RNA干扰技术靶向肾癌survivin基因的体外攻坚：机制、效能与前景剖析

RNA干扰技术靶向肾癌survivin基因的体外攻坚：机制、效能与前景剖析一、引言1.1研究背景与意义1.1.1肾癌的严峻现状肾癌，作为泌尿系统中常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。从全球范围来看，其发病率在泌尿系统肿瘤中位居前列，仅次于前列腺癌和膀胱癌，占肾脏恶性肿瘤的80％-90％。据统计，肾癌约占成人恶性肿瘤的2％-3％，且其发病率在多数国家和地区呈增长趋势。在地域分布上，肾癌具有明显的差异，北美、西欧等西方发达国家的发病率较高，而非洲、亚洲等发展中国家相对较低。在我国，各地区肾癌的发病率及死亡率也存在较大差异，城市地区高于农村地区。肾癌的发病年龄可见于各年龄段，但高发年龄为50-70岁，然而，随着生活节奏的加快，其发病逐渐呈现年轻化的趋势。目前，肾癌的发病原因尚未完全明确，但研究表明，其发病与遗传、吸烟、肥胖、高血压及抗高血压治疗等因素密切相关。其中，吸烟和肥胖是最为公认的危险因素。肾癌的病理类型多样，最常见的组织病理类型为透明细胞癌，约占60％-85％，其次为乳头状肾细胞癌、嫌色细胞癌、集合管癌等少见类型。在临床上，早期肾癌患者通常无明显症状，多数是在体检时偶然发现。而当患者出现血尿、腰痛和腹部包块等典型的“肾癌三联征”时，病情往往已进展到晚期，此时治疗难度大幅增加，患者的预后也较差。当前，肾癌的治疗手段主要包括手术治疗、靶向治疗、免疫治疗等。手术治疗是早期肾癌的主要治疗方法，但对于晚期肾癌，手术的效果往往不佳。靶向治疗和免疫治疗虽然在一定程度上改善了晚期肾癌患者的生存状况，但仍存在耐药、不良反应等问题，且治疗费用高昂，给患者和社会带来了沉重的负担。因此，开发新的治疗手段，提高肾癌的治疗效果，降低死亡率，成为了医学领域亟待解决的重要问题。1.1.2RNA干扰技术的潜力RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术是一种在真核生物中广泛存在的基因调控机制，通过双链RNA（dsRNA）介导的序列特异性基因沉默，实现对靶基因表达的调控。1998年，AndrewFire和CraigMello首次在线虫中发现了RNAi现象，他们将双链RNA注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默，这一发现为基因功能研究和疾病治疗开辟了新的道路。随后，RNAi现象在水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中被陆续发现。RNAi技术具有诸多独特的特点。其序列特异性强，能够根据靶基因的序列设计相应的双链RNA，精确地沉默特定的靶基因，而对其他基因的表达几乎没有影响。这一特性使得RNAi技术在针对特定致病基因的治疗中具有巨大的优势。RNAi技术具有高效性，在不影响非特异性干扰素途径的情况下，能够高效地抑制靶基因的表达，其效率明显高于传统的反义核酸技术。而且在降解mRNA的过程中，小干扰RNA（siRNA）作为特殊的引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，又被降解为新的siRNA重新进入循环，起到放大效应，进一步增强了对靶基因的抑制效果。此外，RNAi技术还具有作用快速的特点，能够在短时间内对靶基因的表达产生明显的影响。由于RNAi技术能够特异性地剔除或关闭特定基因的表达，因此在基因治疗领域展现出了广阔的应用前景。在癌症治疗方面，它可以通过沉默癌基因、增强抑癌基因的表达，或者抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移相关基因，来达到治疗癌症的目的。在病毒感染性疾病的治疗中，RNAi技术可以针对病毒的关键基因进行沉默，阻断病毒的复制和传播。RNAi技术还可用于遗传性疾病、代谢性疾病等多种疾病的治疗研究。将RNAi技术应用于肾癌治疗的研究，有望为肾癌患者带来新的治疗希望，成为攻克肾癌难题的有力武器。1.1.3survivin基因作为靶点的独特性Survivin基因是1997年发现的凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisproteins，IAPs）家族的一个新成员，具有独特的生物学特性。人类survivin基因位于染色体17q25，长度范围在75-130kb，含3个内含子和4个外显子。它特异地表达于人和鼠的胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞，而在正常成人组织中，仅在胸腺、睾丸和分泌期子宫内膜等少数组织中有表达。Survivin在肿瘤的发生发展过程中发挥着至关重要的作用。它是至今发现的作用最强的凋亡抑制蛋白之一，其主要作用机制是通过与caspase3和caspase7结合，抑制这两种酶的活性，从而阻断细胞的凋亡过程，使得肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监视，持续增殖。Survivin还参与了细胞周期的调控，在细胞分裂过程中发挥重要作用，促进肿瘤细胞的增殖。有研究表明，Survivin与肿瘤血管生成密切相关，它可以通过调节血管内皮生长因子等血管生成相关因子的表达，促进肿瘤血管的形成，为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气，支持肿瘤的生长和转移。在肾癌中，Survivin呈现高表达的特性。多项研究通过免疫组织化学、RT-PCR等技术检测发现，Survivin蛋白和mRNA在肾癌组织中的表达水平显著高于正常肾组织。有研究报道，Survivin蛋白在肾癌组织中的阳性表达率可达92.31%，而在正常组织中未见表达。Survivin的表达与肾癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移等恶性生物学特性密切相关。肾癌的分化程度越低、病理分级越高、临床分期越晚、出现淋巴结转移时，Survivin的阳性表达率越高。这表明Survivin在肾癌的发生、发展和转移过程中起到了关键作用，可作为评估肾癌恶性程度和预后的重要指标。正是由于Survivin在肾癌中的高表达及其与肾癌恶性生物学行为的紧密联系，使其成为肾癌治疗的理想靶点。通过抑制Survivin基因的表达，可以阻断其凋亡抑制、细胞周期调控和血管生成等促进肿瘤发展的作用，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，从而为肾癌的治疗提供新的策略。1.2国内外研究现状1.2.1RNA干扰技术的研究进展RNA干扰（RNAi）技术的发展历程充满了突破性的发现，为生命科学研究带来了革命性的变革。1995年，康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues在研究秀丽新小杆线虫时，尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达，意外发现正义链RNA也能阻断基因表达，这与传统反义RNA技术的认知相悖，为后续的研究埋下了伏笔。1998年，华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello将双链dsRNA注入线虫，诱发了比单独注射正义链或反义链都要强得多的基因沉默现象，并将其命名为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi），这一发现正式开启了RNAi技术的研究大门。此后，RNAi技术在不同生物模型中的应用研究取得了丰硕的成果。在植物领域，RNAi技术被广泛应用于抵御病毒入侵和研究基因功能。比如，利用RNAi技术可以使植物对特定病毒产生抗性，通过降解病毒的RNA来阻止病毒的复制和传播。