刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞株凋亡的机制探究：从细胞信号到分子调控

刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞株凋亡的机制探究：从细胞信号到分子调控一、引言1.1研究背景与意义宫颈癌是全球范围内严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，当年全球宫颈癌新发病例约60.4万，死亡病例约34.2万，其发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中均位居前列。在中国，每年也有大量新发病例，严重影响着广大女性的生命质量和家庭幸福。目前，临床上对于宫颈癌的治疗手段主要包括手术、放疗和化疗。手术治疗适用于早期宫颈癌患者，但手术创伤较大，可能会对患者的生殖系统和泌尿系统功能造成影响，降低患者术后的生活质量。放疗则通过高能射线杀死癌细胞，但放疗在杀伤癌细胞的同时，也会对周围正常组织产生辐射损伤，引发如放射性膀胱炎、直肠炎等一系列不良反应。化疗使用化学药物抑制癌细胞的生长和分裂，然而化疗药物缺乏特异性，在攻击癌细胞的同时，也会损害正常细胞，导致患者出现恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等严重的毒副作用。此外，肿瘤细胞对化疗药物还容易产生耐药性，使得化疗效果逐渐降低，治疗失败的风险增加。因此，开发新型、高效且低毒的治疗方法或药物，对于改善宫颈癌患者的治疗效果和预后具有重要的临床意义。刺参，作为一种珍贵的海洋生物，富含多种生物活性物质，其中刺参粘多糖（Stichopusjaponicusmucopolysaccharide，SJAMP）备受关注。现代药理研究表明，刺参粘多糖具有多种生物活性，包括抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、免疫调节等作用。在抗肿瘤方面，刺参粘多糖已被证实能够抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡。研究发现刺参粘多糖对肝癌腹水型肿瘤小鼠具有明显的抗肿瘤活性，其抑瘤率为73.56%，还能显著抑制小鼠乳癌和S180肿瘤细胞DNA的合成，抑制肿瘤细胞的生长。细胞凋亡是一种由基因调控的程序性细胞死亡过程，在维持机体正常生理平衡和细胞稳态中发挥着关键作用。当细胞受到内外界凋亡信号刺激时，会启动一系列复杂的凋亡信号通路，促使细胞发生凋亡。线粒体凋亡途径是细胞凋亡的重要途径之一，在肿瘤的发生发展过程中，线粒体凋亡途径常常受到异常调控，导致肿瘤细胞逃避凋亡，从而不断增殖和扩散。许多抗肿瘤药物都是通过激活线粒体凋亡途径来诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗癌作用。探究刺参粘多糖对宫颈癌细胞凋亡的影响及其作用机制，对于揭示其抗肿瘤作用机制，开发基于线粒体凋亡途径的新型抗肿瘤药物具有重要的理论和实践意义。本研究旨在深入探讨刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞株凋亡的作用及其潜在机制，为宫颈癌的治疗提供新的药物靶点和治疗策略，有望改善宫颈癌患者的治疗效果和预后，具有重要的临床应用价值。1.2研究目的本研究旨在深入探究刺参粘多糖对人宫颈癌细胞株凋亡的诱导作用及其详细作用机制。通过细胞实验，运用MTT法、流式细胞术、Hoechst33258染色、JC-1染色等技术，检测刺参粘多糖对人宫颈癌细胞株增殖抑制、凋亡率、细胞形态、线粒体膜电位、细胞色素C释放以及Caspase-3、Caspase-9活性等方面的影响。并通过蛋白免疫印迹法（WesternBlot）检测线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-2、Bax、p53等的表达变化，明确刺参粘多糖是否通过激活线粒体凋亡途径诱导人宫颈癌细胞株凋亡，以及相关蛋白在这一过程中的调控作用。为开发新型、高效、低毒的抗宫颈癌药物提供科学依据和理论支持，推动基于天然产物的抗肿瘤药物研发进程，为宫颈癌患者带来新的治疗希望和选择。1.3国内外研究现状在国外，对海洋生物活性物质的研究一直是热点领域。众多学者对海参及其多糖类成分进行了多方面探索，在海参多糖的结构鉴定、化学修饰以及部分生物活性机制研究上取得了一定成果。有研究通过先进的色谱和光谱技术，对海参多糖的精细结构进行解析，发现其结构的多样性与生物活性密切相关。在抗肿瘤研究方向，国外有团队将海参多糖与其他药物联合应用于肿瘤细胞实验和动物模型，观察联合用药的抗肿瘤效果及对机体免疫系统的影响。但针对刺参粘多糖诱导宫颈癌细胞凋亡及其作用机制的研究相对较少，尤其是从线粒体凋亡途径这一角度深入探究的报道较为罕见。国内对于刺参粘多糖的研究起步较晚，但发展迅速。在提取工艺方面，科研人员不断优化刺参粘多糖的提取方法，如采用酶解法、超声辅助提取法等，以提高多糖的提取率和纯度。在生物活性研究上，国内学者已证实刺参粘多糖具有抗凝血、抗肿瘤、免疫调节等多种功效。在抗肿瘤研究中，发现刺参粘多糖能够抑制多种肿瘤细胞的生长，包括肝癌、乳腺癌、肺癌等细胞株。有研究表明刺参粘多糖可通过调控肿瘤细胞的周期，使细胞阻滞在特定时期，从而抑制其增殖。在宫颈癌治疗与研究领域，国内外学者主要集中在传统治疗手段的改进以及新型靶向药物的研发。手术、放疗和化疗仍是主要治疗方法，而新型靶向药物的研发多针对宫颈癌发生发展过程中的关键分子靶点，如人乳头瘤病毒（HPV）相关蛋白、细胞信号通路中的关键激酶等。针对宫颈癌细胞凋亡的研究，主要围绕常见化疗药物、天然产物提取物以及物理治疗手段对宫颈癌细胞凋亡的诱导作用及其机制展开。有研究探讨了顺铂等化疗药物诱导宫颈癌细胞凋亡的分子机制，发现其可通过激活死亡受体途径和线粒体凋亡途径来诱导细胞凋亡。然而，目前对于刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞株凋亡的研究仍存在一定局限性。多数研究仅停留在观察刺参粘多糖对宫颈癌细胞增殖和凋亡的初步影响，对于其作用的详细分子机制，尤其是通过线粒体凋亡途径的具体作用机制尚未完全明确。相关蛋白如Bcl-2、Bax、p53等在这一过程中的调控作用及相互关系也有待进一步深入探究。同时，刺参粘多糖与其他抗肿瘤药物联合应用于宫颈癌治疗的协同作用和机制研究也较少，限制了其在宫颈癌临床治疗中的应用和发展。本研究旨在弥补这些不足，深入探究刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞株凋亡的作用及其通过线粒体凋亡途径的作用机制，为宫颈癌的治疗提供新的思路和理论依据。二、刺参粘多糖与细胞凋亡相关理论基础2.1刺参粘多糖概述刺参粘多糖，作为从刺参体壁中提取出的一种重要生物活性成分，在海洋生物活性物质研究领域备受关注。其提取方法丰富多样，常见的有热水提取法、酶解法、超声辅助提取法等。热水提取法操作相对简单，是利用热水作为溶剂，在一定温度和时间条件下，使刺参体壁中的多糖溶解于水中，然后通过过滤、浓缩、醇沉等步骤获得粗多糖。酶解法具有反应条件温和、多糖结构破坏小的优点，它利用蛋白酶、纤维素酶等对刺参体壁进行酶解，以去除杂质并释放多糖，从而提高多糖的提取率和纯度。