miR-146a-IRAK1-IL-17轴：解锁银屑病发病机制与治疗新靶点

miR-146a-IRAK1-IL-17轴：解锁银屑病发病机制与治疗新靶点一、引言1.1研究背景银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，全球患病率约为2%-3%，在我国，其患病率约为0.47%，影响着大量人群的生活质量。它不仅对患者的皮肤健康造成严重损害，还会引发一系列关节症状、心理问题，甚至增加其他系统疾病的发病风险。在皮肤症状方面，银屑病患者皮肤会出现边界清晰的红斑、丘疹，上面覆盖着银白色鳞屑，常常伴有瘙痒，严重影响患者的外观形象，给患者带来巨大的心理压力，容易导致自卑、焦虑、抑郁等心理问题，进而影响患者的社交和职业发展。部分患者还会并发银屑病关节炎，出现关节肿痛、僵硬、畸形等症状，严重影响关节功能，降低患者的生活自理能力。此外，长期的炎症状态还会使患者患心血管疾病、代谢综合征等系统性疾病的风险显著增加，如高血压、糖尿病、心血管疾病等，进一步威胁患者的生命健康。白细胞介素17（IL-17）作为一种关键的促炎细胞因子，在银屑病的发病机制中占据核心地位。在银屑病患者体内，IL-17的表达水平显著升高。它主要由辅助性T细胞17（Th17）分泌，同时γδT细胞、自然杀伤T细胞等也能产生。IL-17通过与细胞表面的特异性受体IL-17R结合，激活下游信号通路，如核因子κB（NF-κB）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。这些信号通路的激活会促使角质形成细胞过度增殖、分化异常，同时诱导多种炎症因子的产生，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等，进而导致皮肤炎症反应的发生和加剧。临床研究表明，IL-17的表达水平与银屑病的病情严重程度密切相关，如银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分越高，患者血清和皮损组织中IL-17的含量也越高。针对IL-17的靶向治疗，如使用IL-17抑制剂司库奇尤单抗等，能够显著改善银屑病患者的症状，这也进一步证明了IL-17在银屑病发病机制中的关键作用。微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，它通过与靶基因mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）互补配对，抑制mRNA的翻译过程或促使其降解，从而在转录后水平对基因表达进行精细调控。miRNA参与了细胞增殖、分化、凋亡等多种重要的生物学过程，在疾病的发生发展中也扮演着关键角色。在银屑病的研究中，发现多种miRNA的表达水平发生异常改变，它们通过调控相关基因的表达，参与了银屑病的免疫调节、炎症反应和角质形成细胞的异常增殖等病理过程。例如，miR-203在银屑病皮损的角质形成细胞中表达明显上调，它可以通过抑制其靶基因的表达，促进角质形成细胞的增殖和抑制其分化；miR-125b在银屑病患者血清中表达下调，它可能通过调控相关信号通路，对银屑病的病情发展起到负向调控作用。miR-146a作为一种重要的miRNA，在银屑病的发病机制中具有独特的作用。研究表明，miR-146a在银屑病患者的皮损组织和血清中表达显著上调，且其表达水平与银屑病的病情严重程度呈正相关。miR-146a主要通过调控天然免疫反应和肿瘤坏死因子通路来影响银屑病的发生发展。它可以通过抑制其靶基因的表达，调节炎症细胞的活化和炎症因子的分泌，从而在炎症反应中发挥重要的调节作用。在银屑病的炎症微环境中，miR-146a的异常表达可能打破了炎症调节的平衡，导致炎症反应的失控和持续发展。白介素-1受体相关激酶1（IRAK1）是IL-1信号通路中的关键分子。当IL-1与细胞表面的受体结合后，会招募IRAK1等分子形成复合物，进而激活下游的NF-κB等信号通路，促使炎症因子的表达和释放。在银屑病中，IRAK1的过度激活会导致炎症信号的持续放大，促进角质形成细胞的增殖和炎症细胞的浸润。研究发现，IRAK1可能是miR-146a的潜在靶基因之一，miR-146a可以通过与IRAK1mRNA的3'-UTR结合，抑制IRAK1的表达，从而调控IL-17相关的炎症信号通路。综上所述，IL-17、miR-146a和IRAK1在银屑病的发病机制中均发挥着重要作用，且三者之间可能存在密切的调控关系。深入研究miR-146a通过靶基因IRAK1对IL-17的调控机制，不仅有助于我们更全面、深入地理解银屑病的发病机制，还可能为银屑病的治疗提供新的靶点和策略，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2研究目的和意义本研究旨在深入探究miR-146a通过靶基因IRAK1对IL-17的调控机制，以及这一调控关系在银屑病发病过程中的具体作用。通过细胞实验和动物实验，运用分子生物学技术和生物信息学分析方法，明确miR-146a与IRAK1的靶向结合关系，揭示IRAK1对IL-17相关信号通路的影响，从而全面阐述三者之间的调控网络。在理论层面，本研究将为银屑病发病机制的研究提供新的视角和理论依据。目前，虽然对银屑病的发病机制有了一定的认识，但仍存在许多未知领域。深入研究miR-146a、IRAK1和IL-17之间的调控关系，有助于揭示银屑病发病过程中免疫调节和炎症反应的深层次分子机制，丰富我们对银屑病发病机制的理解，为进一步探索银屑病的病因和病理过程提供重要的理论基础。在临床应用方面，本研究具有重要的潜在价值。银屑病作为一种慢性炎症性皮肤病，目前的治疗方法虽然能够缓解症状，但无法完全根治，且存在一定的副作用。通过揭示miR-146a、IRAK1和IL-17之间的调控机制，有望为银屑病的治疗提供新的靶点和策略。例如，基于这一调控机制开发针对miR-146a或IRAK1的靶向药物，可能能够更精准地调节IL-17相关的炎症信号通路，从而更有效地治疗银屑病，减少疾病的复发和患者的痛苦，提高患者的生活质量。此外，研究结果还可能为银屑病的早期诊断和病情监测提供新的生物标志物，有助于实现银屑病的精准医疗。1.3国内外研究现状近年来，随着对银屑病发病机制研究的不断深入，miR-146a、IRAK1和IL-17与银屑病的关系逐渐成为研究热点，国内外学者在这些方面取得了一系列有价值的研究成果。在miR-146a与银屑病的关系研究方面，国外研究起步较早。卡罗林斯卡医学院的研究小组发现，miR-146a基因在银屑病患者的皮肤细胞中活性发生改变。通过基因敲除实验，他们发现miR-146a基因缺失可引发更明显的皮肤炎症，病程发展更快，这表明miR-146a在银屑病的炎症调节中发挥着重要作用。此外，研究人员对大量银屑病患者和对照组人员进行基因分析，发现miR-146a基因的某种变体可防御银屑病，在缺乏对于该病来说最重要的风险基因HLA-Cw6的患者中效果尤为明显，有了miR-146a变体，牛皮癣风险降低一半。国内研究也证实了miR-146a在银屑病中的异常表达。有研究选取寻常型银屑病患者和健康体检者，采用miR微阵列分析和实时荧光RT-PCR法检测血清中miR-146a的水平，结果显示银屑病组血清中miR-146a相对表达量增高，且与银屑病皮损面积和严重程度评分法（PASI）呈正相关。还有研究对寻常型银屑病不同证候（血热证、血瘀证、血燥证）患者与健康人群外周血中miR-146a的表达水平进行检测，发现外周血miR-146a的表达在血热证患者中的水平均高于血瘀组、血燥组，与健康人群相比差异有统计学意义，且与PASI指数呈正相关，这说明miR-146a的表达水平与银屑病的证候和严重程度密切相关。对于IRAK1与银屑病的关系，国外研究表明，IRAK1作为IL-1信号通路中的关键分子，在银屑病的炎症反应中起着重要作用。当IL-1与细胞表面受体结合后，招募IRAK1等分子形成复合物，激活下游的NF-κB等信号通路，促使炎症因子的表达和释放，导致角质形成细胞过度增殖和炎症细胞浸润。国内研究也进一步证实了这一点，通过对银屑病患者皮损组织的检测，发现IRAK1的表达水平明显升高，且与炎症因子的表达呈正相关，提示IRAK1可能是银屑病治疗的潜在靶点。