Cap43：镍接触肺癌潜在肿瘤标志物的深度剖析与展望

Cap43：镍接触肺癌潜在肿瘤标志物的深度剖析与展望一、引言1.1研究背景1.1.1肺癌的严峻现状肺癌，作为全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，对人类健康构成了极其严重的威胁。根据世界卫生组织（WHO）发布的数据，2012年全球新发肺癌病例数高达182.5万，占所有肿瘤发病率的13.0％，肺癌死亡数为159万，占所有肿瘤死亡率的19.4％，发病率和死亡率均居首位。在我国，肺癌同样是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，每年新发肺癌人数约为73万，死亡人数约60万，我国肺癌患者的发病人数和死亡人数约占全世界肺癌发病人数和死亡人数的三分之一。肺癌的生存率受多种因素影响，如肺癌的分期、病理类型、治疗时间、治疗方法、转移情况以及患者的身体状况、心理状态等。通常情况下，隐性肺癌若能在早期得到治疗，有可能获得痊愈；接受外科手术治疗的I期非小细胞肺癌患者，其5年生存率可达45%-65%；而局灶、局部转移、远处转移的患者5年相对生存率分别为52%、24%以及4%。在病理分型方面，鳞癌的预后相对较好，生存率较高，生存时间相对较长，腺癌次之，未分化的小细胞肺癌预后则较差。1.1.2镍接触与肺癌的关联镍是人类在职业和环境中广泛接触的一种金属元素，同时也是动物必需的微量元素之一。然而，大量的人群流行病学调查和动物实验均已确凿证实，镍的职业性接触会显著增加患癌风险，其中主要就是肺癌。国际癌症研究中心（IARC）早在1990年就将镍及其化合物列为第一类致癌物，在各类镍化合物中，尤以镍尘致癌性最强，其次为氧化镍。近年来，随着含镍产品的广泛使用，镍在生产、再利用以及处理的各个阶段都不可避免地导致了环境的污染。人类在工作和生活中与镍及其化合物广泛接触，使得大量镍和镍的化合物通过职业和环境接触沉积于体内，进而对人类健康产生危害。例如，在一些镍矿开采、冶炼以及镍制品加工等行业，工人长期暴露在高浓度的镍环境中，其患肺癌的风险远远高于普通人群。相关研究表明，长期接触镍化合物的人群，其患肺癌的风险是普通人群的数倍甚至数十倍。接触镍还可能导致鼻咽癌、食道癌、胃癌等多种恶性肿瘤，对人体健康造成多方面的威胁。1.1.3肿瘤标志物在肺癌诊疗中的重要性肿瘤标志物在肺癌的诊疗过程中发挥着至关重要的作用。它不仅可以用于肺癌的早期诊断，帮助医生在疾病的早期阶段发现病变，提高患者的治愈率和生存率，还能用于病情监测，及时了解肿瘤的发展情况和治疗效果，为调整治疗方案提供依据，同时对于预后评估也具有重要意义，能够帮助医生和患者了解疾病的发展趋势和患者的生存预期。目前临床上常用的肺癌肿瘤标志物包括癌胚抗原（CEA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）、人细胞角蛋白21-1片段（CA21-1）、糖类抗原19-9（CA199）等。CEA在45%的肺癌患者中存在升高现象，但一般在肿瘤中晚期才会显著升高，可用于评估预后和复发监测；NSE在小细胞肺癌中常有过量表达，对小细胞肺癌诊断的敏感性约80%，特异性约80%-90%，主要用于小细胞肺癌患者的疗效观察和复发监测；SCC是鳞状上皮癌的重要标志物，其升高程度与肿瘤恶性程度密切相关；CA21-1对于非小细胞肺癌的早期诊断以及疗效观察有重要意义，其诊断灵敏度可达60%，特异性可达95%。然而，这些现有肿瘤标志物对于肺癌诊断的特异性较差，在临床诊断中必须结合影像学和病理检查等手段，才能做出准确的诊断。因此，寻找一种高特异性的肺癌肿瘤标志物迫在眉睫，对于提高肺癌的诊疗水平具有重要的现实意义。