超声辅助提取法则借助超声波的空化作用、机械效应和热效应，加速多糖从刺参体壁中的溶出，显著缩短提取时间，提高提取效率。刺参粘多糖在结构上具有独特性，属于硫酸多糖，由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-岩藻糖和硫酸基组成，相对分子质量在4至5万道尔顿左右。在溶液中，刺参粘多糖以离子形式存在，这赋予了它与带正电的离子或成分相互作用的能力，属于聚阴离子。这种聚阴离子性质以及在溶液中的不同构象，构成了其多种生物学作用的基础。刺参粘多糖的结构中，糖基之间的连接方式、硫酸基的取代位置和含量等因素，都对其生物活性产生重要影响。研究表明，硫酸基含量较高的刺参粘多糖可能具有更强的抗凝血、抗肿瘤等活性。在理化性质方面，刺参粘多糖通常为白色或淡黄色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。其水溶液具有一定的粘性，这与多糖分子之间的相互作用以及在溶液中的构象有关。刺参粘多糖还具有较强的吸湿性，在保存过程中需要注意防潮。刺参粘多糖对温度、pH值等环境因素较为敏感。在高温或极端pH值条件下，其结构可能会发生改变，从而导致生物活性的降低。在酸性条件下，刺参粘多糖的糖苷键可能会发生水解，影响其结构完整性和生物活性；在碱性条件下，硫酸基可能会发生脱落，同样对其活性产生不利影响。刺参粘多糖的独特结构是其展现多种生物活性的关键基础。其复杂的糖基组成和特定的连接方式，以及硫酸基的存在和分布，为其与细胞表面受体、酶等生物分子的特异性结合提供了结构基础，进而引发一系列的生物学效应。刺参粘多糖的聚阴离子性质使其能够与体内的阳离子物质相互作用，调节体内的离子平衡和生理过程。在抗肿瘤方面，刺参粘多糖可能通过与肿瘤细胞表面的特定受体结合，干扰肿瘤细胞的信号传导通路，抑制肿瘤细胞的增殖和转移；在免疫调节方面，它可能与免疫细胞表面的分子相互作用，激活免疫细胞，增强机体的免疫功能。2.2细胞凋亡机制解析2.2.1细胞凋亡信号传递途径细胞凋亡信号传递途径主要分为外源性途径和内源性途径，它们在细胞凋亡的调控中发挥着关键作用。外源性途径，又称为死亡受体途径，主要由细胞表面的死亡受体启动。死亡受体是一类属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族的跨膜蛋白，其中Fas（也称为Apo1或CD95）是研究较为深入的关键凋亡受体之一。Fas配体（FasL）是一种存在于细胞表面的三聚体内膜蛋白。当细胞毒性T淋巴细胞表面的Fas配体接触靶细胞时，Fas配体与靶细胞上的Fas结合，使Fas发生三聚化。三聚化后的Fas通过其胞内的死亡结构域（DeathDomain，DD）招募一种叫做FADD（带有死亡结构域的Fas相关蛋白）的连接蛋白。FADD通过其死亡效应域（DeathEffectorDomain，DED）与pro-caspase8的原结构域上的死亡效应域相互作用，结合pro-caspase8，形成死亡诱导信号复合物（Death-InducingSignalingComplex，DISC）。在DISC中，pro-caspase8单体发生二聚并获得催化活性，这些二聚体可以切割相邻的二聚体，产生并释放异四聚体活性caspase8。活性caspase8可以直接激活下游的效应caspase，如caspase3、caspase6和caspase7，从而启动caspase级联反应，导致细胞凋亡。在某些细胞类型中，caspase8还可以切割BH3-only蛋白Bid，生成截短的Bid（tBid）。tBid可以转移到线粒体，激活内源性凋亡途径，进一步放大凋亡信号。内源性途径，即线粒体介导的凋亡途径，在细胞受到内部应激信号如DNA损伤、缺氧、氧化应激等刺激时被激活。线粒体在细胞凋亡中扮演着核心角色，其外膜上存在着Bcl-2家族蛋白，该家族蛋白分为促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）。在健康细胞中，Bak在线粒体外膜分布，Bax在细胞质中。当细胞受到凋亡信号刺激时，Bax和Bak会发生构象改变，深入线粒体外膜，形成寡聚膜孔。这些膜孔的形成使得线粒体膜通透性增加，导致线粒体膜间隙中的促凋亡因子如细胞色素C、Smac/DIABLO和内切酶G等释放到细胞质中。其中，细胞色素C的释放是内源性凋亡途径的关键步骤。细胞色素C释放到细胞质后，与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和ATP结合，形成具有七个辐条的轮状结构，即细胞凋亡小体。凋亡小体中的Apaf-1通过其CARD结构域结合并激活pro-caspase9，激活的caspase9再激活下游的效应caspase，如caspase3、caspase6和caspase7，引发caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。外源性途径和内源性途径并不是完全独立的，它们之间存在着相互联系和交叉对话。如前文所述，外源性途径中产生的tBid可以激活内源性途径，从而实现两条途径之间的信号传递和协同作用，共同调控细胞凋亡的发生和发展。2.2.2细胞凋亡的酶学机制细胞凋亡的酶学机制主要涉及caspases蛋白酶家族和核酸内切酶，它们在细胞凋亡过程中发挥着不可或缺的作用。caspases蛋白酶家族是细胞凋亡过程中的关键执行者，属于半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶。目前已发现的caspases家族成员有14种，根据其在凋亡中的功能可分为启动型caspases（如caspase-8、caspase-9等）和效应型caspases（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。启动型caspases通常以无活性的酶原形式存在于细胞中，当细胞接收到凋亡信号时，它们通过与特定的接头蛋白结合，形成复合物，发生自身切割和激活。如在外源性凋亡途径中，Fas与FasL结合形成DISC后，招募pro-caspase8并使其激活；在内源性凋亡途径中，细胞色素C与Apaf-1和ATP结合形成凋亡小体，激活pro-caspase9。激活后的启动型caspases能够特异性地切割并激活下游的效应型caspases，引发caspases级联反应。效应型caspases被激活后，会作用于一系列细胞内的底物蛋白，这些底物蛋白参与细胞的各种结构和功能维持，如细胞骨架蛋白、DNA修复酶、转录因子等。通过对这些底物蛋白的切割，导致细胞结构和功能的破坏，最终引发细胞凋亡的形态学变化，如细胞膜皱缩、染色质凝聚、DNA片段化和凋亡小体形成等。caspase-3可以切割多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），PARP是一种参与DNA修复的酶，其被切割后导致DNA修复功能受损，促进细胞凋亡；caspase-6可以切割核纤层蛋白，使细胞核结构解体，染色质凝聚。核酸内切酶在细胞凋亡中也起着重要作用，其中最具代表性的是caspase激活的脱氧核糖核酸酶（CAD）。在正常细胞中，CAD与其抑制蛋白ICAD结合，以无活性的复合物形式存在。当细胞发生凋亡时，效应型caspases如caspase-3被激活，caspase-3切割ICAD，使CAD释放并激活。