在果蝇中，RNAi技术能够达到基因敲除的效果，为研究基因在发育和生理过程中的功能提供了有力工具。科学家们通过RNAi技术沉默果蝇中的特定基因，观察其对果蝇生长、发育和行为的影响，深入了解了基因的功能和调控机制。在哺乳动物细胞中，RNAi技术也展现出巨大的潜力。研究人员利用RNAi技术沉默特定基因，探索其在细胞增殖、分化、凋亡等过程中的作用，为疾病机制的研究提供了新的视角。在癌症研究中，通过RNAi技术抑制癌基因的表达，观察肿瘤细胞的生长、侵袭和转移能力的变化，有助于揭示癌症的发病机制和寻找新的治疗靶点。尽管RNAi技术取得了显著的进展，但在应用过程中仍面临诸多挑战。其中，脱靶效应是一个关键问题，即RNAi不仅会沉默靶基因，还可能对其他非靶基因的表达产生影响，导致意想不到的生物学效应。这可能是由于siRNA与非靶mRNA之间存在部分互补序列，从而引发了对非靶基因的沉默。RNAi的递送效率也是一个难点，如何将RNAi分子高效地递送到靶细胞内，并使其在细胞内发挥作用，是实现RNAi技术临床应用的关键。目前的递送方法包括病毒载体、脂质体、纳米颗粒等，但每种方法都存在一定的局限性，如病毒载体可能引发免疫反应，脂质体的稳定性和靶向性有待提高。1.2.2survivin基因与肾癌相关性研究Survivin基因与肾癌的相关性研究一直是肿瘤领域的热点。众多研究表明，Survivin在肾癌组织中呈现高表达状态。朱李兵等人通过免疫组织化学方法检测53例肾透明细胞癌组织及8例正常肾组织中Survivin蛋白表达，发现62.3%（33例）肾透明细胞癌组织表达Survivin蛋白，而正常肾组织无1例阳性表达。焉杰克等人采用免疫组化SABC法测定52例肾细胞癌组织和10例正常肾组织中Survivin蛋白的表达，结果显示Survivin蛋白在肾癌组织中阳性率为92.31%（48/52），正常组织中未见表达。Survivin基因的表达与肾癌的临床病理特征密切相关。胡华平等应用免疫组织化学SP法检测60例肾癌组织和20例癌旁正常肾组织中Survivin的表达水平，发现Survivin在肾癌组织中的表达与病理分级、临床分期、淋巴结转移均显著相关。在肾癌病理分级越高、临床分期越晚、有淋巴结转移的情况下，Survivin的表达水平越高，提示Survivin可能参与了肾癌的恶性进展过程。在预后方面，Survivin基因的高表达往往预示着肾癌患者的不良预后。有研究对肾癌患者进行长期随访，分析Survivin表达与患者生存时间的关系，发现Survivin高表达组患者的总生存率和无病生存率明显低于低表达组。这表明Survivin不仅在肾癌的发生发展中起重要作用，还可作为评估肾癌患者预后的重要指标。1.2.3RNA干扰技术靶向survivin基因治疗肾癌的研究现状目前，RNA干扰技术靶向survivin基因治疗肾癌的研究主要集中在通过设计特异性的siRNA或shRNA，沉默Survivin基因的表达，进而探究其对肾癌生物学行为的影响。在体外实验中，已有多项研究成功利用RNAi技术降低了肾癌肿瘤细胞系中Survivin基因的表达水平。有研究将针对Survivin基因的siRNA转染到肾癌786-0细胞中，结果显示SurvivinmRNA和蛋白的表达水平显著降低，同时细胞的增殖能力受到抑制，凋亡率明显增加。这表明RNAi技术能够有效地抑制肾癌肿瘤细胞中Survivin基因的表达，从而影响肿瘤细胞的增殖和凋亡过程。在体内实验方面，部分研究通过构建肾癌动物模型，将靶向Survivin的RNAi载体导入动物体内，观察肿瘤的生长情况。有研究将携带shRNA的慢病毒载体注射到肾癌裸鼠模型中，发现肾癌肿瘤的生长明显受到抑制，肿瘤体积和重量显著减小。这些研究结果初步表明，RNA干扰技术靶向Survivin基因在抑制肾癌肿瘤生长方面具有一定的效果。然而，现有研究仍存在一些不足之处。在siRNA或shRNA的设计和筛选方面，目前还缺乏统一的标准和有效的方法，导致不同研究中使用的RNAi序列的干扰效率和特异性存在差异。RNAi载体的选择和优化也是一个关键问题，如何选择安全、高效、靶向性强的载体，以提高RNAi在体内的递送效率和稳定性，仍然需要进一步探索。此外，RNAi技术在临床应用中的安全性和有效性还需要更多的临床试验来验证，如何解决RNAi治疗可能带来的脱靶效应、免疫反应等问题，也是未来研究的重点方向。1.3研究目的与创新点1.3.1研究目的本研究旨在通过体外实验，深入探究RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的作用机制及效果。具体而言，将设计并合成针对survivin基因的特异性siRNA，通过脂质体转染等方法导入肾癌肿瘤细胞系中，观察survivin基因和蛋白表达水平的变化，明确RNA干扰技术对survivin表达的抑制效果。通过MTT法、细胞凋亡检测等实验，分析survivin表达抑制后对肾癌肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的影响，揭示其在肾癌治疗中的潜在作用机制。本研究期望为肾癌的治疗提供新的理论依据和治疗策略，为临床应用奠定基础。1.3.2创新点在实验设计方面，本研究采用多靶点siRNA策略，针对survivin基因的不同区域设计多条siRNA，筛选出干扰效率最高的组合，以提高对survivin基因表达的抑制效果，减少脱靶效应的发生。这种多靶点的设计能够更全面地抑制survivin基因的表达，克服单一靶点可能存在的局限性。在技术应用上，本研究将纳米材料作为RNAi的递送载体。纳米材料具有独特的物理化学性质，如粒径小、比表面积大、易于修饰等，能够有效地保护siRNA免受核酸酶的降解，提高其稳定性，还能增强siRNA的细胞摄取效率，实现对肾癌肿瘤细胞的靶向递送。与传统的脂质体等载体相比，纳米材料载体在提高RNAi递送效率和靶向性方面具有更大的优势。从研究角度来看，本研究不仅关注RNA干扰技术对肾癌肿瘤细胞生物学行为的影响，还从分子信号通路的角度深入探究其作用机制。通过蛋白质印迹法（Westernblot）等技术检测与细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关的信号通路蛋白的表达变化，全面揭示RNA干扰技术抑制survivin表达后对肾癌肿瘤细胞的调控网络，为深入理解肾癌的发病机制和治疗靶点提供新的视角。二、RNA干扰技术与survivin基因概述2.1RNA干扰技术的原理与作用机制2.1.1RNA干扰的发现与定义RNA干扰现象的发现源于一系列对基因表达调控的深入研究，为生命科学领域带来了全新的认知。1990年，科学家CarolynNapoli和VanderKrol在研究转基因植物时，向紫色喇叭花中导入查耳酮合成酶基因片段，本期望花朵颜色更深，结果却得到白色喇叭花，经研究发现是外源基因抑制了植物内源基因表达，这一意外发现为后续RNA干扰的研究埋下了伏笔。1995年，Guo和Kemphues在研究秀丽新小杆线虫时，尝试用反义RNA阻断par-1基因表达，却发现正义链RNA同样能阻断基因表达，这一违背传统反义RNA技术认知的现象引发了科学家们的深入探索。1998年，AndrewFire和CraigMello的研究取得了重大突破。他们将双链RNA（dsRNA）注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默现象，他们将这种由双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象正式命名为RNA干扰（RNAinterference，RNAi）。这一发现揭示了一种全新的基因调控机制，迅速引起了科学界的广泛关注，为基因功能研究和疾病治疗开辟了新的道路。随后，RNAi现象在水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中被陆续发现，表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且高度保守的生物学过程。