（正式版）DB15∕T 1900-2020 《过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程》

DB15Technicalregulationsforestablishmentofhydrogenperoxide-inducedoxidativedamagemodelofbovinemammaryepithelialcells2020-06-10发布内蒙古自治区市场监督管理局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC1过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程本标准规定了过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构本标准适用于采用过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞产生氧化损伤模型原代细胞培养primarycell将乳腺上皮细胞在模拟体内生存环境中进行培养，使细胞生长超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、4℃离心机、4℃冰箱、-20℃冰箱、0.22μm过滤器、25cm2细胞培养瓶、90mm细胞培养皿、15DMEM/F12培养基、10%胎牛血清、双抗、5%胰岛素转铁蛋白硒钠、氢化可的松、两性霉素B、30%过氧化氢、甲醇、高压灭菌超纯水、0.4%台盼蓝、75%酒精、新洁尔灭、0.25%胰酶山羊血清、兔抗细胞角蛋白（cytokeratin）18单克隆抗体、山羊抗兔DAPI染液、四氮唑蓝盐化合物（MTS）、细胞裂解液、活性氧（ROS）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、12超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘谷胱甘肽巯基转移酶（GST）试剂盒、乳酸脱氢酶（谷氨酰胺1.5mL加入86.74mL的DMEM/F12培养基中，0.22μm滤器过滤，密封素B100µL、10ng/mL表皮生长因子10µL、50μg/mL催乳素50µL、200mmol/LL-谷氨酰胺1.5mL加入96.74mL的DMEM/F12培养基中，0.将10%胎牛血清10mL加入90mLDMEM/F12培养基中，0.22将1mg两性霉素溶于10mL无菌超纯水中，0.2将0.2mg表皮生长因子溶于20mLDMEM/F12培养基中，充分混将250IU的催乳素（按25IU/mg转换）溶于1mLDMEM/F12培养基中，配制成浓度为10mg/mL的浓贮，取100μL10mg/mL浓贮溶于20mLDMEM/F12培养基中将5mL双抗加入500mLPBS中，0.22μm滤器过滤，密封分将15mL双抗加入500mLPBS中，0.在1mLH2O2中加入8mL高压灭菌超纯水稀释到9mL，配制成浓度为1mol/L（1000mmol/L）的H2O25.3.12过氧化氢工作液配制（60H2O2工作液，0.22μm滤器过滤，-20℃保存，每次换液时现配。采用AlexaFluor488标记的山羊抗兔免疫球蛋白G，-20色乳汁的健康奶牛乳腺组织约200g，立即装入干净样品袋36.2.2将采集的乳腺样品放入已灭6.3.2关闭超净台紫外照射灯，打开超净6.3.3将浸泡后的乳腺组织移至超净台内，依次用含3%双抗的PBS清洗三遍，75%酒精浸泡30s，含1%双抗的PBS清洗三遍，然后将乳腺组织放入一无菌90mm细胞培养皿中，用眼科镊子和剪刀剪去6.3.4将呈糊状的乳腺组织块吸移至），4将生长良好的第三代细胞消化下来，计数后分别制成0.5×104个/mL、1.0×104个/mL、2.0×104个培养24h后，用0.25%胰酶消化24孔板中0.5×104个/mL、1×104个/mL、2×104个/mL的3孔细胞，分别制成1mL细胞悬液并计数。以后每隔24h计数一次，连续8d，未计数细胞组每26.7.8再用PBS缓冲液冲洗3次，5min/次，荧光倒置显微5将传第三代奶牛乳腺上皮细胞使用完全培养基悬浮，并以2×105个/mL或2×104个/mL密度分别接种7.2过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞8过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤在倒置显微镜下观察，当奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤数量达20%8.2氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞增殖率测将乳腺上皮细胞制成细胞悬液，浓度为2×104将96孔板放入酶标仪中中速摇动10min，490nm读取吸光度（OD）值，OD值范围为0.20～0.25。8.2.7氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞8.3氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化-抗氧化指68.3.1氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化-抗600μmol/L的H2O2作用于乳腺上皮细胞6h后，弃上清，抽取1mLPBS清洗每孔内贴壁生长上皮细胞2次，弃去上清液，每孔加入200