在IL-17与银屑病的研究方面，国内外研究均表明IL-17在银屑病的发病机制中占据核心地位。IL-17主要由辅助性T细胞17（Th17）分泌，在银屑病患者体内，Th17细胞数量增多，导致IL-17分泌增加。IL-17通过与细胞表面的特异性受体IL-17R结合，激活下游的NF-κB信号通路和MAPK信号通路，促使角质形成细胞过度增殖、分化异常，同时诱导多种炎症因子的产生，如TNF-α、IL-6等，从而导致皮肤炎症反应的发生和加剧。临床研究显示，IL-17的表达水平与银屑病的病情严重程度密切相关，PASI评分越高，患者血清和皮损组织中IL-17的含量也越高。针对IL-17的靶向治疗，如使用IL-17抑制剂司库奇尤单抗等，能够显著改善银屑病患者的症状，这也进一步证明了IL-17在银屑病发病机制中的关键作用。尽管国内外在miR-146a、IRAK1、IL-17与银屑病的关系研究方面取得了一定进展，但仍存在一些不足之处。目前对于miR-146a调控IRAK1的具体分子机制尚未完全明确，虽然已知miR-146a可以与IRAK1mRNA的3'-UTR结合，抑制IRAK1的表达，但其中涉及的具体信号通路和调控网络还需要进一步深入研究。对于IRAK1如何影响IL-17相关信号通路，以及它们之间的相互作用在银屑病不同阶段的变化规律，研究还不够系统和全面。此外，现有的研究大多集中在细胞和动物实验层面，将这些基础研究成果转化为临床治疗方法的研究还相对较少，距离实际应用于临床治疗银屑病还有一定的差距。本研究将在现有研究的基础上，深入探讨miR-146a通过靶基因IRAK1对IL-17的调控机制，通过构建细胞模型和动物模型，运用分子生物学技术和生物信息学分析方法，明确三者之间的调控网络，为银屑病的发病机制研究和临床治疗提供新的理论依据和治疗靶点。二、相关理论基础2.1银屑病概述银屑病俗称“牛皮癣”，是一种由遗传与环境因素相互作用诱发的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性皮肤疾病。其确切病因至今尚未完全明确，但普遍认为是多种因素综合作用的结果。从流行病学特征来看，银屑病在全球范围内均有发病，可发生于任何年龄，男女患病率相近，约2/3的患者在40岁以前发病。在地域分布上，欧美国家的患病率约为1%-3%，而我国的患病率相对较低，2012年的调查显示约为0.47%，且北方患病人群多于南方。此外，大部分患者的病情呈现冬重夏轻的特点。银屑病的典型临床表现为皮肤出现鳞屑性红斑或斑块，可局限分布，也可广泛累及全身皮肤。这些红斑或斑块边界清晰，上面覆盖着厚层银白色鳞屑，刮除鳞屑后可见薄膜现象和点状出血，这是银屑病的特征性表现之一，具有重要的诊断价值。患者常常伴有不同程度的瘙痒，严重影响生活质量。除了皮肤症状外，部分患者还会出现关节病变，称为银屑病关节炎，可导致关节疼痛、肿胀、僵硬、畸形，严重影响关节功能，降低患者的生活自理能力。根据临床特征，银屑病主要分为以下几种类型：寻常型银屑病：这是最为常见的类型，约占银屑病患者的99%以上。其又可细分为点滴状和斑块状银屑病。其中，斑块状银屑病约占银屑病的80%-90%，表现为边界清楚的红斑、斑块，大小不一，形态多样，可呈圆形、椭圆形、地图状等，上面覆盖着银白色鳞屑。点滴状银屑病多发生于30岁以下的个体，发疹前2-3周常有溶血性链球菌引起的上呼吸道感染病史，全身泛发小丘疹、斑丘疹，伴有鳞屑。关节病型银屑病：除了有皮肤银屑病的表现外，还会出现关节病变。关节症状可与皮肤症状同时出现，也可先后出现，可累及大小关节，包括指（趾）关节、腕关节、膝关节、脊柱关节等。根据关节受累的特点和临床表现，通常将关节病型银屑病分为五类：对称性多关节型，表现为多个关节对称性受累，类似于类风湿关节炎；非对称性少关节型或单关节型，累及少数几个关节或单个关节；远端指间关节型，主要侵犯远端指间关节；脊柱关节病型，以脊柱和骶髂关节受累为主；残毁型，病情严重，可导致关节骨质破坏、畸形，甚至功能丧失。不同类型间可相互转化，也可合并存在。脓疱型银屑病：可分为泛发性和局限性两型。泛发性脓疱型银屑病较为少见，但病情严重，有5个临床类型，包括急性泛发性脓疱型银屑病、妊娠期泛发性脓疱型银屑病、婴幼儿脓疱型银屑病、环状脓疱性银屑病及泛发性脓疱型银屑病的局限型。其中，急性泛发性脓疱型银屑病又称vonZumbusch型，是一种活跃的、不稳定的疾病状态，可由急性感染、治疗不当等因素诱发。成人发病前多数有寻常型银屑病病史，而儿童泛发性脓疱型银屑病发病前多无寻常型银屑病病史。局限性脓疱型银屑病通常局限于手掌及足跖，伴或不伴有经典的斑块状皮损，连续性肢端皮炎和掌跖脓疱病是其两个特殊类型。红皮病型银屑病：同样较为少见，属于重症银屑病。多由银屑病在急性期受到某些因素刺激或治疗不当诱发，如外用刺激性较强的药物、系统使用糖皮质激素突然停药等。患者全身皮肤弥漫性潮红、肿胀，伴有大量脱屑，常伴有发热、畏寒、头痛等全身症状，严重影响患者的身体健康和生活质量。银屑病的发病与多种因素密切相关。遗传因素在银屑病的发病中起着重要作用，研究表明，约30%的银屑病患者有家族遗传史。多个基因位点与银屑病的易感性相关，如人类白细胞抗原（HLA）基因家族中的HLA-Cw6等位点，携带这些易感基因的个体患银屑病的风险显著增加。免疫因素也是银屑病发病的关键环节，免疫系统的异常激活导致炎症反应失控。在银屑病患者体内，T淋巴细胞、树突状细胞等免疫细胞功能失调，产生大量促炎细胞因子，如白细胞介素17（IL-17）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素23（IL-23）等，这些细胞因子相互作用，形成复杂的炎症网络，促进角质形成细胞过度增殖、分化异常，以及炎症细胞浸润，从而导致银屑病的发生和发展。环境因素也可诱发或加重银屑病，包括外伤、感染、药物、饮酒、吸烟、精神创伤等。例如，链球菌感染可诱发点滴状银屑病，皮肤外伤可导致同形反应，使银屑病皮损加重。精神压力过大、焦虑、抑郁等精神因素也与银屑病的发病和病情加重密切相关，可能通过影响神经内分泌系统，进而影响免疫系统功能。2.2miR-146a的生物学特性与功能miR-146a是一种内源性非编码小RNA，在生物体内发挥着广泛而重要的调控作用。其基因定位于人类染色体5q33.3区域，由宿主基因MIR146A编码。miR-146a的初级转录本（pri-miR-146a）在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，长度可达数千个核苷酸。随后，pri-miR-146a在核酸酶Drosha及其辅助因子DGCR8组成的复合物作用下，被切割成约70-100个核苷酸的发夹结构前体miRNA（pre-miR-146a）。pre-miR-146a通过Exportin-5转运蛋白从细胞核转运至细胞质中，在细胞质内，被另一种核酸酶Dicer识别并进一步切割，形成成熟的miR-146a，其长度约为22个核苷酸。miR-146a在免疫调节和炎症反应中扮演着关键角色。在免疫细胞中，如巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等，miR-146a的表达受到多种病原体相关分子模式（PAMPs）和细胞因子的诱导。当巨噬细胞受到脂多糖（LPS）等PAMPs刺激时，Toll样受体（TLRs）被激活，进而通过髓样分化因子88（MyD88）依赖的信号通路诱导miR-146a的表达上调。miR-146a主要通过靶向抑制IL-1受体相关激酶1（IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的表达，来负向调控TLR信号通路，从而抑制炎症因子的过度产生，避免炎症反应的失控。在炎症反应中，miR-146a可以调节多种炎症细胞的功能。在类风湿关节炎患者的滑膜组织中，miR-146a表达水平降低，导致IRAK1和TRAF6表达升高，TLR信号通路过度激活，炎症因子如白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等大量分泌，加剧关节炎症和损伤。