RNA干扰，从定义上来说，是指在真核生物中，由双链RNA（dsRNA）介导的、通过特异性降解与dsRNA序列相应的信使核糖核酸（mRNA），从而阻断相应基因表达的现象。这一过程使得细胞能够精确地调控基因的表达水平，对生物体的生长、发育、免疫防御等生理过程发挥着关键作用。在植物中，RNAi可帮助植物抵御病毒入侵，通过降解病毒的RNA来阻止病毒的复制和传播。在动物体内，RNAi参与了细胞的分化、增殖和凋亡等重要过程，对维持机体的正常生理功能至关重要。2.1.2RNA干扰的作用机制详解RNA干扰的作用机制是一个复杂而精细的过程，主要包括起始步骤、效应步骤和倍增步骤，各步骤相互协作，实现对靶基因表达的高效抑制。在起始步骤中，外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入细胞的双链核糖核酸（dsRNA），会在细胞内特异性地与RNA酶Ⅲ（RNAaseⅢ核酸内切酶）Dicer结合。Dicer酶具有独特的结构，包含两个催化结构域、一个解旋酶结构域和一个PAZ结构域。在这些结构域的协同作用下，Dicer酶将dsRNA切割成21-23nt长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，这些短链dsRNA被称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA具有特定的结构特征，其互补双链的3'端均有一个2-3nt的单链突出，这种结构对于后续的RNAi过程至关重要。进入效应步骤，双链siRNA会与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合，形成RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。RISC是一个多蛋白复合物，其中Ago蛋白是核心组分。在ATP供能的情况下，RISC被激活，将siRNA的双链分开。Ago蛋白负责催化siRNA其中一条链（引导链）去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。具体过程为，反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默。在倍增步骤中，siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶。Dicer酶将新产生的dsRNA再次切割成siRNA，这些新的siRNA可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。如此反复倍增，使得少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果。以病毒感染细胞为例，当细胞受到病毒入侵时，病毒的dsRNA会触发RNAi机制。在起始阶段，Dicer酶将病毒dsRNA切割成siRNA；在效应阶段，siRNA与RISC结合，识别并降解病毒的mRNA，阻断病毒蛋白的合成；在倍增阶段，通过RdRP的作用，产生更多的siRNA，进一步增强对病毒的防御，有效抑制病毒的复制和传播。2.1.3RNA干扰技术在基因治疗中的优势与挑战RNA干扰技术在基因治疗领域展现出诸多显著优势，为攻克各类疾病带来了新的希望。其序列特异性强，能够根据靶基因的特定序列设计相应的双链RNA，精确地识别并沉默特定的靶基因，而对其他无关基因的表达几乎没有影响。这一特性使得RNAi技术在针对由特定基因突变或异常表达引起的疾病治疗中具有独特的优势。在癌症治疗中，可以针对癌基因设计特异性的siRNA，精准地抑制癌基因的表达，而不影响正常细胞的功能。RNA干扰技术具有高效性，能够在不影响非特异性干扰素途径的情况下，高效地抑制靶基因的表达。在降解mRNA的过程中，siRNA作为特殊的引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，又被降解为新的siRNA重新进入循环，起到放大效应，进一步增强了对靶基因的抑制效果。这使得RNAi技术在治疗一些需要快速降低靶基因表达水平的疾病时具有明显的优势。RNA干扰技术还具有作用快速的特点，能够在短时间内对靶基因的表达产生明显的影响。与传统的基因治疗方法相比，RNAi技术可以更快地发挥治疗作用，为患者争取更多的治疗时间。在病毒感染性疾病的治疗中，RNAi技术可以迅速针对病毒的关键基因进行沉默，阻断病毒的复制和传播，减轻患者的症状。尽管RNA干扰技术具有众多优势，但在临床应用中也面临着一系列挑战。脱靶效应是一个关键问题，即RNAi不仅会沉默靶基因，还可能对其他非靶基因的表达产生影响，导致意想不到的生物学效应。这可能是由于siRNA与非靶mRNA之间存在部分互补序列，从而引发了对非靶基因的沉默。脱靶效应可能会导致不良反应的发生，影响治疗的安全性和有效性。为了减少脱靶效应，研究人员需要更加精确地设计siRNA序列，提高其特异性，还可以通过生物信息学方法对潜在的脱靶位点进行预测和评估。RNAi的递送效率也是一个难点，如何将RNAi分子高效地递送到靶细胞内，并使其在细胞内发挥作用，是实现RNAi技术临床应用的关键。目前的递送方法包括病毒载体、脂质体、纳米颗粒等，但每种方法都存在一定的局限性。病毒载体虽然递送效率较高，但可能引发免疫反应，存在安全隐患。脂质体的稳定性和靶向性有待提高，在体内运输过程中容易受到多种因素的影响，导致siRNA的释放和细胞摄取效率降低。纳米颗粒虽然具有一些独特的优势，但在制备工艺、体内分布和代谢等方面还需要进一步优化。2.2survivin基因的结构、功能与表达调控2.2.1survivin基因的结构特点Survivin基因于1997年被Altieri等利用效应细胞蛋白酶受体-1（EPR-1）cDNA筛选克隆而出，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成员。人类survivin基因位于染色体17q25区域，其长度范围在75-130kb。该基因结构较为独特，包含4个外显子和3个内含子。Survivin基因编码产生的Survivin蛋白由142个氨基酸组成，分子量约为16.2kDa，是IAP家族中最小的成员。从蛋白质结构域角度分析，Survivin蛋白具有杆状病毒IAP重复结构（BaculovirusIAPRepeat，BIR），这是IAP家族发挥抗凋亡作用所必需的结构域。与其他IAP家族成员不同，Survivin仅含有一个BIR结构域，并且在C末端存在一个α螺旋结构。这种结构上的差异使得Survivin具有独特的生物学功能。BIR结构域对于Survivin的抗凋亡功能起着关键作用，它能够与细胞凋亡相关的蛋白相互作用，从而抑制细胞凋亡的发生。而C末端的α螺旋结构则在Survivin与纺锤体微管的结合过程中发挥重要作用，主要参与调节Survivin基因在细胞周期中的定位分布。研究发现，若α螺旋结构处发生突变，Survivin将丧失与微管结合的能力，进而无法发挥其抗凋亡作用。Survivin蛋白在空间结构上呈二聚体化排列，这种二聚体结构是Survivin发挥抗凋亡作用所必需的。Survivin蛋白单体结合形成对称的二聚体，由于Survivin蛋白单体和对称二聚体在稳定性及抗凋亡功能上存在差异，二聚体连接处成为干扰Survivin蛋白功能的潜在靶位之一。这种独特的二聚体结构有助于Survivin与其他相关蛋白相互作用，进一步调控细胞的凋亡和增殖过程。2.2.2survivin基因的生物学功能Survivin基因在细胞生命活动中发挥着多方面的重要生物学功能，对细胞的存活、增殖和肿瘤的发展具有深远影响。在抑制细胞凋亡方面，Survivin是目前发现的作用最强的凋亡抑制蛋白之一。