1.2Cap43作为肿瘤标志物的研究意义1.2.1Cap43的独特生物学特性Cap43基因，又称N-myc下游调节基因1（NDRG1），最初是在研究镍化合物暴露致癌机制中被发现的。该基因定位于人类染色体8q24，全长为47156bp，拥有15个外显子和14个内含子，编码3000bp的mRNA。其mRNA的3’端存在1759bp的非翻译区，开放阅读框能够编码394个氨基酸残基，所形成的蛋白质相对分子质量为43000，等电点为5.3，故而被命名为Cap43。Cap43蛋白具有一些独特的结构特点。它没有富含半胱氨酸、组氨酸的金属结合位点，但在羧基端存在一个含10个氨基酸残基的重复序列（TRSRSHTSEG），该序列重复了3次，通过Findpatterns计算机分析软件在所有数据库中除其同源蛋白序列外未发现相同序列，这表明Cap43属于新的基因家族。此外，Cap43蛋白富含丝氨酸和苏氨酸（16%），这些氨基酸是蛋白激酶的良好底物，蛋白上存在3个蛋白激酶C的蛋白磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ位点和1个酪氨酸激酶位点，这些结构特点暗示了Cap43蛋白可能参与复杂的信号传导过程。在表达模式上，Cap43基因普遍存在于人类心脏、脑、肺、肝、骨骼肌、肾脏和胰腺等组织，但Cap43蛋白在正常组织中表达量很低，而在多种肿瘤组织，如肺、脑、肝脏、前列腺、乳腺、肾等部位肿瘤以及黑色素瘤中表达上调。例如，在正常肺组织中，Cap43蛋白可能仅有微弱表达，但在肺癌组织中，其表达水平可能会显著升高，这种在正常和肿瘤组织中的表达差异，使得Cap43具备成为肿瘤标志物的潜力。1.2.2对镍接触肺癌早期诊断的潜在价值对于镍接触人群而言，肺癌的早期诊断至关重要。由于镍接触会显著增加患肺癌的风险，而早期肺癌患者往往缺乏明显的临床症状，等到出现症状时，疾病可能已经进展到中晚期，错过了最佳治疗时机。因此，寻找一种能够早期检测镍接触人群肺癌风险的标志物迫在眉睫。Cap43在这方面展现出了潜在的价值。研究表明，镍化合物可诱导Cap43基因的表达，长期接触镍的人群，其体内细胞可能因镍的作用而使Cap43表达发生变化。通过检测血清或组织中的Cap43水平，有可能在肺癌的早期阶段发现异常。与传统的肺癌筛查方法如胸部X线、CT等相比，检测Cap43具有一些独特的优势。胸部X线对于早期肺癌的敏感度较低，容易漏诊；CT虽然敏感度较高，但存在辐射风险，且费用相对较高，不适合大规模的早期筛查。而检测Cap43可以通过简单的血液检测或组织活检进行，操作相对简便，成本较低，更易于在镍接触人群中进行大规模筛查，有助于早期发现肺癌风险，提高患者的治愈率和生存率。1.2.3为肺癌个性化治疗提供新思路在精准医疗时代，个性化治疗对于提高肺癌患者的治疗效果和生活质量具有重要意义。Cap43的研究为镍接触肺癌患者的个性化治疗方案制定提供了新的参考依据。不同患者的肿瘤细胞中Cap43的表达水平和相关信号通路可能存在差异，这些差异会影响肿瘤的生长、转移和对治疗的反应。例如，高表达Cap43的肺癌细胞可能对某些化疗药物具有不同的敏感性，或者在靶向治疗中表现出独特的反应。通过检测患者肿瘤组织中Cap43的表达情况以及相关信号通路的活性，医生可以更准确地了解肿瘤的生物学特性，从而为患者量身定制个性化的治疗方案。对于Cap43高表达且与特定信号通路相关的患者，可以选择针对该信号通路的靶向药物进行治疗，提高治疗的精准性和有效性，减少不必要的治疗副作用，为镍接触肺癌患者的治疗带来新的希望，推动肺癌治疗向更加精准、个性化的方向发展。二、Cap43的生物学特性2.1Cap43基因的发现与结构2.1.1发现历程Cap43基因的发现源于对镍化合物暴露致癌机制的深入研究。