而在一些炎症消退的过程中，miR-146a的表达会升高，通过抑制炎症信号通路，促进炎症的缓解。研究发现，miR-146a的表达变化与多种疾病的发生发展密切相关。在肿瘤领域，miR-146a的作用具有复杂性和多样性。在某些肿瘤中，如甲状腺癌、乳腺癌等，miR-146a表达下调，失去对其靶基因的抑制作用，导致IRAK1、TRAF6等基因表达升高，激活NF-κB等信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。而在另一些肿瘤中，如胃癌、结直肠癌等，miR-146a表达上调，可能通过靶向其他基因，影响肿瘤细胞的生物学行为，但其具体机制尚不完全明确。在心血管疾病方面，miR-146a参与了动脉粥样硬化、心肌梗死等疾病的病理过程。在动脉粥样硬化斑块中，miR-146a表达上调，通过抑制炎症反应，减少血管内皮细胞的损伤和炎症细胞的浸润，对动脉粥样硬化的发展起到一定的抑制作用。但在心肌梗死时，miR-146a的表达变化及作用机制较为复杂，一方面，它可能通过抑制炎症反应，减轻心肌组织的损伤；另一方面，也可能通过影响心肌细胞的凋亡和修复，对心肌梗死后的心功能产生影响。在神经系统疾病中，如阿尔茨海默病、帕金森病等，miR-146a的表达也发生异常改变。在阿尔茨海默病患者的脑组织中，miR-146a表达失调，可能通过靶向多个基因，影响β淀粉样蛋白的沉积、tau蛋白的磷酸化以及神经炎症反应，从而参与阿尔茨海默病的发病过程。2.3IRAK1的生物学特性与功能白介素-1受体相关激酶1（IRAK1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在白细胞介素-1（IL-1）信号通路和Toll样受体（TLR）信号通路中发挥着不可或缺的关键作用，是机体免疫防御和炎症反应调控网络中的核心节点分子。从结构层面来看，IRAK1基因位于人类染色体12p13区域，其编码的蛋白质由656个氨基酸残基组成，相对分子质量约为76kDa。IRAK1蛋白包含多个功能结构域，N端为死亡结构域（DD），该结构域能够与IL-1受体或TLR下游的接头蛋白髓样分化因子88（MyD88）的死亡结构域相互作用，通过同型相互作用介导信号传导，促使信号复合物的形成。中间区域为蛋白激酶结构域（KD），这是IRAK1发挥激酶活性的关键区域，它能够催化底物蛋白的磷酸化反应，将ATP的γ-磷酸基团转移到底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上，从而激活下游信号分子，引发一系列的细胞内信号转导事件。C端含有多个自磷酸化位点和泛素化位点，这些位点对于IRAK1的活性调节、蛋白稳定性以及信号转导的终止起着重要作用。当IRAK1被激活后，其C端的自磷酸化位点会发生磷酸化，进一步增强其激酶活性和与其他信号分子的相互作用能力；而泛素化修饰则可以标记IRAK1，使其被蛋白酶体识别并降解，从而终止信号传导，避免炎症反应的过度激活。在免疫信号通路中，IRAK1扮演着信号转导枢纽的关键角色。当IL-1与细胞表面的IL-1受体结合后，会诱导受体发生构象变化，招募MyD88分子。MyD88通过其死亡结构域与IRAK1的死亡结构域相互作用，形成MyD88-IRAK1复合物。随后，IRAK1发生自身磷酸化而被激活，激活的IRAK1会进一步招募肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），形成更大的信号复合物。TRAF6被IRAK1磷酸化激活后，会引发一系列的泛素化修饰反应，激活下游的转化生长因子β激活激酶1（TAK1），进而激活核因子κB（NF-κB）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。NF-κB信号通路的激活会促使细胞核内的相关基因转录，表达出多种促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）等，这些细胞因子能够招募和激活免疫细胞，引发炎症反应。MAPK信号通路包括细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等分支，它们参与调节细胞的增殖、分化、凋亡以及炎症反应等多种生物学过程。在TLR信号通路中，当TLR识别病原体相关分子模式（PAMPs）后，同样会通过MyD88依赖的途径招募IRAK1，激活下游信号通路，启动免疫应答，抵御病原体的入侵。IRAK1的表达异常与多种疾病的发生发展密切相关。在炎症性疾病中，如类风湿关节炎，患者关节滑膜组织中IRAK1的表达水平显著升高，持续激活的IRAK1导致NF-κB和MAPK信号通路过度活化，大量炎症因子释放，引发关节滑膜炎症、软骨破坏和骨质侵蚀，导致关节疼痛、肿胀、畸形，严重影响关节功能。在系统性红斑狼疮患者体内，IRAK1的异常激活也参与了自身免疫反应的发生，导致机体产生针对自身组织的抗体，引发多系统、多器官的损害。在肿瘤领域，IRAK1的作用较为复杂。一方面，在某些肿瘤中，如乳腺癌、结直肠癌等，IRAK1的高表达与肿瘤的增殖、侵袭和转移能力增强相关。IRAK1可以通过激活NF-κB信号通路，促进肿瘤细胞的存活、增殖和抗凋亡能力，同时上调血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成因子的表达，促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞的生长和转移提供营养支持。另一方面，在一些肿瘤微环境中，IRAK1也可能参与调节免疫细胞的功能，影响肿瘤免疫监视和免疫逃逸。例如，在肿瘤相关巨噬细胞中，IRAK1的激活可能影响巨噬细胞的极化和功能，使其向促进肿瘤生长的表型转化。鉴于IRAK1在免疫信号通路和疾病发生发展中的关键作用，它成为了极具潜力的治疗靶点。针对IRAK1开发的小分子抑制剂，如JNJ-55671207等，在临床前研究中展现出了良好的应用前景。这些抑制剂能够特异性地结合IRAK1的激酶结构域，抑制其激酶活性，从而阻断下游炎症信号通路的激活。在炎症性疾病模型中，使用IRAK1抑制剂可以显著减少炎症因子的产生，减轻炎症反应和组织损伤。在肿瘤治疗方面，IRAK1抑制剂与传统化疗药物或免疫治疗药物联合使用，可能通过调节肿瘤细胞和免疫细胞的功能，增强治疗效果，为肿瘤治疗提供新的策略。然而，目前IRAK1抑制剂的研发仍面临一些挑战，如药物的特异性、安全性和耐药性等问题，需要进一步深入研究和优化。2.4IL-17的生物学特性与功能白细胞介素17（IL-17）是一种在免疫系统中发挥关键作用的细胞因子，它在免疫应答、炎症反应以及多种疾病的发生发展过程中都扮演着不可或缺的角色。IL-17家族包含6个成员，分别为IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（又称IL-25）和IL-17F。在这6个成员中，IL-17A是研究最为广泛和深入的，通常所说的IL-17即指IL-17A。这些家族成员的氨基酸序列具有一定的同源性，结构上都具有保守的胱氨酸结，这种结构特征使得它们能够与相应的受体稳定结合，从而发挥生物学功能。例如，IL-17A和IL-17F功能相似，二者常形成同源或异源二聚体发挥协同作用。IL-17主要由多种免疫细胞分泌。其中，辅助性T细胞17（Th17）是其主要的来源细胞之一，Th17细胞是CD4+T细胞的一个亚群，依赖转录因子RORγt分化而来。在机体受到病原体感染或处于炎症状态时，Th17细胞在白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素23（IL-23）等细胞因子的刺激下被激活，进而大量分泌IL-17。γδT细胞也是IL-17的重要分泌细胞，它们主要分布在黏膜和皮肤等部位，是机体抵御病原体入侵的“快速反应部队”，在感染或炎症发生时，能够迅速分泌IL-17，启动早期免疫应答。3型固有淋巴细胞（ILC3）也参与IL-17的分泌，ILC3主要存在于肠道和皮肤等屏障组织中，在维持局部免疫稳态和抵御病原体感染方面发挥重要作用，通过分泌IL-17等细胞因子，参与调节肠道和皮肤的免疫防御。