其主要作用机制是通过与caspase家族中的caspase3和caspase7结合，抑制这两种酶的活性。Caspase3和caspase7在细胞凋亡过程中扮演着关键的执行角色，它们被激活后会引发一系列级联反应，导致细胞凋亡的发生。Survivin与它们结合后，能够阻断细胞凋亡的信号传导通路，从而使细胞逃避凋亡，维持细胞的存活。在肿瘤细胞中，Survivin的高表达使得肿瘤细胞能够抵抗机体的免疫监视和各种凋亡诱导因素，持续增殖并形成肿瘤。Survivin基因在调节细胞周期中也起着关键作用。研究表明，Survivin主要在细胞周期的G2/M期表达，是细胞周期G2/M期的调节基因。这是因为Survivin基因启动子序列中存在3个细胞周期依赖因子（CellCycleDependentElements，CDE）和一个细胞周期同源性区域（CellCycleHomologyRegions，CHR）。CDE和CHR是G1期抑制元件，它们共同调节G2/M期基因表达的半衰期，使得Survivin特异地在G2/M期高表达。在细胞分裂过程中，Survivin与纺锤体微管结合，参与有丝分裂的调控，确保染色体的正确分离和细胞的正常分裂。若Survivin的表达或功能受到抑制，细胞周期将出现紊乱，可能导致细胞增殖异常或凋亡。Survivin还参与了肿瘤血管生成过程。肿瘤的生长和转移依赖于充足的血液供应，而血管生成是肿瘤获取营养和氧气的关键途径。Survivin可以通过调节血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成相关因子的表达，促进肿瘤血管的形成。研究发现，Survivin能够与VEGF的启动子区域结合，增强VEGF的转录活性，从而促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。Survivin还可以通过调节其他信号通路，如PI3K/Akt信号通路，间接影响肿瘤血管生成。肿瘤组织中Survivin的高表达往往伴随着丰富的血管生成，这为肿瘤细胞的生长和转移提供了有利条件。2.2.3survivin基因在肿瘤中的异常表达及调控机制在肾癌等多种肿瘤中，Survivin基因呈现高表达状态，这种异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。从肾癌的临床研究来看，大量的实验数据表明Survivin在肾癌组织中的表达水平显著高于正常肾组织。朱李兵等人通过免疫组织化学方法检测53例肾透明细胞癌组织及8例正常肾组织中Survivin蛋白表达，发现62.3%（33例）肾透明细胞癌组织表达Survivin蛋白，而正常肾组织无1例阳性表达。焉杰克等人采用免疫组化SABC法测定52例肾细胞癌组织和10例正常肾组织中Survivin蛋白的表达，结果显示Survivin蛋白在肾癌组织中阳性率为92.31%（48/52），正常组织中未见表达。Survivin的表达与肾癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移等恶性生物学特性密切相关。随着肾癌病理分级的升高、临床分期的进展以及出现淋巴结转移，Survivin的表达水平也随之升高。这表明Survivin在肾癌的恶性进展过程中起到了重要的推动作用。Survivin基因在肿瘤中的异常表达受到多种调控机制的影响，包括转录水平、翻译水平及表观遗传水平。在转录水平上，Survivin基因的启动子区域包含多个顺式作用元件，如E2F、AP-1、NF-κB等转录因子的结合位点。这些转录因子可以与Survivin基因启动子结合，调节其转录活性。在肿瘤细胞中，由于信号通路的异常激活，E2F、AP-1、NF-κB等转录因子的表达或活性发生改变，从而增强了Survivin基因的转录。当细胞受到生长因子、炎症因子等刺激时，NF-κB信号通路被激活，活化的NF-κB蛋白进入细胞核，与Survivin基因启动子上的相应位点结合，促进Survivin基因的转录，导致Survivin表达上调。在翻译水平上，微小RNA（miRNA）对Survivin的表达调控发挥着重要作用。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，它们可以通过与靶mRNA的互补配对，抑制mRNA的翻译过程或促进其降解。研究发现，一些miRNA，如miR-16、miR-34a等，能够与SurvivinmRNA的3'非翻译区（3'UTR）结合，抑制Survivin的翻译。在正常细胞中，这些miRNA的表达水平相对较高，能够有效地抑制Survivin的表达。而在肿瘤细胞中，这些miRNA的表达往往下调，导致对Survivin翻译的抑制作用减弱，从而使Survivin蛋白表达升高。表观遗传水平的调控也是Survivin基因异常表达的重要机制。DNA甲基化和组蛋白修饰是表观遗传调控的主要方式。在正常细胞中，Survivin基因启动子区域的CpG岛处于高甲基化状态，这种甲基化修饰会抑制基因的转录。而在肿瘤细胞中，Survivin基因启动子区域的甲基化水平降低，导致基因转录活性增强，Survivin表达上调。组蛋白修饰也会影响Survivin基因的表达。组蛋白的乙酰化修饰通常与基因的激活相关，而去乙酰化修饰则与基因的抑制相关。在肿瘤细胞中，组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶的活性失衡，导致Survivin基因所在区域的组蛋白乙酰化水平升高，从而促进Survivin基因的表达。2.3RNA干扰技术靶向survivin基因的理论基础2.3.1互补碱基配对原则在RNA干扰中的应用RNA干扰技术能够实现对survivin基因的特异性抑制，其核心原理基于核酸分子之间的互补碱基配对原则。在RNA干扰过程中，小干扰RNA（siRNA）起着关键作用。siRNA是一种长度为21-23个核苷酸的双链RNA分子，其两条链分别被称为正义链和反义链。其中，反义链的核苷酸序列与survivin基因转录产生的信使核糖核酸（mRNA）的特定区域具有高度的互补性。当细胞内导入针对survivin基因的siRNA后，siRNA会与细胞内的RNA诱导沉默复合体（RISC）结合。在RISC的作用下，siRNA的双链结构被解开，反义链得以暴露。由于反义链与survivinmRNA的互补序列之间存在碱基互补配对关系，反义链能够通过A（腺嘌呤）与U（尿嘧啶）、G（鸟嘌呤）与C（胞嘧啶）的碱基配对方式，精确地识别并结合到survivinmRNA上。这种特异性的结合是RNA干扰技术实现对survivin基因靶向作用的基础。一旦siRNA的反义链与survivinmRNA结合形成RNA-RNA双链结构，RISC中的核酸内切酶活性就会被激活。核酸内切酶会在距离siRNA3'端12个碱基的位置对survivinmRNA进行切割，将其降解为小片段。由于mRNA是蛋白质合成的模板，survivinmRNA的降解使得细胞无法翻译产生Survivin蛋白，从而实现了对survivin基因表达的抑制。这种基于互补碱基配对原则的作用方式，使得RNA干扰技术能够高度特异性地针对survivin基因进行调控，而对其他无关基因的表达几乎没有影响。以肾癌肿瘤细胞为例，通过设计针对survivin基因的特异性siRNA，能够精准地识别并结合肿瘤细胞中survivinmRNA，有效抑制Survivin蛋白的表达，从而阻断其对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞的凋亡。2.3.2靶向survivin基因对肿瘤细胞生物学行为的影响预测从抑制肿瘤细胞增殖角度来看，survivin基因在细胞周期调控中发挥着重要作用。研究表明，survivin主要在细胞周期的G2/M期表达，通过与纺锤体微管结合，参与有丝分裂的调控，确保染色体的正确分离和细胞的正常分裂。当通过RNA干扰技术抑制survivin基因表达后，细胞周期将出现紊乱。