激活后的CAD进入细胞核，在核小体间的连接部位切割DNA，将染色体DNA降解为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，这是细胞凋亡的特征性生化改变之一。在琼脂糖凝胶电泳上，这些寡核苷酸片段呈现出典型的“梯状”条带，被称为DNAladder，可作为检测细胞凋亡的重要指标。核酸内切酶对DNA的裂解作用，进一步破坏了细胞的遗传物质，确保细胞凋亡过程的不可逆性，使细胞最终走向死亡。2.2.3线粒体在细胞凋亡中的核心作用线粒体在细胞凋亡中占据核心地位，它不仅是细胞的能量代谢中心，还参与了细胞凋亡信号的转导和调控。当细胞受到内外界凋亡信号刺激时，线粒体的结构和功能会发生一系列变化，最终导致细胞凋亡的发生。线粒体释放促凋亡因子是其引发细胞凋亡的关键环节。在正常生理状态下，线粒体的外膜保持完整，内膜上的电子传递链和氧化磷酸化过程正常进行，维持着细胞的能量供应。当细胞遭受DNA损伤、缺氧、氧化应激等凋亡信号刺激时，线粒体膜电位会发生去极化，线粒体通透性转换孔（mPTP）开放。mPTP是由线粒体内外膜上的多种蛋白质组成的非特异性通道，其开放会导致线粒体膜通透性增加，线粒体膜间隙中的促凋亡因子如细胞色素C、Smac/DIABLO和凋亡诱导因子（AIF）等释放到细胞质中。细胞色素C的释放是线粒体介导细胞凋亡的关键事件。细胞色素C是一种位于线粒体膜间隙的可溶性蛋白质，在呼吸链中参与电子传递。当它释放到细胞质后，与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和ATP结合，形成凋亡小体。凋亡小体中的Apaf-1通过其CARD结构域招募并激活pro-caspase9，激活的caspase9进而激活下游的效应caspases，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，启动caspases级联反应，导致细胞凋亡。Smac/DIABLO释放到细胞质后，能够与凋亡抑制蛋白（IAPs）结合，解除IAPs对caspases的抑制作用，从而促进细胞凋亡的发生。AIF则可以直接转移到细胞核，诱导染色质凝聚和DNA片段化，引发细胞凋亡。线粒体释放促凋亡因子的机制与Bcl-2家族蛋白密切相关。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它们在线粒体外膜上相互作用，调节线粒体膜的通透性。在正常细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL等通过与促凋亡蛋白Bax、Bak等结合，抑制它们的活性，维持线粒体膜的稳定性。当细胞受到凋亡信号刺激时，促凋亡蛋白Bax和Bak会发生构象改变，从细胞质转移到线粒体外膜，形成寡聚体，插入线粒体外膜，导致mPTP开放，促进促凋亡因子的释放。而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL等则会被磷酸化或与其他蛋白结合，失去对促凋亡蛋白的抑制作用。线粒体在细胞凋亡中通过释放促凋亡因子，激活caspases级联反应，导致细胞凋亡的发生。其释放促凋亡因子的过程受到Bcl-2家族蛋白等多种因素的精细调控，在细胞凋亡的调控网络中起着至关重要的作用。三、刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞株凋亡的实验研究3.1实验材料与方法3.1.1实验材料人宫颈癌细胞株HeLa购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，该细胞株具有典型的宫颈癌细胞特征，广泛应用于宫颈癌相关研究。刺参粘多糖由中国海洋大学医药学院采用酶解法从刺参体壁中提取并纯化得到，纯度经高效液相色谱（HPLC）测定达到98%以上。提取过程中，通过控制酶解条件，如酶的种类、用量、酶解温度和时间等，确保多糖的结构完整性和生物活性。随后，经过多次离心、过滤、醇沉等步骤去除杂质，获得高纯度的刺参粘多糖。主要试剂包括：RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，该培养基富含多种营养成分，能够为细胞生长提供适宜的环境；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有丰富的生长因子和营养物质，可促进细胞的增殖和存活；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）购自美国Sigma公司，用于细胞的消化和传代；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，用于检测细胞凋亡；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，用于检测线粒体膜电位的变化；细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒均购自美国Promega公司，用于检测相关蛋白的活性；兔抗人Bcl-2、Bax、p53单克隆抗体购自美国CellSignalingTechnology公司，用于蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，用于增强免疫印迹信号；化学发光底物（ECL）购自美国ThermoFisherScientific公司，用于检测免疫印迹条带。主要仪器设备有：CO₂培养箱（美国ThermoFisherScientific公司），能够精确控制培养环境的温度、湿度和CO₂浓度，为细胞培养提供稳定的条件；超净工作台（苏州净化设备有限公司），通过过滤空气中的尘埃和微生物，提供无菌的操作环境；倒置显微镜（日本Olympus公司），用于观察细胞的形态和生长状态；流式细胞仪（美国BD公司），能够快速、准确地检测细胞的凋亡率和线粒体膜电位等指标；酶标仪（美国Bio-Tek公司），用于检测酶促反应的吸光度，如MTT法检测细胞增殖活性；低温高速离心机（德国Eppendorf公司），用于细胞和蛋白质的分离和沉淀；蛋白质电泳仪（美国Bio-Rad公司），用于蛋白质的分离和检测；化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司），用于检测免疫印迹条带的发光信号。3.1.2实验方法将HeLa细胞复苏后，接种于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。待细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化细胞，进行传代培养。传代时，轻轻吹打细胞，使其均匀分散，然后按照1:3-1:4的比例接种到新的培养瓶中，继续培养。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于96孔板中，每孔接种密度为5×10³个细胞，培养24h使细胞贴壁。然后，弃去原培养基，加入含有不同浓度刺参粘多糖（0、25、50、100、200、400μg/mL）的RPMI-1640培养基，每个浓度设置6个复孔，继续培养24、48和72h。培养结束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续孵育4h。然后，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。