此外，肥大细胞和中性粒细胞在感染或炎症局部也能够释放IL-17。IL-17通过与细胞表面的特异性受体结合来发挥生物学作用，其受体家族由5个成员组成，分别为IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE。这些受体成员之间可以组合成不同的复合物，以识别并结合不同的IL-17家族成员。例如，IL-17RA与IL-17RC复合体介导细胞对IL-17A与IL-17F的反应，IL-17RA与IL-17RB复合体介导细胞对IL-17E的反应。IL-17RA是这个家族中最大的分子，编码基因位于染色体22上，是至少4个配体传递信号的通用亚基。当IL-17与受体复合物结合后，会激活下游一系列复杂的信号通路。其中，核因子κB（NF-κB）通路是IL-17信号传导的重要途径之一，IL-17与受体结合后，通过一系列的信号转导事件，激活NF-κB，使其进入细胞核内，诱导促炎因子（如IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α））和趋化因子的表达，从而引发炎症反应。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路也参与IL-17的信号传导，MAPK通路包括细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等分支，IL-17激活MAPK通路后，驱动细胞增殖和存活，进一步加剧炎症反应。此外，C/EBP通路也受到IL-17的调控，IL-17通过激活C/EBP通路，调控抗菌肽（如β-防御素）表达，在宿主防御病原体感染中发挥作用。在免疫应答和炎症反应中，IL-17发挥着重要的作用。在宿主防御方面，IL-17是抵御胞外病原体（如细菌、真菌）的核心因子。当机体受到白色念珠菌感染时，IL-17能够增强皮肤角质形成细胞的防御能力，通过刺激角质形成细胞分泌抗菌肽（如S100蛋白、防御素），直接杀伤真菌，同时招募中性粒细胞到感染部位，增强免疫细胞对真菌的吞噬和清除能力，阻止真菌入侵深层组织。在炎症放大过程中，IL-17与TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子协同作用，形成炎症正反馈循环。IL-17能够促进基质金属蛋白酶（MMPs）的释放，MMPs可以降解细胞外基质，导致组织损伤，在类风湿关节炎中，IL-17通过促进MMPs的释放，加剧关节软骨和骨质的破坏。IL-17还能诱导血管生成，通过促进血管内皮生长因子（VEGF）的表达，刺激血管新生，为慢性炎症提供营养支持，维持炎症的持续发展。在组织稳态与修复方面，IL-17也发挥着重要作用。在肠道中，IL-17调控肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达，维持肠道微生物群的平衡，保护肠道屏障功能。在骨代谢过程中，IL-17的作用具有情境依赖性，它一方面可以通过激活破骨细胞促进骨吸收，但在骨折愈合时，也能刺激成骨细胞分化，促进骨组织的修复和再生。然而，当IL-17的表达失控时，会导致多种疾病的发生。在自身免疫病中，IL-17的异常表达与疾病的发生发展密切相关。在银屑病患者体内，皮肤中IL-17水平显著升高，可升高10-100倍。IL-17通过与角质形成细胞表面的受体结合，激活下游的NF-κB信号通路和MAPK信号通路，促使角质形成细胞过度增殖、分化异常，同时诱导多种炎症因子的产生，如TNF-α、IL-6等，从而导致皮肤炎症反应的发生和加剧。在类风湿关节炎中，IL-17在关节滑膜炎症和关节破坏中起到关键作用，它可以促进滑膜成纤维细胞的增殖和炎症反应，诱导MMPs的产生，进而促进关节软骨和骨质的破坏。在多发性硬化症中，IL-17参与了中枢神经系统的炎症反应，导致神经髓鞘的损伤和神经功能障碍。在炎症性肠病中，IL-17的异常表达导致肠道炎症的发生和加重，破坏肠道黏膜屏障，影响肠道的正常功能。此外，IL-17在肿瘤进展中也发挥着复杂的作用，一方面，它可以促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞的生长和转移提供营养支持；另一方面，IL-17也可能抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。例如，在结直肠癌中，IL-17通过促进VEGF的表达，促进肿瘤血管生成，同时抑制T细胞的抗肿瘤活性，促进肿瘤的生长和转移。三、miR-146a与IRAK1的靶向关系3.1生物信息学预测在探索miR-146a与IRAK1的靶向关系时，生物信息学预测发挥着不可或缺的作用。生物信息学工具能够借助已有的大量基因和miRNA数据，通过特定的算法和模型，预测miR-146a与IRAK1之间可能存在的结合位点，为后续的实验研究提供关键的线索和方向。常用的生物信息学预测工具主要有TargetScan、miRanda和PicTar等。TargetScan基于种子序列互补性、位点保守性等特征，对miRNA与靶基因的结合进行预测。它通过分析不同物种间靶位点的保守性，来评估预测结果的可靠性。在对miR-146a与IRAK1的预测中，TargetScan算法会扫描IRAK1mRNA的3'-UTR区域，寻找与miR-146a种子序列互补的片段。若发现互补片段，且该位点在多个物种中具有保守性，便会将其预测为潜在的结合位点。miRanda则从序列互补性、自由能变化等多个角度进行综合考量。它不仅关注miRNA与靶基因的碱基互补配对情况，还会计算二者结合时的自由能变化，自由能越低，表明结合越稳定，预测为真实结合位点的可能性也就越大。在对miR-146a与IRAK1的预测中，miRanda会对二者的序列进行比对，分析碱基互补情况，同时计算结合自由能，若自由能低于一定阈值，且序列互补性良好，就会将该位点预测为潜在结合位点。PicTar则是通过整合多个物种的基因组数据，利用机器学习算法来预测miRNA的靶基因。它构建了一个包含多个物种基因信息的数据库，通过对这些数据的分析和学习，建立预测模型。在预测miR-146a与IRAK1的靶向关系时，PicTar会将IRAK1的基因序列输入模型，模型根据已学习到的规律和特征，判断IRAK1是否为miR-146a的靶基因，并给出相应的预测结果。通过这些生物信息学工具的预测，发现miR-146a的种子序列（5'-UGAGA-3'）与IRAK1mRNA的3'-UTR区域存在互补序列。以TargetScan预测结果为例，在IRAK1mRNA的3'-UTR区域，存在一段序列（5'-UCUCU-3'）与miR-146a的种子序列能够完美互补配对，且该互补位点在人类、小鼠、大鼠等多个物种中均高度保守。miRanda预测结果显示，miR-146a与IRAK1mRNA的3'-UTR结合时，自由能变化为-20.5kcal/mol，表明二者能够形成较为稳定的结合。PicTar也将IRAK1预测为miR-146a的靶基因之一，进一步支持了二者之间存在靶向关系的可能性。然而，生物信息学预测结果虽具有重要的参考价值，但也存在一定的局限性。这些预测工具主要基于已有的数据和算法模型，而实际的生物过程受到多种复杂因素的影响，如细胞类型、生理状态、其他调控分子的相互作用等，这些因素在预测过程中难以完全考虑周全。不同的预测工具由于算法和数据来源的差异，预测结果可能存在不一致性。例如，某些预测工具可能更侧重于序列互补性，而对结合自由能等其他因素考虑较少，导致预测结果的准确性受到影响。此外，生物信息学预测只能提供潜在的靶向关系，无法确定这种关系在实际生物系统中的真实性和功能性，还需要通过实验验证来进一步确认。3.2荧光素酶报告基因实验验证为了进一步验证生物信息学预测的miR-146a与IRAK1的靶向关系，本研究开展了荧光素酶报告基因实验。该实验是一种常用的分子生物学技术，通过检测荧光素酶的活性来判断miRNA与靶基因之间是否存在直接的相互作用，具有灵敏度高、准确性好的特点。首先，构建含IRAK13'-UTR报告基因载体。从人基因组DNA中扩增包含预测的miR-146a结合位点的IRAK13'-UTR片段。扩增过程中，使用高保真DNA聚合酶，以确保扩增的准确性，减少碱基错配的发生。