。通过油红O染色，能够更直观地观察主动脉内膜和肝脏组织中的脂质沉积情况，准确判断脂质在组织中的分布和含量。采用图像分析软件对病理切片进行定量分析，如Image-ProPlus软件，通过设定阈值、选择分析区域等操作，测量斑块面积、炎症细胞浸润程度等指标。对于斑块面积的测量，首先在软件中打开病理切片图像，选择合适的颜色通道（如红色通道用于油红O染色图像），通过调整阈值，使斑块区域与背景分离，然后利用软件的测量工具计算斑块面积，并与整个切片面积进行比较，得出斑块面积占比。对于炎症细胞浸润程度的分析，选择合适的染色图像（如HE染色图像），通过设定颜色阈值和形态学参数，识别炎症细胞，软件能够自动计算炎症细胞的数量、面积等参数，从而评估炎症细胞浸润程度。将这些病理变化与炎症相关基因的表达水平进行相关性分析，明确炎症相关基因表达在动脉粥样硬化病理进程中的作用。3.4数据处理与统计分析方法本研究选用GraphPadPrism8.0软件和SPSS25.0软件进行数据处理与统计分析。GraphPadPrism8.0软件在数据可视化方面功能强大，能够生成高质量、直观的图表，如柱状图、折线图、散点图等，便于直观展示数据的分布和变化趋势；SPSS25.0软件则具有全面且深入的统计分析功能，涵盖了多种统计方法，能满足本研究对数据深入分析的需求。对于实验中获得的多组数据，如不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠与野生型小鼠肝脏和主动脉中炎症相关基因的表达量、血脂指标以及血清炎症因子浓度等，首先进行正态性检验，使用Shapiro-Wilk检验方法判断数据是否符合正态分布。若数据符合正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较多组数据之间的差异。以不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏中TNF-α基因表达量为例，将14天龄、1月龄、2月龄和3月龄的ApoE/LDLR双基因缺失小鼠以及对应年龄段的野生型小鼠的TNF-α基因表达量数据输入SPSS25.0软件，选择单因素方差分析，软件会计算组间和组内的方差，得出F值和P值。若P值小于0.05，则认为不同组之间存在显著差异。当发现组间存在显著差异后，进一步使用Tukey's多重比较检验进行组间两两比较，以明确具体哪些组之间存在差异。若数据不符合正态分布或方差不齐，采用非参数检验，如Kruskal-Wallis秩和检验。例如，在检测小鼠血清中某炎症因子浓度时，若数据经检验不符合正态分布，将数据进行Kruskal-Wallis秩和检验，软件会对数据进行秩转换，计算H值和P值，判断多组数据之间是否存在差异，若存在差异，再使用Dunn's检验进行两两比较。在分析炎症相关基因表达水平与血脂、血清炎症因子之间的相关性时，采用Pearson相关分析或Spearman相关分析。当数据符合正态分布时，选用Pearson相关分析，计算相关系数r和P值。例如，分析ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏中IL-6基因表达量与血清中甘油三酯水平的相关性，将两组数据输入SPSS25.0软件，选择Pearson相关分析，若r值大于0且P值小于0.05，则表明两者呈正相关；若r值小于0且P值小于0.05，则表明两者呈负相关。当数据不符合正态分布时，采用Spearman相关分析，同样计算相关系数和P值，以确定变量之间的相关性。在组织病理学观察中，对于图像分析软件测量得到的斑块面积、炎症细胞浸润程度等指标数据，也按照上述正态性检验和统计分析方法进行处理。将不同组小鼠主动脉内膜斑块面积数据进行正态性检验，若符合正态分布，使用单因素方差分析比较不同组之间的差异，判断ApoE/LDLR双基因缺失小鼠与野生型小鼠在不同年龄段主动脉内膜斑块面积是否存在显著差异，从而分析炎症相关基因表达与病理形态改变之间的关系。通过严谨的数据处理与统计分析，确保本研究结果的准确性和可靠性，为深入探究ApoE/LDLR双基因缺失小鼠炎症相关基因的表达及其与动脉粥样硬化发病机制的关系提供有力的支持。四、实验结果与分析4.1血脂和血清炎症因子检测结果对不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠的血脂指标进行检测，结果如表1所示。从表中可以清晰地看出，在14天龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的总胆固醇（TC）水平就已显著高于野生型小鼠，达到了[X1]mmol/L，约为野生型小鼠的[X2]倍。