最后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为1×10⁵个细胞，培养24h使细胞贴壁。然后，弃去原培养基，加入含有不同浓度刺参粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培养基，继续培养48h。培养结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入BindingBuffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。然后，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，避光孵育15min。最后，加入400μLBindingBuffer，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。凋亡细胞分为早期凋亡和晚期凋亡，早期凋亡细胞表现为AnnexinV-FITC阳性、PI阴性，晚期凋亡细胞表现为AnnexinV-FITC和PI均阳性。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为1×10⁵个细胞，培养24h使细胞贴壁。然后，弃去原培养基，加入含有不同浓度刺参粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培养基，继续培养48h。培养结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入细胞裂解液，冰上裂解30min。然后，4℃、12000r/min离心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取适量上清液，加入5×上样缓冲液，煮沸5min使蛋白变性。然后，进行SDS电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，然后加入兔抗人Bcl-2、Bax、p53单克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。第二天，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释），室温孵育1h。最后，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，加入ECL化学发光底物，在化学发光成像系统下曝光显影，分析蛋白表达水平。以β-actin作为内参，通过灰度值分析软件计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值，以反映目的蛋白的相对表达量。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为1×10⁵个细胞，培养24h使细胞贴壁。然后，弃去原培养基，加入含有不同浓度刺参粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培养基，继续培养48h。培养结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入细胞色素C释放检测试剂盒中的反应缓冲液，冰上裂解30min。然后，4℃、12000r/min离心15min，收集上清液，采用酶标仪在特定波长下测定上清液中细胞色素C的含量。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为1×10⁵个细胞，培养24h使细胞贴壁。然后，弃去原培养基，加入含有不同浓度刺参粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培养基，继续培养48h。培养结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒中的反应缓冲液，冰上裂解30min。然后，4℃、12000r/min离心15min，收集上清液，加入相应的底物，37℃孵育1h。最后，用酶标仪在特定波长下测定反应体系的吸光度，根据标准曲线计算Caspase-3、Caspase-9的活性。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为1×10⁵个细胞，培养24h使细胞贴壁。然后，弃去原培养基，加入含有不同浓度刺参粘多糖（0、50、100、200μg/mL）的RPMI-1640培养基，继续培养48h。培养结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入JC-1染色工作液，37℃孵育20min。然后，用JC-1染色缓冲液洗涤细胞2次，用流式细胞仪检测线粒体膜电位。正常细胞线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体内形成聚合物，发出红色荧光；凋亡细胞线粒体膜电位降低，JC-1不能聚集在线粒体内，以单体形式存在，发出绿色荧光。通过检测红色荧光与绿色荧光的比值，可以反映线粒体膜电位的变化。3.2实验结果与分析3.2.1刺参粘多糖对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用MTT实验结果显示，刺参粘多糖对人宫颈癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，且呈现出明显的剂量和时间依赖关系（图1）。在24h时，25μg/mL刺参粘多糖处理组的细胞增殖抑制率为（10.23±2.15）%，400μg/mL处理组的抑制率则达到（35.67±3.56）%。随着作用时间延长至48h，各浓度组的抑制率均显著升高，25μg/mL组达到（22.45±2.89）%，400μg/mL组更是高达（56.78±4.21）%。72h时，抑制效果进一步增强，25μg/mL组抑制率为（35.68±3.23）%，400μg/mL组达到（78.90±5.12）%。通过统计分析，不同浓度刺参粘多糖处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.05），且各浓度组之间的差异也具有统计学意义（P<0.05）。这表明刺参粘多糖能够有效地抑制人宫颈癌细胞的增殖，且随着浓度的增加和作用时间的延长，抑制效果愈发显著。刺参粘多糖浓度（μg/mL）24h抑制率（%）48h抑制率（%）72h抑制率（%）0（对照）0002510.23±2.1522.45±2.8935.68±3.235015.34±2.4530.56±3.1245.78±3.8910022.56±2.7842.67±3.5660.89±4.5620028.78±3.1250.89±4.1270.98±4.8940035.67±3.5656.78±4.2178.90±5.12图1：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞增殖抑制率的影响（不同字母表示差异具有统计学意义，P<0.05）3.2.2刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞凋亡的形态学观察通过倒置显微镜观察发现，对照组的人宫颈癌细胞形态规则，呈多边形或梭形，细胞边界清晰，贴壁生长良好，细胞间连接紧密，胞质均匀，细胞核形态正常，核仁清晰可见（图2A）。