由于survivin表达缺失，纺锤体微管的正常功能受到影响，导致染色体分离异常，细胞无法顺利完成有丝分裂。细胞可能会停滞在G2/M期，无法进入下一个细胞周期，从而抑制肿瘤细胞的增殖。相关研究表明，在多种肿瘤细胞系中，沉默survivin基因后，细胞的增殖能力明显下降，细胞周期分布发生改变，G2/M期细胞比例显著增加。在诱导凋亡方面，survivin是一种强效的凋亡抑制蛋白。它通过与caspase3和caspase7结合，抑制这两种凋亡执行酶的活性，从而阻断细胞凋亡的信号传导通路。当survivin基因表达被RNA干扰技术抑制后，caspase3和caspase7的活性得以恢复。激活的caspase3和caspase7会引发一系列级联反应，切割细胞内的多种关键蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，导致细胞凋亡相关事件的发生，如细胞核固缩、DNA断裂等，最终诱导肿瘤细胞凋亡。在乳腺癌细胞的研究中发现，利用RNAi技术降低survivin表达后，细胞凋亡率明显升高，这表明靶向survivin基因能够有效诱导肿瘤细胞凋亡。从抑制迁移侵袭角度分析，survivin不仅参与细胞凋亡和细胞周期调控，还与肿瘤细胞的迁移和侵袭能力密切相关。survivin可以通过调节一些与细胞迁移和侵袭相关的分子，如基质金属蛋白酶（MMPs）、上皮-间质转化（EMT）相关蛋白等，来影响肿瘤细胞的迁移和侵袭行为。当survivin基因表达被抑制后，MMPs的表达和活性可能会降低，从而减少细胞外基质的降解，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。survivin表达的下调还可能影响EMT过程，使肿瘤细胞维持上皮细胞的特性，降低其侵袭能力。有研究表明，在肺癌细胞中，沉默survivin基因后，细胞的迁移和侵袭能力显著减弱，MMP-2和MMP-9等基质金属蛋白酶的表达水平明显降低。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞株与实验动物本实验选用人肾透明细胞癌细胞株786-O，其购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。786-O细胞源自一位原发性肾透明细胞癌患者，具有上皮样细胞形态，在体外培养时呈贴壁生长特性。该细胞株在软琼脂中能够成簇生长，还可悬浮生长，且能生成一种与乳癌和肺癌中的肽相似的PTH样多肽，其N端与PTH相似，活性与PTH相似，分子量为6000道尔顿。在实验前，将786-O细胞置于含10%优质胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%CO₂的培养箱中进行常规培养，当细胞生长至对数生长期时用于后续实验。本实验若无动物实验部分，则无需介绍实验动物。若有动物实验，以裸鼠为例，选用BALB/c裸鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。裸鼠品系为BALB/cnu/nu，4-6周龄，体重18-22g。裸鼠饲养于SPF级动物房，温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-60%，采用12h光照、12h黑暗的昼夜节律。动物房保持清洁卫生，定期进行消毒，裸鼠自由摄食和饮水，饲料和饮水均经过高压灭菌处理。在实验前，裸鼠适应性饲养1周，以确保其生理状态稳定。3.1.2主要试剂与耗材针对survivin基因设计并合成的小干扰RNA（siRNA），由上海吉玛基因科技有限公司合成。其序列经过严格的生物信息学分析和筛选，以确保对survivin基因具有高度的特异性和高效的干扰效果。siRNA干粉保存于-20℃冰箱，使用前用RNase-free水溶解至所需浓度。转染试剂选用脂质体Lipofectamine2000，购自Invitrogen公司。该转染试剂能够高效地将siRNA等核酸分子导入细胞内，其工作原理是利用脂质体与细胞膜的融合特性，将携带的核酸分子传递到细胞内部。脂质体Lipofectamine2000需保存于4℃冰箱，使用时按照说明书进行操作。RT-PCR相关试剂包括RNA提取试剂盒（TRIzol试剂，Invitrogen公司）、逆转录试剂盒（TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，宝生物工程（大连）有限公司）、PCR扩增试剂盒（TaKaRaTaq，宝生物工程（大连）有限公司）等。TRIzol试剂能够有效地裂解细胞，提取细胞内的总RNA；逆转录试剂盒可将RNA逆转录为cDNA，以便后续的PCR扩增；PCR扩增试剂盒提供了PCR反应所需的各种酶和缓冲液。这些试剂均需按照各自的保存条件妥善保存，使用时严格遵守操作规程。Westernblot相关试剂有RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、一抗（兔抗人survivin多克隆抗体，CellSignalingTechnology公司）、二抗（HRP标记的羊抗兔IgG，CellSignalingTechnology公司）、ECL化学发光试剂盒（ThermoFisherScientific公司）等。RIPA裂解液用于裂解细胞，提取细胞总蛋白；BCA蛋白浓度测定试剂盒用于测定蛋白样品的浓度；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒用于制备聚丙烯酰胺凝胶，以便对蛋白进行分离；一抗和二抗用于特异性地识别和结合目的蛋白；ECL化学发光试剂盒用于检测结合了二抗的目的蛋白，通过化学发光反应产生信号，从而实现对蛋白表达水平的检测。其他主要试剂还包括MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，Sigma公司），用于细胞增殖活性检测；DMSO（二甲基亚砜，Sigma公司），用于溶解MTT形成的甲瓒结晶；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（BDBiosciences公司），用于检测细胞凋亡情况；Transwell小室（Corning公司），用于细胞迁移和侵袭实验；Matrigel基质胶（BDBiosciences公司），用于细胞侵袭实验，铺在Transwell小室的上室，模拟细胞外基质。主要耗材包括细胞培养瓶、培养皿、96孔板、6孔板（Corning公司），用于细胞的培养和接种；移液枪头、离心管（Eppendorf公司），用于试剂的移取和样品的离心处理；0.22μm滤膜（Millipore公司），用于过滤除菌，保证试剂的无菌状态。3.1.3仪器设备PCR仪（型号为AppliedBiosystems7500Fast，ThermoFisherScientific公司），用于进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增目的基因。其工作原理是通过控制温度的循环变化，实现DNA的变性、退火和延伸过程，从而扩增特定的DNA片段。在实验中，可根据不同的实验需求，精确设置PCR反应的温度、时间和循环次数。凝胶成像系统（型号为Bio-RadGelDocXR+，Bio-Rad公司），用于对PCR扩增产物和蛋白电泳后的凝胶进行成像分析。它能够通过紫外光或蓝光激发，使凝胶中的核酸或蛋白条带发出荧光，然后利用高分辨率的相机拍摄图像，并通过配套的软件对条带的亮度、面积等参数进行分析，从而定量检测目的基因或蛋白的表达水平。离心机（型号为Eppendorf5424R，Eppendorf公司），主要用于细胞和蛋白样品的离心处理。在细胞实验中，可通过离心收集细胞，去除上清液；在蛋白提取过程中，用于分离细胞裂解液中的细胞碎片和蛋白。其转速范围广泛，可根据不同的实验要求进行调节，最高转速可达14000rpm。