甘油三酯（TG）水平为[X3]mmol/L，同样明显高于野生型小鼠。低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平在14天龄的ApoE/LDLR双基因缺失小鼠中高达[X4]mmol/L，与野生型小鼠相比差异极为显著。随着年龄的增长，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的各项血脂指标持续攀升。1月龄时，TC水平升高至[X5]mmol/L，2月龄时进一步上升到[X6]mmol/L，3月龄时达到了[X7]mmol/L。TG和LDL-C水平也呈现出类似的增长趋势。而野生型小鼠在不同年龄段的血脂指标相对稳定，波动较小。[此处插入表1：不同年龄段小鼠血脂指标检测结果，表头包含年龄、小鼠类型（ApoE/LDLR双基因缺失小鼠、野生型小鼠）、TC、TG、LDL-C、HDL-C等项目，表中对应填入各年龄段小鼠的检测数据]在血清炎症因子检测方面，结果如图1所示。14天龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠血清中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度为[X8]pg/mL，显著高于野生型小鼠的[X9]pg/mL。白细胞介素-1（IL-1）浓度为[X10]pg/mL，白细胞介素-6（IL-6）浓度为[X11]pg/mL，均明显高于野生型小鼠。随着年龄的增加，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠血清中的炎症因子水平持续升高。TNF-α浓度在1月龄时达到[X12]pg/mL，2月龄时升高到[X13]pg/mL，3月龄时进一步上升至[X14]pg/mL。IL-1和IL-6浓度也呈现出相似的上升趋势。野生型小鼠血清中的炎症因子水平在各年龄段相对较低，且变化不明显。[此处插入图1：不同年龄段小鼠血清炎症因子水平柱状图，横坐标为年龄（14天龄、1月龄、2月龄、3月龄），纵坐标为炎症因子浓度（pg/mL），不同颜色柱状分别代表ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠的TNF-α、IL-1、IL-6水平]综合血脂和血清炎症因子检测结果可以发现，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠从14天龄开始就表现出明显的血脂异常和炎症因子水平升高，且随着年龄的增长，这种异常和升高的趋势愈发明显。这表明ApoE和LDLR双基因缺失导致小鼠体内脂代谢紊乱，进而引发了炎症反应的激活和加剧。血脂异常与炎症因子水平升高之间可能存在密切的关联，脂代谢紊乱可能是诱发炎症反应的重要因素之一。随着炎症反应的持续发展，又可能进一步影响血脂代谢，形成恶性循环，共同促进动脉粥样硬化的发生和发展。4.2肝脏和主动脉中炎症相关基因的表达差异利用RT-PCR和实时定量RT-PCR技术，对不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠肝脏和主动脉中炎症相关基因的表达进行检测，结果如表2和图2所示。在肝脏组织中，14天龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏中的C反应蛋白（CRP）基因表达量显著高于野生型小鼠，其相对表达量达到了野生型小鼠的[X15]倍。1月龄时，CRP基因表达量虽仍高于野生型小鼠，但增长趋势有所减缓。随着年龄的进一步增长，CRP基因表达量逐渐下降，至3月龄时，与野生型小鼠的表达量差异已不显著。白细胞介素-1β（IL-1β）基因在14天龄的ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏中表达量显著升高，为野生型小鼠的[X16]倍。随后，其表达量随着年龄的增长持续上升，在3月龄时达到峰值，为野生型小鼠的[X17]倍。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因在1月龄的ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏中表达量显著高于野生型小鼠，是野生型小鼠的[X18]倍。之后，TNF-α基因表达量继续升高，在2月龄时达到峰值，为野生型小鼠的[X19]倍，随后略有下降，但在3月龄时仍显著高于野生型小鼠。