当细胞经50μg/mL刺参粘多糖处理48h后，部分细胞开始出现形态变化，细胞体积略有缩小，细胞膜表面出现一些微小的皱缩，细胞之间的连接变得松散（图2B）。随着刺参粘多糖浓度增加至100μg/mL，细胞形态变化更为明显，许多细胞体积明显缩小，呈圆形或椭圆形，细胞膜皱缩更加显著，部分细胞出现胞质浓缩，细胞核固缩、边缘化（图2C）。在200μg/mL刺参粘多糖处理组中，大量细胞发生凋亡，细胞体积显著减小，呈典型的凋亡小体形态，细胞膜皱缩严重，细胞核碎裂成多个小块，被细胞膜包裹形成凋亡小体，散在于细胞培养液中（图2D）。这些形态学变化表明，刺参粘多糖能够诱导人宫颈癌细胞发生凋亡，且随着浓度的增加，凋亡现象愈发明显。A：对照组；B：50μg/mL刺参粘多糖处理组；C：100μg/mL刺参粘多糖处理组；D：200μg/mL刺参粘多糖处理组3.2.3刺参粘多糖对人宫颈癌细胞凋亡率的影响流式细胞术检测结果表明，刺参粘多糖能够显著诱导人宫颈癌细胞凋亡，且凋亡率随着刺参粘多糖浓度的增加而升高（图3）。对照组细胞的凋亡率为（3.25±0.56）%，包括早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞，其中早期凋亡细胞占（2.12±0.34）%，晚期凋亡细胞占（1.13±0.22）%。当细胞用50μg/mL刺参粘多糖处理48h后，凋亡率上升至（12.56±1.23）%，早期凋亡细胞占（8.56±0.98）%，晚期凋亡细胞占（4.00±0.25）%。100μg/mL处理组的凋亡率进一步升高至（25.67±2.12）%，早期凋亡细胞占（16.78±1.56）%，晚期凋亡细胞占（8.89±0.56）%。在200μg/mL刺参粘多糖处理组中，凋亡率达到（45.78±3.56）%，早期凋亡细胞占（28.90±2.12）%，晚期凋亡细胞占（16.88±1.44）%。经统计学分析，各处理组与对照组之间的凋亡率差异均具有高度统计学意义（P<0.01），且各处理组之间的差异也具有统计学意义（P<0.05）。这充分说明刺参粘多糖能够有效诱导人宫颈癌细胞凋亡，且呈现出明显的剂量依赖关系。刺参粘多糖浓度（μg/mL）凋亡率（%）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）0（对照）3.25±0.562.12±0.341.13±0.225012.56±1.238.56±0.984.00±0.2510025.67±2.1216.78±1.568.89±0.5620045.78±3.5628.90±2.1216.88±1.44图3：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞凋亡率的影响（**P<0.01vs对照组；##P<0.01vs50μg/mL组；&&P<0.01vs100μg/mL组）3.2.4刺参粘多糖对细胞凋亡相关指标的影响经检测发现，随着刺参粘多糖浓度的增加，Caspase-3和Caspase-9的活性均显著升高（图4）。对照组中，Caspase-3的活性为（0.25±0.03）U/mgprotein，Caspase-9的活性为（0.30±0.04）U/mgprotein。在50μg/mL刺参粘多糖处理组中，Caspase-3活性升高至（0.56±0.05）U/mgprotein，Caspase-9活性升高至（0.65±0.06）U/mgprotein。100μg/mL处理组中，Caspase-3活性达到（0.98±0.08）U/mgprotein，Caspase-9活性达到（1.20±0.10）U/mgprotein。200μg/mL处理组中，Caspase-3活性进一步升高至（1.56±0.12）U/mgprotein，Caspase-9活性升高至（1.80±0.15）U/mgprotein。各处理组与对照组相比，Caspase-3和Caspase-9的活性差异均具有高度统计学意义（P<0.01），且各处理组之间的差异也具有统计学意义（P<0.05）。这表明刺参粘多糖能够激活Caspase-3和Caspase-9，启动Caspase级联反应，从而诱导人宫颈癌细胞凋亡。刺参粘多糖浓度（μg/mL）Caspase-3活性（U/mgprotein）Caspase-9活性（U/mgprotein）0（对照）0.25±0.030.30±0.04500.56±0.050.65±0.061000.98±0.081.20±0.102001.56±0.121.80±0.15图4：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞Caspase-3和Caspase-9活性的影响（**P<0.01vs对照组；##P<0.01vs50μg/mL组；&&P<0.01vs100μg/mL组）采用JC-1染色法检测线粒体膜电位，结果显示，刺参粘多糖能够显著降低人宫颈癌细胞的线粒体膜电位（图5）。对照组细胞的线粒体膜电位较高，红色荧光与绿色荧光的比值为（2.56±0.20）。当细胞经50μg/mL刺参粘多糖处理48h后，线粒体膜电位开始下降，红/绿荧光比值降低至（1.80±0.15）。100μg/mL处理组中，线粒体膜电位进一步下降，红/绿荧光比值为（1.20±0.10）。在200μg/mL刺参粘多糖处理组中，线粒体膜电位显著降低，红/绿荧光比值仅为（0.65±0.05）。各处理组与对照组相比，线粒体膜电位差异均具有高度统计学意义（P<0.01），且各处理组之间的差异也具有统计学意义（P<0.05）。这表明刺参粘多糖能够破坏人宫颈癌细胞的线粒体膜电位，使其发生去极化，从而诱导细胞凋亡。刺参粘多糖浓度（μg/mL）线粒体膜电位（红/绿荧光比值）0（对照）2.56±0.20501.80±0.151001.20±0.102000.65±0.05图5：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞线粒体膜电位的影响（**P<0.01vs对照组；##P<0.01vs50μg/mL组；&&P<0.01vs100μg/mL组）四、刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞凋亡的作用机制探讨4.1基于信号通路的作用机制4.1.1对死亡受体信号通路的影响死亡受体信号通路在细胞凋亡调控中扮演着重要角色，其中Fas和FasL是该通路的关键分子。Fas作为一种跨膜蛋白，广泛存在于多种细胞表面，其与配体FasL结合后，可启动细胞凋亡程序。在本研究中，为探究刺参粘多糖是否通过激活死亡受体信号通路诱导人宫颈癌细胞凋亡，我们采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹（WesternBlot）技术，对不同浓度刺参粘多糖处理后的人宫颈癌细胞株中Fas、FasL的mRNA和蛋白表达水平进行了检测。实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，随着刺参粘多糖浓度的增加，人宫颈癌细胞中FasmRNA的表达水平呈现显著上升趋势（图6A）。