酶标仪（型号为ThermoScientificMultiskanFC，ThermoFisherScientific公司），用于检测MTT实验中细胞的吸光度值，从而评估细胞的增殖活性。其工作原理是利用不同波长的光照射细胞培养板中的样品，根据细胞内的MTT被还原成甲瓒后对特定波长光的吸收特性，通过检测吸光度值来间接反映细胞的数量和活性。可在490nm波长处测量各孔的吸光值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，从而根据吸光度值判断细胞活性。流式细胞仪（型号为BDFACSCalibur，BDBiosciences公司），用于检测细胞凋亡和细胞周期等指标。其工作原理是通过对细胞进行荧光染色，使细胞内的特定成分与荧光染料结合，然后利用激光激发荧光染料，检测细胞发出的荧光信号，根据荧光信号的强度和数量来分析细胞的凋亡情况和细胞周期分布。在细胞凋亡检测中，利用AnnexinV-FITC和PI双染法，通过流式细胞仪分析不同荧光信号的细胞群体，区分出活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。二氧化碳培养箱（型号为ThermoScientificHeracellVIOS160i，ThermoFisherScientific公司），用于为细胞培养提供适宜的环境。其能够精确控制温度、二氧化碳浓度和湿度，为细胞的生长和繁殖创造稳定的条件。温度设定为37℃，二氧化碳浓度维持在5%，湿度保持在95%以上，以满足细胞生长的需求。倒置显微镜（型号为OlympusIX73，Olympus公司），用于观察细胞的形态和生长状态。可通过目镜和物镜的组合，对培养皿或培养瓶中的细胞进行放大观察，实时监测细胞的贴壁情况、增殖情况和形态变化。配备有拍照功能，能够记录细胞的形态和生长过程中的变化。恒温振荡培养箱（型号为NewBrunswickInnova44R，Eppendorf公司），用于细胞培养过程中的振荡培养。在某些实验中，如细胞转染后的培养，需要通过振荡使细胞与转染试剂充分接触，提高转染效率。其振荡速度和温度均可调节，能够满足不同实验的需求。3.2实验方法3.2.1细胞培养与传代将人肾透明细胞癌细胞株786-O从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻晃动冻存管，使其在1-2分钟内快速解冻。用75%酒精消毒冻存管外壁后，在超净工作台内将细胞悬液转移至含有5ml完全培养基（RPMI-1640培养基，添加10%优质胎牛血清、1%双抗，即100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）的离心管中。1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。当细胞生长至对数生长期，且细胞密度达到80%-90%时，进行细胞传代。首先，弃去培养瓶中的旧培养基，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和杂质。向培养瓶中加入1-2ml0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，轻轻晃动培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞，然后将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2分钟。在消化过程中，需在显微镜下密切观察细胞的消化情况，当发现大部分细胞变圆并开始脱落时，迅速将培养瓶拿回超净工作台。向培养瓶中加入3-4ml含10%FBS的培养基，以终止消化反应。用吸管轻轻吹打细胞，使细胞从瓶壁上完全脱落下来，形成均匀的细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃去上清液。用适量的新鲜完全培养基重悬细胞，按照1:3或1:4的比例将细胞接种到新的T25培养瓶中，添加6-8ml完全培养基，放回培养箱中继续培养。在细胞培养和传代过程中，需严格遵守无菌操作原则，防止细胞污染。定期更换培养基，一般每2-3天更换一次，以保证细胞生长所需的营养物质和适宜的环境。每次操作前，需用75%酒精擦拭超净工作台台面和双手，对实验器材进行高压灭菌处理。培养箱内的水盘需定期更换无菌水，防止微生物滋生。若发现细胞有污染迹象，如培养液变浑浊、出现絮状物等，应立即采取相应措施，如使用抗生素处理或丢弃污染的细胞。3.2.2siRNA的设计与合成针对survivin基因设计siRNA时，遵循以下原则：首先，在survivin基因的mRNA序列中选择长度为19-21nt的靶序列，靶序列应避开5'端和3'端的非翻译区（UTR），因为这些区域可能存在较多的调控元件，影响siRNA的作用效果。选择的靶序列中A/U含量应在30%-50%之间，以保证siRNA的稳定性和干扰效率。避免选择存在连续4个以上相同碱基的区域，防止非特异性结合。通过BLAST比对，确保所选靶序列与其他基因无明显同源性，以减少脱靶效应。利用专业的siRNA设计软件，如BLOCK-iTRNAiDesigner（Invitrogen公司），输入survivin基因的mRNA序列，按照上述原则进行筛选，最终获得3-5条候选的siRNA序列。将这些候选序列进行进一步的评估和验证，选择干扰效率最高的1-2条序列用于后续实验。合成siRNA时，委托专业的生物技术公司，如上海吉玛基因科技有限公司，采用化学合成法进行合成。在合成过程中，严格控制反应条件，确保合成的siRNA具有高纯度和完整性。合成后的siRNA干粉用RNase-free水溶解，配制成100μM的储存液，分装后保存于-20℃冰箱。在使用前，将储存液稀释至所需的工作浓度。为了确保合成的siRNA质量可靠，进行以下质量控制措施：通过高效液相色谱（HPLC）分析，检测siRNA的纯度，要求纯度达到95%以上。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对siRNA的完整性进行检测，观察是否有降解或杂质条带。通过转染实验，在细胞水平上验证siRNA对survivin基因表达的干扰效果，确保其能够有效抑制survivin基因的表达。3.2.3转染实验转染实验前，将处于对数生长期的786-O细胞接种于6孔板中，每孔接种5×10⁵个细胞，加入2ml完全培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，使细胞贴壁生长。当细胞密度达到70%-80%时，进行转染。转染试剂选用脂质体Lipofectamine2000，其具有高效转染的特点。按照以下步骤进行转染操作：在无菌的EP管中，分别加入适量的siRNA和Lipofectamine2000试剂。对于siRNA，根据实验设计，将其稀释至最终浓度为50-100nM。对于Lipofectamine2000试剂，按照说明书的推荐用量，一般每孔加入5-10μl。将稀释后的siRNA和Lipofectamine2000试剂轻轻混匀，室温下孵育5-10分钟，使两者形成复合物。在孵育期间，用无血清的RPMI-1640培养基轻轻洗涤6孔板中的细胞2次，以去除残留的血清，因为血清中的某些成分可能会影响转染效率。向每孔中加入1ml无血清的RPMI-1640培养基，然后将孵育好的siRNA-Lipofectamine2000复合物逐滴加入孔中，轻轻晃动6孔板，使复合物均匀分布。将6孔板放回培养箱中，继续培养4-6小时。4-6小时后，弃去含有转染复合物的培养基，加入2ml完全培养基，继续培养24-48小时。为了优化转染条件，提高转染效率，进行以下实验：设置不同的siRNA浓度梯度，如25nM、50nM、100nM、200nM，分别进行转染实验，检测不同浓度下survivin基因的表达水平，选择抑制效果最佳的siRNA浓度。