[此处插入表2：不同年龄段小鼠肝脏和主动脉中炎症相关基因表达量，表头包含年龄、小鼠类型（ApoE/LDLR双基因缺失小鼠、野生型小鼠）、肝脏CRP、肝脏IL-1β、肝脏TNF-α、主动脉IL-1β、主动脉TLR2、主动脉MCP-1等项目，表中对应填入各年龄段小鼠的基因表达量数据]在主动脉组织中，1月龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠主动脉中的IL-1β基因表达量显著高于野生型小鼠，达到野生型小鼠的[X20]倍。TLR2基因表达量也明显升高，是野生型小鼠的[X21]倍。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因表达量同样显著高于野生型小鼠，为野生型小鼠的[X22]倍。随着年龄的增长，除了TLR2基因表达量在3月龄时降至与野生型小鼠相近水平外，IL-1β和MCP-1基因表达量持续升高。IL-1β基因在3月龄时表达量为野生型小鼠的[X23]倍，MCP-1基因在2月龄时达到峰值，为野生型小鼠的[X24]倍，3月龄时虽有所下降，但仍显著高于野生型小鼠。[此处插入图2：不同年龄段小鼠肝脏和主动脉中炎症相关基因表达量柱状图，横坐标为年龄（14天龄、1月龄、2月龄、3月龄），纵坐标为基因相对表达量，不同颜色柱状分别代表ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠在肝脏和主动脉中CRP、IL-1β、TNF-α、TLR2、MCP-1等基因的表达量]从上述结果可以看出，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏和主动脉中炎症相关基因的表达与野生型小鼠存在显著差异。在肝脏中，CRP基因表达先升高后降低，IL-1β和TNF-α基因表达则呈现持续升高的趋势。在主动脉中，IL-1β、TLR2和MCP-1基因在1月龄时就显著升高，且IL-1β和MCP-1基因表达随着年龄增长持续上升。这些炎症相关基因表达的变化与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。CRP作为一种急性时相反应蛋白，其基因表达的早期升高可能是对ApoE/LDLR双基因缺失导致的脂代谢紊乱的一种应激反应，随着机体的适应或其他调节机制的作用，其表达量逐渐下降。而IL-1β和TNF-α等炎症因子基因表达的持续升高，表明炎症反应在ApoE/LDLR双基因缺失小鼠体内不断加剧，可能通过激活炎症细胞、促进炎症因子的释放以及诱导细胞凋亡等多种途径，加速动脉粥样硬化的进程。在主动脉中，IL-1β、TLR2和MCP-1基因表达的显著升高，尤其是MCP-1作为一种重要的趋化因子，能够吸引单核细胞等炎症细胞向血管内膜下迁移，促进泡沫细胞的形成和炎症反应的扩大，从而在动脉粥样硬化的起始和发展阶段发挥重要作用。4.3肝脏和主动脉内膜的病理形态改变对不同年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠的肝脏和主动脉内膜进行病理形态学观察，结果如图3和图4所示。在14天龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏的肝细胞出现轻度脂肪变性，部分肝细胞内可见小的脂肪空泡。油红O染色显示肝脏组织中有少量脂质沉积，呈红色点状分布。此时，肝脏内炎症细胞浸润较少，主要为散在分布的巨噬细胞。随着年龄增长，1月龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏的脂肪变性进一步加重，肝细胞内脂肪空泡增多、增大，部分肝细胞呈现出大泡性脂肪变性。油红O染色可见肝脏组织中脂质沉积明显增加，脂质分布范围扩大。炎症细胞浸润也有所增加，除巨噬细胞外，还可见少量淋巴细胞浸润。2月龄时，肝脏脂肪变性更为显著，肝细胞排列紊乱，大量肝细胞被脂肪空泡占据，细胞核被挤压至细胞边缘。油红O染色显示肝脏组织中脂质沉积广泛，形成大片状的红色区域。炎症细胞浸润进一步加剧，炎症细胞聚集形成炎症灶。3月龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏出现了肝细胞坏死，坏死区域可见细胞核固缩、碎裂。炎症反应持续增强，炎症细胞弥漫性浸润整个肝脏组织。而野生型小鼠在各年龄段肝脏形态基本正常，肝细胞排列整齐，无明显脂肪变性和炎症细胞浸润，油红O染色显示肝脏组织中几乎无脂质沉积。[此处插入图3：不同年龄段小鼠肝脏病理切片图，包括HE染色和油红O染色，图片清晰展示各年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠肝脏的病理变化，如脂肪变性、炎症细胞浸润、脂质沉积等情况]在主动脉内膜方面，1月龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠主动脉内膜可见少量散在的脂质沉积，内膜轻度增厚。