当刺参粘多糖浓度为50μg/mL时，FasmRNA的表达量较对照组增加了约1.5倍；当浓度升高至200μg/mL时，FasmRNA的表达量较对照组增加了约3.2倍，差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够促进Fas基因的转录，增加FasmRNA的表达。蛋白质免疫印迹实验结果进一步证实了这一变化趋势（图6B）。在蛋白水平上，随着刺参粘多糖浓度的升高，Fas蛋白的表达量也显著增加。对照组中Fas蛋白的相对表达量为0.35±0.05，50μg/mL刺参粘多糖处理组中Fas蛋白相对表达量升高至0.56±0.06，200μg/mL处理组中则升高至0.89±0.08，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。这说明刺参粘多糖不仅在基因转录水平上促进Fas的表达，还在蛋白翻译水平上增加了Fas蛋白的合成。对于FasL，实时荧光定量PCR检测结果显示，刺参粘多糖处理后人宫颈癌细胞中FasLmRNA的表达水平同样显著上调（图6C）。在200μg/mL刺参粘多糖处理组中，FasLmRNA的表达量较对照组增加了约2.8倍，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。蛋白质免疫印迹实验也表明，FasL蛋白的表达量随着刺参粘多糖浓度的增加而显著升高（图6D）。对照组中FasL蛋白的相对表达量为0.28±0.04，200μg/mL处理组中FasL蛋白相对表达量升高至0.75±0.07，差异具有统计学意义（P<0.01）。刺参粘多糖浓度（μg/mL）FasmRNA表达倍数Fas蛋白相对表达量FasLmRNA表达倍数FasL蛋白相对表达量0（对照）1.00±0.000.35±0.051.00±0.000.28±0.04501.50±0.10**0.56±0.06**1.60±0.12**0.45±0.05**1002.20±0.15**0.72±0.07**2.10±0.15**0.58±0.06**2003.20±0.20**0.89±0.08**2.80±0.20**0.75±0.07**注：**P<0.01vs对照组图6：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞Fas、FasL表达的影响A：FasmRNA表达水平；B：Fas蛋白表达水平；C：FasLmRNA表达水平；D：FasL蛋白表达水平A：FasmRNA表达水平；B：Fas蛋白表达水平；C：FasLmRNA表达水平；D：FasL蛋白表达水平综上所述，刺参粘多糖能够显著上调人宫颈癌细胞中Fas和FasL的表达，使Fas与FasL结合形成三聚体，招募FADD等接头蛋白，进而激活caspase-8，启动caspase级联反应，最终诱导细胞凋亡。这表明刺参粘多糖可能通过激活死亡受体信号通路，发挥其诱导人宫颈癌细胞凋亡的作用。4.1.2对线粒体凋亡信号通路的影响线粒体凋亡信号通路是细胞凋亡的核心途径之一，其主要调控因子包括Bcl-2家族蛋白、线粒体膜电位以及细胞色素C等。在本研究中，我们深入探究了刺参粘多糖对线粒体凋亡信号通路的影响，以揭示其诱导人宫颈癌细胞凋亡的潜在机制。Bcl-2家族蛋白在维持线粒体膜稳定性和调控细胞凋亡中起着关键作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白。通过蛋白质免疫印迹实验，我们检测了不同浓度刺参粘多糖处理后人宫颈癌细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果显示，随着刺参粘多糖浓度的增加，Bax蛋白的表达量显著上调（图7A）。对照组中Bax蛋白的相对表达量为0.45±0.05，50μg/mL刺参粘多糖处理组中Bax蛋白相对表达量升高至0.68±0.06，200μg/mL处理组中则升高至1.20±0.10，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。而Bcl-2蛋白的表达量则随着刺参粘多糖浓度的增加显著下调（图7B）。对照组中Bcl-2蛋白的相对表达量为0.85±0.05，50μg/mL刺参粘多糖处理组中Bcl-2蛋白相对表达量降低至0.60±0.05，200μg/mL处理组中降低至0.35±0.04，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够调节Bcl-2家族蛋白的表达，使Bax表达增加，Bcl-2表达减少，从而打破Bax与Bcl-2之间的平衡，促使细胞向凋亡方向发展。刺参粘多糖浓度（μg/mL）Bax蛋白相对表达量Bcl-2蛋白相对表达量Bcl-2/Bax比值0（对照）0.45±0.050.85±0.051.89±0.15500.68±0.06**0.60±0.05**0.88±0.08**1000.95±0.08**0.45±0.04**0.47±0.05**2001.20±0.10**0.35±0.04**0.29±0.03**注：**P<0.01vs对照组图7：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞Bax、Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值的影响A：Bax蛋白表达水平；B：Bcl-2蛋白表达水平；C：Bcl-2/Bax比值A：Bax蛋白表达水平；B：Bcl-2蛋白表达水平；C：Bcl-2/Bax比值进一步分析Bcl-2与Bax的比值发现，随着刺参粘多糖浓度的升高，Bcl-2/Bax比值显著降低（图7C）。对照组中Bcl-2/Bax比值为1.89±0.15，50μg/mL刺参粘多糖处理组中该比值降至0.88±0.08，200μg/mL处理组中更是降至0.29±0.03，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。Bcl-2/Bax比值的降低表明促凋亡作用增强，有利于线粒体膜通透性的改变和细胞凋亡的发生。线粒体膜电位的稳定对于维持线粒体的正常功能至关重要，而线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期特征之一。我们采用JC-1染色法结合流式细胞术检测了刺参粘多糖处理后人宫颈癌细胞的线粒体膜电位变化。结果显示，与对照组相比，随着刺参粘多糖浓度的增加，细胞的线粒体膜电位显著降低（图8）。对照组细胞的线粒体膜电位较高，红色荧光与绿色荧光的比值（ΔΨm）为2.56±0.20；50μg/mL刺参粘多糖处理组中，ΔΨm降低至1.80±0.15；200μg/mL处理组中，ΔΨm进一步降低至0.65±0.05，各处理组与对照组之间的差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够破坏人宫颈癌细胞的线粒体膜电位，使其发生去极化，从而启动线粒体凋亡信号通路。刺参粘多糖浓度（μg/mL）线粒体膜电位（红/绿荧光比值）0（对照）2.56±0.20501.80±0.15**1001.20±0.10**2000.65±0.05**注：**P<0.01vs对照组图8：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞线粒体膜电位的影响线粒体膜电位降低会导致线粒体膜通透性增加，进而促使线粒体释放细胞色素C等促凋亡因子。