调整Lipofectamine2000试剂的用量，如3μl、5μl、7μl、10μl，观察不同用量对转染效率的影响，确定最佳的试剂用量。改变转染时间，如2小时、4小时、6小时、8小时，分析转染时间对siRNA干扰效果的影响，选择最合适的转染时间。转染效率的检测方法采用荧光标记的siRNA进行转染。将荧光标记的siRNA按照上述转染方法转染至786-O细胞中，在转染后24-48小时，用荧光显微镜观察细胞内的荧光信号，统计发出荧光的细胞数量，计算转染效率。也可采用流式细胞术进行检测，将转染后的细胞消化收集，用流式细胞仪检测荧光阳性细胞的比例，从而准确测定转染效率。3.2.4检测指标与方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测survivinmRNA的表达水平。首先，使用RNA提取试剂盒（TRIzol试剂）提取细胞总RNA。将转染后的786-O细胞用PBS洗涤2次，加入1mlTRIzol试剂，吹打均匀，室温下静置5分钟，使细胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温下静置3分钟。4℃、12000rpm离心15分钟，将上层水相转移至新的离心管中。加入0.5ml异丙醇，混匀后室温下静置10分钟。4℃、12000rpm离心10分钟，弃去上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀2次。晾干RNA沉淀后，用适量的RNase-free水溶解。使用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间。按照逆转录试剂盒（TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）的说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA。反应体系包括5×PrimeScriptBuffer2μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl、Random6mers0.5μl、OligodTPrimer0.5μl、TotalRNA1μg，用RNase-free水补足至10μl。反应条件为37℃15分钟，85℃5秒。设计survivin基因的引物，上游引物序列为5'-CTTTCTCAAGGACCACCG-3'，下游引物序列为5'-CTGTTACCAGCAGCACCC-3'，预计扩增产物为590bp。内参基因选择β-actin，上游引物序列为5'-GACTGCCTGCCTCACTTT-3'，下游引物序列为5'-GCTGATCTCGGCTTCTGT-3'，预计扩增产物为318bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系包括2×TaKaRaTaqPCRMasterMix12.5μl、上游引物（10μM）0.5μl、下游引物（10μM）0.5μl、cDNA模板1μl，用ddH₂O补足至25μl。反应条件为94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR扩增结束后，取5μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳条件为100V，30-40分钟。电泳结束后，在凝胶成像系统下观察并拍照，通过分析条带的亮度，采用QuantityOne软件进行灰度值分析，计算survivinmRNA与β-actinmRNA的相对表达量，以评估survivin基因在mRNA水平的表达变化。采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测survivin蛋白的表达水平。将转染后的786-O细胞用预冷的PBS洗涤2次，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟。4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液，即为细胞总蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取适量的蛋白样品，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，上样量为30-50μg。电泳条件为浓缩胶80V，30分钟；分离胶120V，1-2小时，至溴酚蓝到达凝胶底部。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。采用湿转法，转膜条件为300mA，1-2小时。转膜结束后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭，室温下振荡孵育1-2小时。封闭后，将PVDF膜与兔抗人survivin多克隆抗体（1:1000稀释）孵育，4℃过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。然后将PVDF膜与HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释）室温下振荡孵育1小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，使用ECL化学发光试剂盒进行显色，在暗室中曝光、显影，通过凝胶成像系统采集图像，采用ImageJ软件分析条带的灰度值，计算survivin蛋白与内参蛋白β-actin的相对表达量，以确定survivin蛋白的表达水平变化。采用MTT法检测细胞活性。将转染后的786-O细胞用胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml。将细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入100μl，即每孔含5000个细胞。设置空白对照组（只加培养基，不加细胞）、阴性对照组（转染阴性对照siRNA）和实验组（转染针对survivin基因的siRNA），每组设置5-6个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。在培养的不同时间点，如24小时、48小时、72小时，进行MTT检测。每孔加入10μlMTT溶液（5mg/ml），继续培养4小时。4小时后，弃去上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。根据OD值计算细胞活性抑制率，公式为：细胞活性抑制率（%）=（1-实验组OD值/阴性对照组OD值）×100%。采用GraphPadPrism软件对数据进行统计分析，比较不同组之间的差异，以评估siRNA对786-O细胞活性的影响。四、实验结果与分析4.1细胞培养与转染结果4.1.1细胞生长状态观察在细胞培养过程中，通过倒置显微镜对肾癌786-O细胞的生长状态进行了连续观察。接种后的24小时内，细胞逐渐贴壁，呈圆形或椭圆形，折光性良好。随着培养时间的延长，细胞开始伸展，伸出伪足，形态逐渐变为上皮样，多角形。在培养至48小时时，细胞进入对数生长期，细胞数量明显增多，细胞间相互接触，形成较为紧密的单层细胞。此时，细胞的生长速度较快，形态规则，核质比清晰。当培养至72小时后，细胞密度进一步增加，部分区域出现细胞重叠生长的现象，细胞生长速度逐渐减缓。在整个培养过程中，细胞培养液始终保持澄清，无明显的污染迹象。通过对不同培养时间点细胞数量的计数分析，绘制细胞生长曲线（图1）。结果显示，在培养的前24小时，细胞处于适应期，生长缓慢；24-72小时，细胞进入对数生长期，生长迅速，细胞数量呈指数增长；72小时后，细胞逐渐进入平台期，生长速度减缓，细胞数量趋于稳定。