HE染色显示内膜下有少量泡沫细胞聚集。随着年龄增长，2月龄时，主动脉内膜脂质沉积增多，形成明显的脂质条纹，内膜增厚更为明显。泡沫细胞大量聚集，形成较大的泡沫细胞团。3月龄时，主动脉内膜出现典型的粥样斑块，斑块内含有大量脂质、泡沫细胞、炎症细胞以及细胞外基质。斑块表面的纤维帽变薄，部分区域出现破裂。而野生型小鼠主动脉内膜在各年龄段均光滑平整，无明显脂质沉积和内膜增厚现象，无泡沫细胞和粥样斑块形成。[此处插入图4：不同年龄段小鼠主动脉内膜病理切片图，包括HE染色和油红O染色，图片清晰展示各年龄段ApoE/LDLR双基因缺失小鼠和野生型小鼠主动脉内膜的病理变化，如脂质沉积、内膜增厚、泡沫细胞形成、粥样斑块形成等情况]综合肝脏和主动脉内膜的病理形态改变以及之前的血脂、血清炎症因子检测和炎症相关基因表达结果分析，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏和主动脉内膜的病理变化与血脂异常、炎症反应密切相关。ApoE和LDLR双基因缺失导致小鼠血脂代谢紊乱，血液中胆固醇和甘油三酯等脂质成分升高。这些过多的脂质在肝脏中沉积，引发肝脏脂肪变性，随着年龄增长，脂肪变性逐渐加重，进而导致肝细胞坏死。同时，脂质沉积还激活了肝脏内的炎症反应，炎症细胞浸润逐渐增多，炎症相关基因表达上调，如IL-1β、TNF-α等基因表达的升高，进一步加剧了肝脏的炎症损伤。在主动脉内膜，血脂异常使得脂质在血管内膜下沉积，形成脂质条纹和粥样斑块。炎症反应在这一过程中起到了重要的促进作用，炎症细胞的浸润和炎症因子的释放，如IL-1β、MCP-1等，吸引更多的炎症细胞聚集，促进泡沫细胞的形成和斑块的发展，导致主动脉内膜增厚、斑块不稳定，最终增加了动脉粥样硬化和心血管疾病的发病风险。4.4结果综合分析与讨论本研究通过对ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的血脂、血清炎症因子、肝脏和主动脉中炎症相关基因表达以及肝脏和主动脉内膜病理形态改变的检测与分析，深入探讨了ApoE和LDLR双基因缺失对小鼠的影响及其与动脉粥样硬化发生发展的关系。从血脂检测结果来看，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠从14天龄起就表现出显著的血脂异常，TC、TG和LDL-C水平明显高于野生型小鼠，且随着年龄增长，血脂异常愈发严重。这是因为ApoE和LDLR双基因缺失导致ApoE及其主要受体途径受阻，使得脂蛋白的代谢和清除功能严重受损。脂蛋白无法正常被代谢和清除，大量积聚在血液中，从而导致血脂水平升高。这种血脂异常为动脉粥样硬化的发生提供了物质基础，过多的脂质容易在血管壁沉积，引发后续的病理变化。血清炎症因子检测结果显示，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠血清中的TNF-α、IL-1和IL-6等炎症因子水平在14天龄时就显著高于野生型小鼠，并随年龄增长持续升高。这表明ApoE/LDLR双基因缺失引发的脂代谢紊乱激活了炎症反应。血脂异常导致血管内皮细胞受损，内皮细胞功能障碍使其表达粘附分子，吸引炎症细胞如单核细胞和T淋巴细胞粘附并迁移到血管内膜下。这些炎症细胞被激活后，分泌大量的炎症因子，从而导致血清炎症因子水平升高。炎症因子的持续升高又会进一步加剧炎症反应，促进动脉粥样硬化的发展。在炎症相关基因表达方面，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏和主动脉中多个炎症相关基因的表达与野生型小鼠存在显著差异。在肝脏中，CRP基因表达先升高后降低，可能是机体对脂代谢紊乱的早期应激反应，随着其他调节机制的启动，其表达量逐渐下降。而IL-1β和TNF-α基因表达持续升高，表明肝脏内的炎症反应不断加剧。在主动脉中，IL-1β、TLR2和MCP-1基因表达显著升高，且IL-1β和MCP-1基因表达随年龄增长持续上升。这些基因的表达变化与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。IL-1β和TNF-α等炎症因子基因的高表达，可激活炎症细胞，促进炎症因子的释放，诱导细胞凋亡等，加速动脉粥样硬化进程。MCP-1作为趋化因子，能吸引单核细胞等炎症细胞向血管内膜下迁移，促进泡沫细胞形成和炎症反应扩大。肝脏和主动脉内膜的病理形态改变进一步证实了ApoE/LDLR双基因缺失小鼠存在严重的病理变化。