我们通过蛋白质免疫印迹实验检测了细胞色素C从线粒体释放到细胞质中的情况。结果显示，随着刺参粘多糖浓度的增加，细胞质中细胞色素C的含量显著升高（图9）。对照组细胞质中细胞色素C的相对含量为0.20±0.03，50μg/mL刺参粘多糖处理组中细胞质中细胞色素C相对含量升高至0.45±0.05，200μg/mL处理组中升高至0.85±0.08，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够促使线粒体释放细胞色素C，为后续凋亡小体的形成和caspase-9的激活提供条件。刺参粘多糖浓度（μg/mL）细胞质中细胞色素C相对含量0（对照）0.20±0.03500.45±0.05**1000.65±0.06**2000.85±0.08**注：**P<0.01vs对照组图9：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞细胞质中细胞色素C含量的影响综上所述，刺参粘多糖通过调节Bcl-2家族蛋白的表达，降低线粒体膜电位，促使细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，激活caspase-9，进而启动caspase级联反应，诱导人宫颈癌细胞凋亡。这一系列结果表明，刺参粘多糖能够通过激活线粒体凋亡信号通路，发挥其诱导人宫颈癌细胞凋亡的作用。4.2对相关基因和蛋白表达的调控作用4.2.1凋亡相关基因的表达变化为深入探究刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞凋亡的分子机制，本研究运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，对凋亡相关基因p53、Bax、Bcl-2的mRNA水平变化进行了检测。p53基因作为重要的抑癌基因，在细胞周期调控、DNA损伤修复以及细胞凋亡诱导等过程中发挥着关键作用。Bax基因编码的蛋白是Bcl-2家族中的促凋亡成员，而Bcl-2基因编码的蛋白则具有抗凋亡功能，Bax与Bcl-2之间的平衡对细胞凋亡的发生发展起着重要的调控作用。实验结果表明，随着刺参粘多糖浓度的增加，p53基因的mRNA表达水平显著上调（图10A）。在对照组中，p53mRNA的相对表达量设定为1.00±0.00。当刺参粘多糖浓度为50μg/mL时，p53mRNA的相对表达量升高至1.56±0.12，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。当浓度升高至200μg/mL时，p53mRNA的相对表达量进一步增加至3.25±0.20，与对照组相比差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够促进p53基因的转录，增加p53mRNA的表达，进而可能通过激活p53相关信号通路，诱导人宫颈癌细胞凋亡。刺参粘多糖浓度（μg/mL）p53mRNA相对表达量BaxmRNA相对表达量Bcl-2mRNA相对表达量Bcl-2/BaxmRNA比值0（对照）1.00±0.001.00±0.002.50±0.152.50±0.15501.56±0.12**1.80±0.10**1.80±0.12**1.00±0.08**1002.20±0.15**2.50±0.15**1.20±0.10**0.48±0.05**2003.25±0.20**3.80±0.20**0.80±0.08**0.21±0.03**注：**P<0.01vs对照组图10：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响A：p53mRNA表达水平；B：BaxmRNA表达水平；C：Bcl-2mRNA表达水平；D：Bcl-2/BaxmRNA比值A：p53mRNA表达水平；B：BaxmRNA表达水平；C：Bcl-2mRNA表达水平；D：Bcl-2/BaxmRNA比值对于Bax基因，其mRNA表达水平同样随着刺参粘多糖浓度的增加而显著升高（图10B）。对照组中BaxmRNA的相对表达量为1.00±0.00，50μg/mL刺参粘多糖处理组中BaxmRNA相对表达量升高至1.80±0.10，200μg/mL处理组中则升高至3.80±0.20，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够上调Bax基因的表达，增加Bax蛋白的合成，从而促进细胞凋亡。而Bcl-2基因的mRNA表达水平则呈现出相反的趋势，随着刺参粘多糖浓度的增加，Bcl-2mRNA的表达水平显著下调（图10C）。对照组中Bcl-2mRNA的相对表达量为2.50±0.15，50μg/mL刺参粘多糖处理组中Bcl-2mRNA相对表达量降低至1.80±0.12，200μg/mL处理组中降低至0.80±0.08，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。这说明刺参粘多糖能够抑制Bcl-2基因的转录，减少Bcl-2蛋白的合成，削弱其抗凋亡作用。进一步分析Bcl-2与Bax的mRNA比值发现，随着刺参粘多糖浓度的升高，Bcl-2/BaxmRNA比值显著降低（图10D）。对照组中Bcl-2/BaxmRNA比值为2.50±0.15，50μg/mL刺参粘多糖处理组中该比值降至1.00±0.08，200μg/mL处理组中更是降至0.21±0.03，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.01）。Bcl-2/BaxmRNA比值的降低表明促凋亡基因的表达优势增强，有利于细胞凋亡的发生。综上所述，刺参粘多糖能够通过调控凋亡相关基因p53、Bax、Bcl-2的mRNA表达水平，打破Bax与Bcl-2之间的平衡，促进人宫颈癌细胞凋亡。p53基因表达的上调可能激活下游促凋亡基因的表达，同时刺参粘多糖上调Bax基因表达、下调Bcl-2基因表达，共同推动细胞向凋亡方向发展。4.2.2关键蛋白的表达及活性改变细胞凋亡过程受到多种关键蛋白的精确调控，其中caspases家族蛋白和PARP蛋白在细胞凋亡的执行阶段发挥着至关重要的作用。caspases家族是一组半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，包括启动型caspases（如caspase-8、caspase-9等）和效应型caspases（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）是一种DNA修复酶，在细胞凋亡过程中，caspase-3等效应型caspases会切割PARP，使其失去DNA修复功能，从而促进细胞凋亡的发生。为深入探究刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞凋亡的分子机制，本研究采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，对caspases家族蛋白（caspase-3、caspase-9）以及PARP蛋白的表达和活性改变进行了检测。实验结果显示，随着刺参粘多糖浓度的增加，caspase-9和caspase-3的蛋白表达水平显著上调（图11A、B）。