在20世纪90年代，大量的流行病学研究明确指出，镍化合物暴露与呼吸道肿瘤，尤其是肺癌和鼻咽癌的发生有着极为显著的相关性。动物实验也进一步证实，通过接触、口服或注射镍化合物能够诱发肿瘤的产生。科研人员深知，要深入理解镍化合物致癌的内在机制，关键在于探究其对基因表达的影响。1998年，Salnikow等科研人员采用了差异条带显示技术，这是一种能够有效分离和鉴定不同细胞或组织中差异表达基因的方法。他们将研究对象聚焦于人支气管肺泡上皮细胞A549，将其与镍化合物共同培养。在培养过程中，细胞受到镍化合物的作用，其基因表达谱发生了变化。通过差异条带显示技术的细致分析，研究人员成功地从这些细胞中分离得到了一段全新的基因序列。经过一系列的鉴定和研究，他们确定这是一个新基因，并将其命名为cap43基因。这一发现为后续深入研究镍化合物致癌机制以及Cap43基因的功能奠定了坚实的基础。2.1.2基因定位与结构组成Cap43基因在人类基因组中占据着独特的位置，它定位于人类染色体8q24。这一区域包含了众多与细胞生长、分化和调控相关的基因，Cap43基因在此区域的存在暗示着它在细胞生命活动中可能扮演着重要角色。其基因全长为47156bp，拥有15个外显子和14个内含子。外显子是基因中能够编码蛋白质的区域，它们在基因转录后会被拼接在一起，形成成熟的mRNA，进而指导蛋白质的合成；而内含子则是位于外显子之间的非编码区域，虽然它们不直接参与蛋白质的编码，但在基因表达调控等过程中发挥着重要作用。Cap43基因能够编码3000bp的mRNA，其mRNA的3’端存在1759bp的非翻译区。非翻译区虽然不参与蛋白质的编码，但它含有多种调控元件，能够影响mRNA的稳定性、翻译效率以及在细胞内的定位等。开放阅读框编码394个氨基酸残基，这些氨基酸按照特定的顺序排列，形成了具有特定结构和功能的Cap43蛋白，该蛋白相对分子质量为43000，等电点为5.3。这种独特的基因结构和编码方式，决定了Cap43基因和蛋白的特殊性质，为其在细胞内的功能发挥提供了结构基础。2.1.3进化保守性在生物进化的漫长历程中，Cap43基因展现出了高度的保守性，人鼠Cap43基因具有高度同源性。小鼠同源基因分别在1997年和1999年被发现，并命名为TDD5和Ndr1，这表明Cap43基因在进化过程中经历了长时间的筛选和保留，其基本的结构和功能在不同物种间得以维持。这种保守性意味着Cap43基因所编码的蛋白可能在生物的基本生理过程中发挥着不可或缺的作用。从进化的角度来看，保守基因通常参与了细胞的基础代谢、生长发育、信号传导等重要过程。Cap43基因的保守性暗示着它在维持细胞正常生理功能方面具有重要意义。在不同物种中，尽管生物的形态、生理特征等可能存在很大差异，但Cap43基因的高度同源性说明其在细胞层面执行着相似的功能。这也为科研人员利用小鼠等模式生物来研究Cap43基因的功能提供了理论依据，通过对小鼠Cap43基因的研究，可以在一定程度上推断人类Cap43基因的功能和作用机制，为深入理解Cap43基因在人类健康和疾病中的作用提供了便利。2.2Cap43蛋白的结构与功能2.2.1氨基酸序列与分子量Cap43蛋白由其基因的开放阅读框编码，包含394个氨基酸残基。这些氨基酸通过肽键相互连接，形成了一条特定的线性序列，这一序列是Cap43蛋白发挥其生物学功能的基础。不同氨基酸的种类、数量以及排列顺序决定了蛋白的一级结构，进而影响其高级结构和功能特性。其相对分子质量为43000，这一分子量是通过对其氨基酸组成和序列的分析，结合相关的计算方法得出的。在蛋白质的研究中，分子量是一个重要的参数，它可以反映蛋白质的大小和复杂程度。例如，一些小分子蛋白质可能只有几千的分子量，而像Cap43这样相对较大的蛋白质，其分子量的大小与它在细胞内执行的功能密切相关。