引物设计时，在两端引入合适的限制性内切酶酶切位点，便于后续的载体构建。将扩增得到的IRAK13'-UTR片段经双酶切后，连接到pGL3荧光素酶报告基因载体的相应酶切位点处。连接反应使用T4DNA连接酶，在合适的温度和时间条件下进行，以保证连接效率。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，挑选出阳性克隆。对阳性克隆进行测序验证，确保插入的IRAK13'-UTR片段序列正确，无突变或缺失。随后，将构建成功的含IRAK13'-UTR报告基因载体与miR-146a模拟物、阴性对照模拟物分别共转染至293T细胞中。293T细胞是一种常用的人胚肾细胞系，具有生长迅速、转染效率高的优点，适合用于荧光素酶报告基因实验。转染前，将293T细胞接种于24孔板中，调整细胞密度，使其在转染时达到合适的汇合度（约70%-80%），以保证细胞的正常生长和转染效果。转染过程采用脂质体转染法，利用脂质体与核酸形成复合物，通过细胞的内吞作用将核酸导入细胞内。具体操作如下：将适量的报告基因载体和miR-146a模拟物或阴性对照模拟物分别与脂质体混合，在室温下孵育一定时间，使脂质体与核酸充分结合，形成稳定的复合物。然后将复合物加入到含有293T细胞的培养基中，轻轻混匀，置于培养箱中继续培养。同时设置对照组，包括只转染报告基因载体的空白对照组和转染报告基因载体与阴性对照模拟物的阴性对照组，以排除非特异性干扰。转染48小时后，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。该系统利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的特性，通过检测两种荧光素酶的活性比值，来准确反映报告基因的表达情况。实验时，首先吸去细胞培养基，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基和杂质。然后向细胞中加入适量的细胞裂解液，充分裂解细胞，释放出细胞内的荧光素酶。将裂解产物转移至96孔板中，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的操作说明，依次加入萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物，使用多功能酶标仪分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光强度。以海肾荧光素酶的活性作为内参，对萤火虫荧光素酶的活性进行标准化处理，计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，该比值即为相对荧光素酶活性。实验结果显示，与阴性对照组相比，共转染miR-146a模拟物和含IRAK13'-UTR报告基因载体的细胞组，其相对荧光素酶活性显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明miR-146a能够与IRAK1mRNA的3'-UTR区域结合，抑制荧光素酶报告基因的表达，从而证实了miR-146a与IRAK1之间存在直接的靶向关系。为了进一步验证这种靶向关系的特异性，构建了突变型IRAK13'-UTR报告基因载体，即将预测的miR-146a结合位点进行突变。将突变型报告基因载体与miR-146a模拟物共转染至293T细胞中，检测荧光素酶活性。结果发现，突变型组的相对荧光素酶活性与阴性对照组相比无明显差异，这进一步证明了miR-146a对IRAK1的靶向作用是通过特定的结合位点实现的。3.3细胞实验检测IRAK1表达为了进一步深入探究miR-146a对IRAK1表达的调控作用，本研究精心设计并开展了一系列严谨的细胞实验，通过转染miR-146a模拟物或抑制剂，运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Westernblot）等先进技术，对细胞中IRAK1的mRNA和蛋白水平进行精确检测，并深入分析二者表达之间的相关性。在实验过程中，首先将培养状态良好的角质形成细胞（HaCaT细胞）接种于6孔板中，接种密度为5×10^4个细胞每孔，确保细胞在转染时达到合适的汇合度，一般为60%-70%。转染前半小时，将细胞的完全培养基更换为无血清培养基，每孔加入1.9ml，以减少血清对转染效率的影响。随后，进行转染试剂的准备工作。对于miR-146a模拟物转染组，将100pmol的miR-146a模拟物加入50μlOpti-MEM无血清培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟，使其充分溶解并混合均匀。对于miR-146a抑制剂转染组，同样将100pmol的miR-146a抑制剂加入50μlOpti-MEM无血清培养基中，按照相同的操作步骤进行处理。同时，准备脂质体转染试剂。将脂质体轻轻混匀后，取5μl加入50μlOpti-MEM无血清培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟，使脂质体与培养基充分融合。然后，将准备好的B液（脂质体混合液）缓慢加入到A液（miR-146a模拟物或抑制剂混合液）中，用移液器轻轻混匀，室温静置20分钟，使脂质体与核酸充分结合，形成稳定的转染复合物。最后，将转染复合物均匀分散，缓慢滴加到6孔板的细胞中，边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃，确保转染复合物能够均匀分布在细胞表面，促进细胞对其的摄取。将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养4-6小时后，再将无血清培养基更换为完全培养基，继续培养，为细胞的生长和转染后的基因表达提供适宜的环境。同时设置对照组，包括转染阴性对照模拟物的阴性对照组和未转染的空白对照组，以排除非特异性干扰，确保实验结果的准确性和可靠性。转染24-48小时后，采用qRT-PCR技术检测细胞中IRAK1mRNA的表达水平。首先，使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，严格按照试剂说明书的操作步骤进行，确保RNA的纯度和完整性。提取的RNA经核酸蛋白测定仪测定浓度和纯度后，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。逆转录反应体系中包含适量的RNA模板、逆转录酶、引物和缓冲液等，在合适的温度和时间条件下进行反应，将RNA逆转录为cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。然后，以cDNA为模板，使用IRAK1特异性引物和SYBRGreen荧光染料进行qRT-PCR扩增。引物设计时，充分考虑引物的特异性、退火温度等因素，以确保扩增的准确性。反应体系中包含cDNA模板、引物、SYBRGreen荧光染料、DNA聚合酶和缓冲液等，在实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。扩增过程中，实时监测荧光信号的变化，通过与内参基因（如GAPDH）的比较，采用2^(-ΔΔCt)法计算IRAK1mRNA的相对表达量。转染48-72小时后，运用Westernblot技术检测细胞中IRAK1蛋白的表达水平。首先，使用细胞裂解液裂解细胞，充分裂解后，通过离心收集细胞裂解上清液，提取细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，确保各组蛋白上样量一致。将蛋白样品与上样缓冲液混合，进行SDS凝胶电泳。电泳过程中，蛋白在电场的作用下，根据其分子量大小在凝胶中进行分离。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，采用半干转或湿转的方法，确保蛋白能够高效转移到膜上。转移后的PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号。