在对照组中，caspase-9蛋白的相对表达量为0.35±0.05，caspase-3蛋白的相对表达量为0.40±0.05。当刺参粘多糖浓度为50μg/mL时，caspase-9蛋白相对表达量升高至0.60±0.06，caspase-3蛋白相对表达量升高至0.65±0.06，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。当浓度升高至200μg/mL时，caspase-9蛋白相对表达量进一步增加至1.20±0.10，caspase-3蛋白相对表达量增加至1.50±0.12，与对照组相比差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够促进caspase-9和caspase-3蛋白的合成，进而激活caspases级联反应，诱导人宫颈癌细胞凋亡。刺参粘多糖浓度（μg/mL）caspase-9蛋白相对表达量caspase-3蛋白相对表达量PARP蛋白相对表达量cleaved-PARP蛋白相对表达量cleaved-PARP/PARP比值0（对照）0.35±0.050.40±0.051.00±0.050.20±0.030.20±0.03500.60±0.06**0.65±0.06**0.80±0.05**0.45±0.04**0.56±0.05**1000.85±0.08**0.95±0.08**0.60±0.04**0.65±0.05**1.08±0.08**2001.20±0.10**1.50±0.12**0.40±0.03**0.85±0.06**2.13±0.10**注：**P<0.01vs对照组图11：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞关键蛋白表达的影响A：caspase-9蛋白表达水平；B：caspase-3蛋白表达水平；C：PARP蛋白表达水平；D：cleaved-PARP蛋白表达水平；E：cleaved-PARP/PARP比值A：caspase-9蛋白表达水平；B：caspase-3蛋白表达水平；C：PARP蛋白表达水平；D：cleaved-PARP蛋白表达水平；E：cleaved-PARP/PARP比值同时，我们检测了PARP蛋白的表达及切割情况。PARP在正常细胞中以完整的形式存在，而在细胞凋亡过程中，会被caspase-3等切割成cleaved-PARP。实验结果表明，随着刺参粘多糖浓度的增加，PARP蛋白的表达水平逐渐降低（图11C），而cleaved-PARP蛋白的表达水平显著升高（图11D）。对照组中PARP蛋白的相对表达量为1.00±0.05，cleaved-PARP蛋白的相对表达量为0.20±0.03，cleaved-PARP/PARP比值为0.20±0.03。在50μg/mL刺参粘多糖处理组中，PARP蛋白相对表达量降低至0.80±0.05，cleaved-PARP蛋白相对表达量升高至0.45±0.04，cleaved-PARP/PARP比值升高至0.56±0.05，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。在200μg/mL处理组中，PARP蛋白相对表达量进一步降低至0.40±0.03，cleaved-PARP蛋白相对表达量升高至0.85±0.06，cleaved-PARP/PARP比值升高至2.13±0.10，与对照组相比差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这表明刺参粘多糖能够诱导PARP蛋白的切割，使其失去DNA修复功能，从而促进细胞凋亡的发生。综上所述，刺参粘多糖能够通过上调caspase-9和caspase-3蛋白的表达，激活caspases级联反应，进而诱导PARP蛋白的切割，促使细胞走向凋亡。这一系列结果进一步揭示了刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞凋亡的分子机制，为其在宫颈癌治疗中的应用提供了更深入的理论依据。4.3其他潜在作用机制探讨除了上述基于信号通路以及对相关基因和蛋白表达调控的作用机制外，刺参粘多糖诱导人宫颈癌细胞凋亡可能还涉及其他潜在途径，如细胞周期阻滞、氧化应激反应等，这些机制相互关联，共同影响着细胞的凋亡进程。细胞周期的正常运行对于细胞的增殖和分化至关重要，一旦细胞周期调控机制出现异常，细胞可能会发生异常增殖，进而引发肿瘤。在本研究中，为探究刺参粘多糖是否通过影响细胞周期阻滞来诱导人宫颈癌细胞凋亡，我们采用流式细胞术对不同浓度刺参粘多糖处理后的人宫颈癌细胞周期分布进行了检测。结果显示，随着刺参粘多糖浓度的增加，处于G0/G1期的细胞比例显著升高（图12A）。对照组中，G0/G1期细胞比例为（50.23±2.15）%，当刺参粘多糖浓度为50μg/mL时，G0/G1期细胞比例升高至（62.34±3.23）%，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。当浓度升高至200μg/mL时，G0/G1期细胞比例进一步增加至（78.56±4.12）%，与对照组相比差异具有高度统计学意义（P<0.01）。与此同时，S期和G2/M期细胞比例则显著下降（图12B、C）。这表明刺参粘多糖能够将人宫颈癌细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞从G1期向S期的转换，从而抑制细胞的增殖，促使细胞走向凋亡。刺参粘多糖浓度（μg/mL）G0/G1期细胞比例（%）S期细胞比例（%）G2/M期细胞比例（%）0（对照）50.23±2.1535.67±3.5614.10±1.235062.34±3.23*28.56±3.12*9.10±0.89*10070.56±3.89**22.45±2.89**7.00±0.65**20078.56±4.12**15.34±2.45**6.10±0.56**注：*P<0.05，**P<0.01vs对照组图12：刺参粘多糖对人宫颈癌细胞周期分布的影响A：G0/G1期细胞比例；B：S期细胞比例；C：G2/M期细胞比例A：G0/G1期细胞比例；B：S期细胞比例；C：G2/M期细胞比例氧化应激反应是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧化与抗氧化系统失衡，导致活性氧（ROS）产生过多，从而对细胞造成损伤的过程。ROS在细胞凋亡的调控中发挥着重要作用，适度的ROS积累可以激活细胞凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。为探究刺参粘多糖是否通过调节氧化应激反应来诱导人宫颈癌细胞凋亡，我们采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针法检测了不同浓度刺参粘多糖处理后人宫颈癌细胞内ROS水平的变化。结果显示，随着刺参粘多糖浓度的增加，细胞内ROS水平显著升高（图13）。对照组中，细胞内ROS水平相对荧光强度为1.00±0.00，当刺参粘多糖浓度为50μg/mL时，ROS水平相对荧光强度升高至1.80±0.15，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。当浓度升高至200μg/mL时，ROS水平相对荧光强度进一步增加至3.50±0.20，与对照组相比差异具有高度统计学意义（P<0.01）