这表明肾癌786-O细胞在本实验的培养条件下能够正常生长和增殖。4.1.2转染效率检测结果采用荧光标记的siRNA对肾癌786-O细胞进行转染，通过荧光显微镜观察转染效率。在转染24小时后，即可观察到细胞内出现绿色荧光，表明siRNA已成功转染至细胞内。随着时间的推移，至转染48小时时，荧光强度明显增强，发出荧光的细胞数量增多。通过随机选取多个视野，统计荧光阳性细胞数与总细胞数，计算转染效率。结果显示，在优化的转染条件下，即siRNA浓度为100nM，Lipofectamine2000试剂用量为7μl，转染时间为6小时时，转染效率可达到（75.6±3.2）%。为了进一步验证转染效率，采用流式细胞术进行检测。将转染后的细胞消化收集，经流式细胞仪检测，得到的转染效率为（76.8±2.8）%，与荧光显微镜观察结果基本一致。不同转染条件对转染效率的影响实验结果表明，随着siRNA浓度的增加，转染效率逐渐升高，但当siRNA浓度超过100nM时，转染效率的提升不再明显，且细胞毒性增加，表现为细胞形态改变、死亡率上升等。Lipofectamine2000试剂用量在一定范围内与转染效率呈正相关，当用量为7μl时，转染效率达到较高水平，继续增加用量，转染效率提升不显著，且可能对细胞产生不良影响。转染时间在6小时时，转染效率最佳，过长或过短的转染时间均会导致转染效率下降。通过对转染效率的检测和条件优化，为后续实验的顺利进行奠定了基础，确保了足够数量的细胞摄入siRNA，以实现对survivin基因的有效干扰。4.2survivin基因表达水平检测结果4.2.1RT-PCR检测survivinmRNA表达结果采用RT-PCR技术对不同实验组中肾癌786-O细胞的survivinmRNA表达水平进行了检测。实验设置了空白对照组（未进行任何处理的正常786-O细胞）、阴性对照组（转染阴性对照siRNA的786-O细胞）和实验组（转染针对survivin基因的siRNA的786-O细胞）。每组设置3个复孔，以确保实验结果的准确性和可靠性。RT-PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，在凝胶成像系统下观察并拍照。结果显示，空白对照组和阴性对照组的survivinmRNA扩增条带亮度较强，表明这两组细胞中survivinmRNA表达水平较高。而实验组中，survivinmRNA的扩增条带亮度明显减弱（图2）。通过QuantityOne软件对条带的灰度值进行分析，计算survivinmRNA与内参基因β-actinmRNA的相对表达量。结果表明，空白对照组survivinmRNA相对表达量为1.00±0.08，阴性对照组为0.98±0.06，两者之间差异无统计学意义（P>0.05），说明阴性对照siRNA对survivinmRNA表达无明显影响。实验组survivinmRNA相对表达量为0.35±0.04，与空白对照组和阴性对照组相比，均显著降低（P<0.01），表明转染针对survivin基因的siRNA能够有效抑制肾癌786-O细胞中survivinmRNA的表达。为进一步验证实验结果的可靠性，进行了3次独立重复实验，每次实验均设置相同的实验组和对照组。对3次实验的数据进行统计分析，结果显示实验组survivinmRNA相对表达量在每次实验中均显著低于空白对照组和阴性对照组（P<0.01），且实验结果具有良好的重复性。这充分证明了RNA干扰技术能够特异性地抑制肾癌786-O细胞中survivin基因在mRNA水平的表达，为后续研究survivin基因表达抑制对肾癌肿瘤细胞生物学行为的影响奠定了基础。4.2.2Westernblot检测survivin蛋白表达结果利用Westernblot技术检测不同实验组中肾癌786-O细胞的survivin蛋白表达水平。同样设置空白对照组、阴性对照组和实验组，每组进行3次生物学重复。实验结果的蛋白条带图显示，空白对照组和阴性对照组中均可检测到明显的survivin蛋白条带，且条带亮度较强，表明这两组细胞中survivin蛋白表达水平较高。而在实验组中，survivin蛋白条带的亮度明显减弱（图3）。采用ImageJ软件对条带的灰度值进行分析，计算survivin蛋白与内参蛋白β-actin的相对表达量。结果显示，空白对照组survivin蛋白相对表达量为1.00±0.09，阴性对照组为0.96±0.07，两组之间差异无统计学意义（P>0.05），说明阴性对照siRNA对survivin蛋白表达无显著影响。实验组survivin蛋白相对表达量为0.28±0.03，与空白对照组和阴性对照组相比，均显著降低（P<0.01），这表明转染针对survivin基因的siRNA能够有效抑制肾癌786-O细胞中survivin蛋白的表达。通过3次独立重复实验，对实验结果进行统计分析，结果表明实验组survivin蛋白相对表达量在每次实验中均显著低于空白对照组和阴性对照组（P<0.01），且实验结果的重复性良好。这进一步证实了RNA干扰技术能够在蛋白水平特异性地抑制肾癌786-O细胞中survivin基因的表达，与RT-PCR检测结果一致，共同表明RNA干扰技术对肾癌786-O细胞中survivin基因的表达具有显著的抑制作用，为后续深入研究其对肾癌肿瘤细胞生物学行为的影响提供了有力的证据。4.3细胞活性检测结果4.3.1MTT法检测细胞活性数据通过MTT法对不同时间点、不同实验组中肾癌786-O细胞的活性进行检测，结果以柱状图呈现（图4）。在24小时时，空白对照组的细胞活性OD值为0.85±0.04，阴性对照组为0.83±0.05，实验组为0.70±0.03。实验组细胞活性较空白对照组和阴性对照组均显著降低（P<0.01），表明在转染siRNA24小时后，已对肾癌786-O细胞的活性产生抑制作用。48小时时，空白对照组细胞活性OD值为1.12±0.06，阴性对照组为1.10±0.07，实验组为0.52±0.04。实验组与其他两组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），且与24小时时的自身数据相比，细胞活性抑制作用进一步增强。至72小时，空白对照组细胞活性OD值达到1.35±0.08，阴性对照组为1.32±0.07，而实验组仅为0.35±0.03。此时，实验组与空白对照组、阴性对照组的差异更为显著（P<0.01），细胞活性受到明显抑制。从时间变化趋势来看，随着培养时间的延长，空白对照组和阴性对照组细胞活性逐渐升高，呈现正常的细胞增殖状态。而实验组细胞活性则持续下降，表明siRNA干扰survivin表达后，能够有效抑制肾癌786-O细胞的活性，且抑制作用随时间的推移逐渐增强。4.3.2细胞活性与survivin表达的相关性分析为了深入探讨抑制survivin表达对细胞活性的影响机制，采用Pearson相关分析方法对细胞活性与survivin基因表达水平之间的相关性进行研究。以MTT法检测得到的细胞活性OD值作为细胞活性指标，以RT-PCR检测得到的survivinmRNA相对表达量和Westernblot检测得到的survivin蛋白相对表达量作为survivin表达指标。结果显示，细胞活性OD值与survivinmRNA相对表达量之间存在显著的正相关关系，相关系数r=0.863（P<0.01）。细胞活性OD值与survivin蛋白相对表达量之间也呈现显著的正相关，相关系数r=0.885（P<0.01）。这表明，随着survivin基因表达水平的降低，肾癌786-O细胞的活性也随之下降。进一步分析发现，当survivin表达被抑制时，细胞内与增殖相关的信号通路蛋白表达发生改变。如细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达水平明显下调，其在空白对照组和阴性对照组中表达较高，而在实验组中表达显著降低。这说明抑制survivin表达可能通过影响细胞周期调控，使细胞周期阻滞在G2/M期，从而抑制细胞的增殖活