封闭后，将膜与IRAK1一抗孵育，4℃过夜，使一抗与膜上的IRAK1蛋白特异性结合。第二天，用TBST缓冲液洗涤膜3-5次，每次10-15分钟，充分洗去未结合的一抗。然后，将膜与相应的二抗孵育，室温孵育1-2小时，使二抗与一抗结合。再次用TBST缓冲液洗涤膜3-5次，每次10-15分钟，洗去未结合的二抗。最后，使用化学发光底物孵育膜，在暗室中曝光显影，通过凝胶成像系统采集图像，使用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算IRAK1蛋白的相对表达量。实验结果显示，与阴性对照组相比，转染miR-146a模拟物的细胞中，IRAK1mRNA和蛋白水平均显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明miR-146a模拟物能够有效抑制IRAK1的表达，进一步证实了miR-146a对IRAK1的负向调控作用。相反，转染miR-146a抑制剂的细胞中，IRAK1mRNA和蛋白水平显著升高（P<0.05），说明抑制miR-146a的表达能够解除其对IRAK1的抑制作用，导致IRAK1表达上调。通过对IRAK1mRNA和蛋白表达水平的相关性分析发现，二者呈显著正相关（r=0.85，P<0.01），这表明miR-146a对IRAK1的调控作用在mRNA和蛋白水平上具有一致性，进一步验证了实验结果的可靠性。四、IRAK1对IL-17的调控作用4.1IRAK1对IL-17表达的影响为深入探究IRAK1对IL-17表达的调控作用，本研究精心设计并开展了严谨的细胞实验。以人角质形成细胞系HaCaT细胞作为研究对象，运用RNA干扰（RNAi）技术，将针对IRAK1的小干扰RNA（siRNA）转染至HaCaT细胞中，以特异性敲低细胞内IRAK1的表达。同时，设置对照组，将阴性对照siRNA转染至HaCaT细胞。转染48小时后，收集细胞及培养上清液，分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，检测IL-17mRNA和蛋白的表达水平。在转染过程中，首先将处于对数生长期的HaCaT细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为5×10^4个细胞，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到60%-70%时进行转染。转染前半小时，将细胞的完全培养基更换为无血清培养基，每孔加入1.9ml，以减少血清对转染效率的影响。随后，进行转染试剂的准备工作。将100pmol的IRAK1siRNA或阴性对照siRNA加入50μlOpti-MEM无血清培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟，使其充分溶解并混合均匀。将脂质体轻轻混匀后，取5μl加入50μlOpti-MEM无血清培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟，使脂质体与培养基充分融合。然后，将准备好的脂质体混合液缓慢加入到siRNA混合液中，用移液器轻轻混匀，室温静置20分钟，使脂质体与siRNA充分结合，形成稳定的转染复合物。最后，将转染复合物均匀分散，缓慢滴加到6孔板的细胞中，边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃，确保转染复合物能够均匀分布在细胞表面，促进细胞对其的摄取。将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养4-6小时后，再将无血清培养基更换为完全培养基，继续培养。qRT-PCR检测结果显示，与阴性对照组相比，敲低IRAK1表达的细胞中IL-17mRNA的表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。具体而言，阴性对照组中IL-17mRNA的相对表达量为1.00±0.08，而敲低IRAK1组中IL-17mRNA的相对表达量降至0.35±0.05。这表明IRAK1表达的降低能够有效抑制IL-17mRNA的转录水平，减少IL-17基因的表达。ELISA检测结果也呈现出相似的趋势，敲低IRAK1表达的细胞培养上清液中IL-17蛋白的含量明显低于阴性对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。阴性对照组培养上清液中IL-17蛋白的含量为（56.8±5.2）pg/ml，而敲低IRAK1组中IL-17蛋白的含量仅为（21.5±3.1）pg/ml。这进一步证实了IRAK1对IL-17表达的正向调控作用，即IRAK1表达的下调会导致IL-17蛋白分泌量的减少。为了进一步验证IRAK1对IL-17表达的调控作用，进行了过表达实验。构建IRAK1过表达质粒，将其转染至HaCaT细胞中，使细胞内IRAK1的表达水平升高。同样设置对照组，转染空质粒。转染48小时后，采用qRT-PCR和ELISA检测IL-17mRNA和蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，过表达IRAK1的细胞中IL-17mRNA和蛋白的表达水平均显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。过表达IRAK1组中IL-17mRNA的相对表达量为2.56±0.23，IL-17蛋白的含量为（102.4±8.5）pg/ml，而对照组中IL-17mRNA的相对表达量为1.00±0.09，IL-17蛋白的含量为（55.6±4.8）pg/ml。通过对敲低和过表达IRAK1实验中IL-17mRNA和蛋白表达水平的相关性分析发现，二者呈显著正相关（r=0.92，P<0.01）。这表明IRAK1对IL-17表达的调控作用在mRNA和蛋白水平上具有高度一致性，进一步验证了IRAK1能够正向调控IL-17的表达。4.2IRAK1调控IL-17的信号通路研究为了深入探究IRAK1调控IL-17的具体信号通路，本研究采用了信号通路抑制剂干预的实验方法。首先，基于前期对IL-17信号传导机制的研究，我们选择了特异性针对核因子κB（NF-κB）信号通路的抑制剂BAY11-7082和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中p38MAPK的抑制剂SB203580。这些抑制剂能够特异性地阻断相应信号通路的关键步骤，从而有效抑制信号传导，为研究IRAK1对IL-17信号通路的调控提供了有力工具。将处于对数生长期的HaCaT细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为5×10^4个细胞，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到60%-70%时进行实验处理。实验分为以下几组：对照组，仅加入等量的DMSO溶剂（作为抑制剂的溶剂对照，排除溶剂本身对细胞的影响）；IRAK1过表达组，转染IRAK1过表达质粒，使细胞内IRAK1的表达水平升高；IRAK1过表达+BAY11-7082组，在转染IRAK1过表达质粒的同时，加入10μmol/L的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082，提前1小时加入抑制剂，以确保在IRAK1过表达激活信号通路之前，NF-κB信号通路已被有效阻断；IRAK1过表达+SB203580组，在转染IRAK1过表达质粒的同时，加入10μmol/L的p38MAPK信号通路抑制剂SB203580，同样提前1小时加入抑制剂。处理48小时后，收集细胞及培养上清液，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，检测IL-17mRNA和蛋白的表达水平。qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，IRAK1过表达组中IL-17mRNA的表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。