较大的分子量可能意味着它具有更复杂的结构域和功能位点，能够参与更多的生物化学反应和细胞过程。2.2.2特殊结构域Cap43蛋白在羧基端存在一个独特的结构特征，即含有10个氨基酸残基的重复序列（TRSRSHTSEG），且这一序列重复了3次。这种重复序列在蛋白质结构中较为少见，通过Findpatterns计算机分析软件在所有数据库中除其同源蛋白序列外未发现相同序列，这表明Cap43属于新的基因家族。这种特殊的重复序列可能在Cap43蛋白的功能中发挥着重要作用。它可能影响蛋白质的折叠方式，从而形成独特的三维结构，为蛋白与其他分子的相互作用提供特定的界面。一些蛋白质中的重复序列可以参与蛋白质-蛋白质相互作用，通过与其他蛋白的特定区域结合，调节信号传导通路或参与蛋白质复合物的形成。重复序列还可能影响蛋白质的稳定性，使其在细胞内能够保持相对稳定的状态，以持续发挥其生物学功能。与其他常见蛋白相比，Cap43蛋白的这一特殊结构域使其区别于大多数已知蛋白，为深入研究其独特的生物学功能和作用机制提供了重要线索。2.2.3蛋白功能推测Cap43蛋白富含丝氨酸和苏氨酸，其含量高达16%，这些氨基酸是蛋白激酶的良好底物。同时，蛋白上存在3个蛋白激酶C的蛋白磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ位点和1个酪氨酸激酶位点，这些结构特点暗示了Cap43蛋白可能在细胞信号传导中扮演重要角色。蛋白激酶可以催化蛋白质的磷酸化反应，这是细胞信号传导过程中的关键步骤。当细胞接收到外界信号时，蛋白激酶被激活，它们可以识别并结合到含有特定氨基酸序列的底物蛋白上，将磷酸基团添加到底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，从而改变底物蛋白的活性、构象或与其他分子的相互作用能力。Cap43蛋白上丰富的蛋白激酶位点表明，它可能受到多种蛋白激酶的调控，参与多条信号传导通路。在细胞受到生长因子刺激时，蛋白激酶C可能被激活，进而磷酸化Cap43蛋白上的相应位点，引发一系列的信号传导事件，调节细胞的生长、增殖、分化等生理过程。Cap43蛋白可能通过与其他信号分子相互作用，传递和放大细胞信号，对细胞的生理功能进行精细调控，在维持细胞内环境稳定和细胞正常生理活动中发挥不可或缺的作用。2.3Cap43基因的表达调控机制2.3.1镍化合物的诱导作用镍化合物在Cap43基因的表达调控中扮演着重要角色，其对Cap43基因表达的诱导呈现出时间剂量依赖性。研究表明，当细胞暴露于镍化合物中时，随着镍化合物作用时间的延长和剂量的增加，Cap43基因的表达水平也会相应升高。在一项针对人支气管肺泡上皮细胞A549的研究中，科研人员将细胞分别暴露于不同浓度的镍化合物中，并在不同时间点检测Cap43基因的表达情况。结果发现，在低浓度镍化合物作用下，Cap43基因的表达在较短时间内仅有轻微升高；随着镍化合物浓度的逐渐增加以及作用时间延长至24小时、48小时，Cap43基因的mRNA和蛋白表达水平均显著上升，呈现出明显的正相关关系。这表明镍化合物能够有效诱导Cap43基因的表达，且这种诱导作用在一定范围内随着时间和剂量的增加而增强。从致癌过程的角度来看，镍化合物诱导Cap43表达可能是其致癌的重要机制之一。长期接触镍化合物会使细胞内Cap43持续高表达，进而影响细胞的正常生理功能。Cap43可能通过参与细胞信号传导通路，干扰细胞的增殖、分化和凋亡过程。正常细胞的增殖和凋亡处于动态平衡状态，以维持组织和器官的正常功能。当Cap43高表达时，可能激活某些促进细胞增殖的信号通路，同时抑制细胞凋亡相关信号通路，使得细胞异常增殖，无法正常凋亡，从而逐渐发展为肿瘤细胞。2.3.2细胞内游离钙离子的调节作用细胞内游离钙离子在Cap43基因表达调控中占据着关键地位，其升高对Cap43基因表达具有显著的促进作用。