肝脏从14天龄的轻度脂肪变性逐渐发展到3月龄的肝细胞坏死和炎症细胞弥漫性浸润，主动脉内膜从1月龄的少量脂质沉积和内膜轻度增厚发展到3月龄的典型粥样斑块形成，且斑块不稳定。这些病理变化与血脂异常、炎症反应以及炎症相关基因表达的变化密切相关。血脂异常导致脂质在肝脏和主动脉内膜沉积，引发脂肪变性和动脉粥样硬化病变。炎症反应在这一过程中起到了促进作用，炎症细胞浸润和炎症因子释放加剧了肝脏和主动脉内膜的损伤。综上所述，ApoE/LDLR双基因缺失导致小鼠脂代谢紊乱，进而引发炎症反应，炎症相关基因表达发生改变，最终导致肝脏和主动脉内膜出现病理变化，促进动脉粥样硬化的发生发展。脂代谢紊乱、炎症反应和炎症相关基因表达之间相互作用、相互影响，形成一个复杂的病理网络。深入了解这一过程，对于揭示动脉粥样硬化的发病机制具有重要意义，也为动脉粥样硬化的防治提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。后续研究可进一步探讨这些炎症相关基因之间的相互作用机制，以及针对这些关键基因或信号通路的干预措施对动脉粥样硬化的防治效果。五、研究结论与展望5.1研究主要结论本研究通过对ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的深入研究，全面揭示了炎症相关基因在动脉粥样硬化发生发展过程中的表达规律及其与血脂、血清炎症因子以及病理形态改变之间的关系，得出以下主要结论：血脂和血清炎症因子变化显著：ApoE/LDLR双基因缺失小鼠自14天龄起，血脂水平即出现显著异常，总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平大幅高于野生型小鼠，且随年龄增长持续攀升。同时，血清中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子水平在14天龄时也显著高于野生型小鼠，并呈随年龄增长而持续升高的趋势。这表明ApoE和LDLR双基因缺失导致小鼠脂代谢紊乱，进而引发炎症反应的激活和加剧，血脂异常与炎症因子水平升高之间存在密切关联，可能形成恶性循环，共同促进动脉粥样硬化的发生发展。炎症相关基因表达差异明显：在肝脏组织中，C反应蛋白（CRP）基因在14天龄和1月龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的表达量显著高于野生型小鼠，但随后逐渐降至野生型水平；白细胞介素-1β（IL-1β）基因在14天龄时表达量显著升高，并随年龄增长持续上升，3月龄时达到峰值；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因在1月龄时表达量显著高于野生型小鼠，2月龄时达到峰值，随后略有下降，但3月龄时仍显著高于野生型小鼠。在主动脉组织中，IL-1β、Toll样受体2（TLR2）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因在1月龄时，ApoE/LDLR双基因缺失小鼠的表达量显著高于野生型小鼠，除TLR2基因表达量在3月龄时降至与野生型小鼠相近水平外，IL-1β和MCP-1基因表达量持续升高。这些炎症相关基因表达的变化与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，不同基因在不同组织和年龄段呈现出独特的表达模式，反映了炎症反应在动脉粥样硬化进程中的动态变化。肝脏和主动脉内膜病理变化显著：ApoE/LDLR双基因缺失小鼠肝脏从14天龄的轻度脂肪变性，逐渐发展为3月龄的肝细胞坏死和炎症细胞弥漫性浸润；主动脉内膜从1月龄的少量脂质沉积和内膜轻度增厚，发展为3月龄的典型粥样斑块形成，且斑块不稳定。这些病理变化与血脂异常、炎症反应以及炎症相关基因表达的变化密切相关。血脂异常导致脂质在肝脏和主动脉内膜沉积，引发脂肪变性和动脉粥样硬化病变，炎症反应在这一过程中起到了促进作用，炎症细胞浸润和炎症因子释放加剧了肝脏和主动脉内膜的损伤。脂代谢紊乱与血管炎症损伤相互作用：综合上述结果，ApoE/LDLR双基因缺失导致小鼠脂代谢紊乱，进而引发炎症反应，炎症相关基因表达发生改变，最终导致肝脏和主动脉内膜出现病理变化，促进动脉粥样硬化的发生发展。脂代谢紊乱、炎症反应和炎症相关基因表达之间相互作用、相互影响，形成一个复杂的病理网络。5.2研究的创新点与贡献本研究在动脉粥样硬化炎症机制研究领域具有多方面的创新点，为该领域的发展做出了独特贡献。在研究方法上，本研究实现了多技术、多指标的综合运用。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时定量RT-PCR技术，精准检测不同年龄段ApoE/LDL