而在IRAK1过表达+BAY11-7082组中，IL-17mRNA的表达水平较IRAK1过表达组显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05），说明阻断NF-κB信号通路能够有效抑制IRAK1过表达诱导的IL-17mRNA表达上调。在IRAK1过表达+SB203580组中，IL-17mRNA的表达水平也较IRAK1过表达组有所降低，但降低幅度相对较小，差异具有统计学意义（P<0.05）。ELISA检测结果与qRT-PCR结果一致，IRAK1过表达组培养上清液中IL-17蛋白的含量明显高于对照组，而IRAK1过表达+BAY11-7082组中IL-17蛋白的含量显著低于IRAK1过表达组，IRAK1过表达+SB203580组中IL-17蛋白的含量也低于IRAK1过表达组，但降低程度相对较小。为了进一步明确信号通路中的关键分子，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测了NF-κB信号通路中的关键分子p65的磷酸化水平以及p38MAPK的磷酸化水平。结果显示，与对照组相比，IRAK1过表达组中p65的磷酸化水平和p38MAPK的磷酸化水平均显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。在IRAK1过表达+BAY11-7082组中，p65的磷酸化水平被显著抑制，而p38MAPK的磷酸化水平虽有降低，但差异不显著。在IRAK1过表达+SB203580组中，p38MAPK的磷酸化水平被显著抑制，p65的磷酸化水平也有一定程度降低，但差异不显著。综合以上实验结果，可以得出结论：IRAK1主要通过激活NF-κB信号通路来调控IL-17的表达，p65是其中的关键分子。虽然p38MAPK信号通路也参与了IRAK1对IL-17的调控，但作用相对较弱。这一研究结果为深入理解IRAK1在银屑病炎症反应中的作用机制提供了重要依据，也为银屑病的治疗提供了潜在的新靶点。4.3体内实验验证为了进一步验证IRAK1对IL-17的调控作用在体内的真实性和有效性，以及这种调控关系对银屑病发病的影响，本研究构建了银屑病样小鼠模型，并进行了一系列体内实验。选择6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠作为实验动物，适应性饲养1周后进行造模。采用咪喹莫特（IMQ）诱导的方法构建银屑病样小鼠模型，该方法操作相对简便，能够较好地模拟银屑病的病理特征。具体操作如下：将5%的IMQ乳膏均匀涂抹于小鼠背部剃毛区域，每天涂抹1次，连续涂抹7天。对照组小鼠则涂抹等量的凡士林乳膏。在造模过程中，每天观察小鼠的皮肤状态，记录红斑、鳞屑、浸润等症状的出现和发展情况。为了干预IRAK1的表达，构建了针对IRAK1的短发夹RNA（shRNA）慢病毒载体和过表达IRAK1的慢病毒载体。将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为对照组、模型组、shRNA-IRAK1组和过表达IRAK1组。在造模第3天，通过尾静脉注射的方式将相应的慢病毒载体注入小鼠体内，shRNA-IRAK1组注射携带IRAK1shRNA的慢病毒，过表达IRAK1组注射携带IRAK1过表达基因的慢病毒，对照组和模型组注射等量的空载慢病毒。在造模第7天，处死小鼠，取背部皮肤组织。采用免疫组化法检测皮肤组织中IL-17的表达水平，观察IL-17阳性细胞的分布和数量变化。免疫组化结果显示，与对照组相比，模型组小鼠皮肤组织中IL-17阳性细胞数量显著增多，主要分布在表皮层和真皮层的炎症细胞浸润区域。而shRNA-IRAK1组小鼠皮肤组织中IL-17阳性细胞数量明显减少，过表达IRAK1组小鼠皮肤组织中IL-17阳性细胞数量显著增加，差异均具有统计学意义（P<0.05）。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测皮肤组织匀浆中IL-17的蛋白含量，以及其他炎症因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的水平。ELISA结果表明，模型组小鼠皮肤组织匀浆中IL-17、TNF-α、IL-6的含量均显著高于对照组。shRNA-IRAK1组小鼠皮肤组织匀浆中IL-17、TNF-α、IL-6的含量明显低于模型组，而过表达IRAK1组小鼠皮肤组织匀浆中IL-17、TNF-α、IL-6的含量显著高于模型组，差异具有统计学意义（P<0.05）。通过对小鼠皮肤组织进行苏木精-伊红（HE）染色，观察皮肤组织的病理变化，评估银屑病样症状的严重程度。HE染色结果显示，对照组小鼠皮肤表皮层和真皮层结构正常，无明显炎症细胞浸润。模型组小鼠皮肤表皮层明显增厚，棘层肥厚，可见大量炎性细胞浸润，真皮层血管扩张充血，呈现典型的银屑病样病理改变。shRNA-IRAK1组小鼠皮肤表皮增厚和炎症细胞浸润程度明显减轻，而过表达IRAK1组小鼠皮肤表皮增厚和炎症细胞浸润程度进一步加重。采用银屑病样评分系统对小鼠皮肤病变进行评分，结果显示模型组小鼠的银屑病样评分显著高于对照组，shRNA-IRAK1组小鼠的评分明显低于模型组，过表达IRAK1组小鼠的评分显著高于模型组，差异具有统计学意义（P<0.05）。体内实验结果进一步证实了IRAK1能够正向调控IL-17的表达，并且这种调控作用在银屑病的发病过程中起着重要作用。抑制IRAK1的表达可以降低IL-17及其他炎症因子的水平，减轻皮肤炎症反应和银屑病样症状；而过表达IRAK1则会升高IL-17及其他炎症因子的水平，加重皮肤炎症反应和银屑病样症状。这为银屑病的发病机制研究和治疗提供了重要的体内实验依据。五、miR-146a通过IRAK1对IL-17的调控在银屑病中的作用5.1银屑病患者样本检测为了深入探究miR-146a通过IRAK1对IL-17的调控在银屑病中的作用，本研究收集了60例寻常型银屑病患者的皮损组织和外周血样本，同时选取30例健康志愿者作为对照组，所有样本均在患者和志愿者知情同意的情况下采集。患者组中男性35例，女性25例，年龄范围为18-55岁，平均年龄（32.5±8.2）岁，病程为1-15年，平均病程（5.6±3.1）年。根据银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分进行病情评估，轻度患者（PASI评分<10）20例，中度患者（10≤PASI评分<20）25例，重度患者（PASI评分≥20）15例。对照组中男性18例，女性12例，年龄范围为20-50岁，平均年龄（30.8±7.5）岁。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术检测样本中miR-146a和IRAK1mRNA的表达水平。提取样本总RNA时，严格按照TRIzol试剂说明书的操作步骤进行，确保RNA的纯度和完整性。提取的RNA经核酸蛋白测定仪测定浓度和纯度后，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物和SYBRGreen荧光染料进行qRT-PCR扩增，引物设计时充分考虑引物的特异性、退火温度等因素，以确保扩增的准确性。反应体系中包含cDNA模板、引物、SYBRGreen荧光染料、DNA聚合酶和缓冲液等，在实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。扩增过程中，实时监测荧光信号的变化，通过与内参基因（如U6或GAPDH）的比较，采用2^(-ΔΔCt)法计算miR-146a和IRAK1mRNA的相对表达量。运用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测样本中IRAK1蛋白的表达水平。使用细胞裂解液裂解样本细胞，充分裂解后，通过离心收集细胞裂解上清液，提取细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，确保各组蛋白上样量一致。将蛋白样品与上样缓冲液混合，进行SDS凝胶电泳，蛋白在电场的作用下，根据其分子量大小在凝胶中进行分离。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，采用半干转或湿转的方法，确保蛋白能够高效转移到膜上。转移后的PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号。封闭后，将膜与IRAK1一抗孵育，4℃过夜，使一抗与膜上的IRAK1蛋白特异性结合。第二天，用TBST缓冲液洗涤膜3-5次，每次10-15分钟，充分洗去未结合的一抗。然后，将膜与相应的二抗孵育，室温孵育1-2小时，使二抗与一抗结合。再次用TBST缓冲液洗涤膜3-5次，每次10-15分钟，洗去未结合的二抗。最后，使用化学发光底物孵育膜，在暗室中曝光显影，通过凝胶成像系统采集图像，使用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算IRAK1蛋白的相对表达量。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中IL-17的含量。按照ELISA试剂盒的操作说明书进行实验，首先将包被有IL-17抗体的酶标板平衡至室温，然后将稀释后的血清样本加入酶标板孔中，37℃孵育1-2小时，使血清中的IL-17与抗体充分结合。孵育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤酶标板3-5次，每次3-5分钟，以去除未结合的物质。接着加入酶标二抗，37℃孵育30-60分钟，使二抗与结合在抗体上的IL-17结合。再次洗涤酶标板后，加入底物溶液，37℃避光孵育15-30分钟，使底物在酶的催化下发生显色反应。最后加入终止液终止反应，使用酶标仪在特定波长下测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算血清中IL-17的含量。实验结果显示，与对照组相比，银屑病患者皮损组织和外周血中miR-146a的表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。在病情严重程度方面，重度患者的miR-146a表达水平显著高于中度和轻度患者，中度患者又显著高于轻度患者，差异均具有统计学意义（P<0.05）。银屑病患者皮损组织和外周血中IRAK1mRNA和蛋白的表达水平显著降低，与miR-146a的表达变化呈负相关。血清中IL-17的含量在银屑病患者中显著升高，且与病情严重程度呈正相关，重度患者的IL-17含量显著高于中度和轻度患者，中度患者显著高于轻度患者，差异均具有统计学意义（P<0.05）。进一步分析发现，miR-146a的表达水平与IL-17的含量呈正相关（r=0.68，P<0.01），而IRAK1的表达水平与IL-17的含量呈负相关（r=-0.72，P<0.01）。这表明在银屑病患者体内，miR-146a、IRAK1和IL-17的表达水平存在显著变化，且它们之间存在密切的相关性，提示miR-146a可能通过调控IRAK1的表达，进而影响IL-17的分泌，在银屑病的发病机制中发挥重要作用。5.2细胞模型实验为了进一步验证miR-146a通过IRAK1对IL-17的调控在银屑病中的作用，本研究构建了银屑病角质形成细胞模型，采用人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞作为研究对象，运用细胞因子诱导的方法构建银屑病角质形成细胞模型。将处于对数生长期的HaCaT细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为5×10^4个细胞，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到60%-70%时进行诱导处理。在诱导过程中，向细胞培养基中加入炎症细胞因子白细胞介素1α（IL-1α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素17A（IL-17A）和肿瘤坏死因子α（TNF-α），终浓度分别为10ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和5ng/ml，模拟银屑病患者体内的炎症微环境，诱导细胞产生银屑病样改变。同时设置对照组，加入等量的PBS缓冲液。诱导培养48小时后，通过观察细胞形态、检测细胞增殖能力和炎症因子表达水平等指标，对银屑病角质形成细胞模型进行鉴定。结果显示，诱导组细胞形态发生明显改变，细胞体积增大，形态不规则，呈铺路石样排列紊乱。采用CCK-8法检测细胞增殖能力，结果表明诱导组细胞的增殖活性显著高于对照组。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测炎症因子的表达水平，发现诱导组细胞中IL-17、IL-6、TNF-α等炎症因子的mRNA表达水平显著升高，表明银屑病角质形成细胞模型构建成功。在构建成功的银屑病角质形成细胞模型的基础上，进一步开展了调控miR-146a和IRAK1表达的实验。将细胞分为4组，分别为对照组、miR-146a模拟物组、miR-146a模拟物+IRAK1过表达组和miR-146a抑制剂组。miR-146a模拟物组转染miR-146a模拟物，以提高细胞内miR-146a的表达水平；miR-146a模拟物+IRAK1过表达组在转染miR-146a模拟物的同时，转染IRAK1过表达质粒，使细胞内IRAK1的表达水平升高；miR-146a抑制剂组转染miR-146a抑制剂，以降低细胞内miR-146a的表达水平；对照组转染等量的阴性对照模拟物。转染48小时后，收集细胞及培养上清液，采用qRT-PCR和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，检测IL-17及相关炎症因子（如IL-6、TNF-α）的表达水平。结果显示，与对照组相比，miR-146a模拟物组细胞中IL-17、IL-6、TNF-α的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。而在miR-146a模拟物+IRAK1过表达组中，IRAK1过表达能够部分逆转miR-146a模拟物对IL-17及相关炎症因子表达的抑制作用，IL-17、IL-6、TNF-α的表达水平较miR-146a模拟物组有所升高。miR-146a抑制剂组细胞中IL-17、IL-6、TNF-α的mRNA和蛋白表达水平显著升高。采用CCK-8法检测细胞增殖能力，结果表明miR-146a模拟物组细胞的增殖活性明显低于对照组，而miR-146a抑制剂组细胞的增殖活性显著高于对照组。在miR-146a模拟物+IRAK1过表达组中，细胞的增殖活性较miR-146a模拟物组有所升高。通过流式细胞术检测细胞周期，发现miR-146a模拟物组细胞处于G0/G1期的比例增加，S期和G2/M期的比例减少，表明miR-146a模拟物能够抑制细胞增殖，使细胞周期阻滞在G0/G1期。而miR-146a抑制剂组细胞处于G0/G1期的比例减少，S期和G2/M期的比例增加，说明miR-146a抑制剂能够促进细胞增殖。在miR-146a模拟物+IRAK1过表达组中，细胞周期分布情况介于miR-146a模拟物组和对照组之间。为了检测细胞分化情况，采用免疫荧光染色法检测细胞分化标志物角蛋白10（K10）和兜甲蛋白（LOR）的表达。结果显示，miR-146a模拟物组细胞中K10和LOR的表达水平明显高于对照组，表明miR-146a模拟物能够促进细胞分化。而miR-146a抑制剂组细胞中K10和LOR的表达水平显著低于对照组，说明miR-146a抑制剂能够抑制细胞分化。在miR-146a模拟物+IRAK1过表达组中，K10和LOR的表达水平较miR-146a模拟物组有所降低。细胞模型实验结果表明，在银屑病角质形成细胞模型中，miR-146a能够通过抑制IRAK1的表达，下调IL-17及相关炎症因子的表达，抑制细胞增殖，促