镍化合物作为一种强钙离子通道阻断剂，本身并不直接与Cap43蛋白结合，但却能通过阻断细胞膜钙离子通道，导致细胞内游离钙离子浓度升高，进而诱导Cap43基因表达。研究人员通过实验证实了这一机制。将组织细胞与无毒水平的水溶性和不溶性镍化合物共同孵育，成功克隆出Cap43基因，并深入研究了镍化合物诱导该基因转录、表达的机制，发现钙离子实际上是镍化合物诱导Cap43基因表达的第二信使。为了进一步验证这一结论，研究人员应用特殊的钙离子鳌合物BAPTA-AM，结果发现其可显著减低Cap43表达，这明确提示细胞内钙离子升高是Cap43转录、表达的关键环节。而重金属鳌合物TPEN，虽然与镍有很高的亲和力，但对钙离子亲和力较低，它并不能降低镍和钙离子所致的Cap43表达，这进一步表明细胞内钙离子升高是诱导Cap43表达的主要因素。此外，采用荧光探针Fluo-3AM直接测量与镍化合物共同孵育的细胞内钙离子水平，发现细胞内游离钙离子水平显著增高，从实验层面直观地证实了细胞内游离钙离子与Cap43基因表达之间的紧密联系。2.3.3信号传导途径的参与多种信号传导途径参与了Cap43基因表达的调控，其中PI3K/Akt/mTOR信号传导通路尤为关键。当细胞受到生长因子等刺激时，细胞内PI3K（磷脂酰肌醇-3羟基激酶）被活化。PI3K是一个酯酶，其上游存在着RTKs（受体酪氨酸激酶）/Ras（大鼠肉瘤，原癌基因C-ras的表达产物）信号通路。活化的PI3K进而磷酸化其底物PIP2（3,4-二磷酸磷脂酰肌醇），使其转化为PIP3（3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇），PIP3可以活化下游的Akt（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称PKB，蛋白激酶B）。Akt通过血小板-白细胞C激酶同源区和PIP3结合，并在PDK1、PDK2（磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶）的作用下，使第308位上的苏氨酸位点（Thr308）和第473位上的丝氨酸位点（Ser473）磷酸化而被激活。活化的PI3K/Akt可能通过TSC1/TSC2复合物进一步激活其下游分子mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶向基因，又称FRAP，FK506-bindingprotein2andrapamycinassociatedprotein）。mTOR是一种不典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，由于其羧基末端与PI3K催化区高度同源，被认为是PI3K相关的蛋白激酶家族成员。mTOR可随后磷酸化它的两个下游分子，即翻译抑制分子eIF-4E（真核翻译起始因子4E）结合蛋白1（4E-BP1）和p70S6K，磷酸化后激活其功能，促进蛋白质的合成。在Cap43基因表达调控中，PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活可能会促进Cap43基因的转录和翻译过程，从而增加Cap43蛋白的表达。除了PI3K/Akt/mTOR信号通路，其他信号传导通路也可能参与其中，并且各通路之间存在着复杂的相互作用。在细胞内，不同的信号通路可能通过共享某些信号分子或调节因子，形成一个复杂的信号网络。一条信号通路的激活或抑制可能会影响其他信号通路的活性，进而共同调节Cap43基因的表达，这种相互作用使得细胞对环境变化和刺激能够做出精确而协调的反应，也增加了Cap43基因表达调控机制的复杂性。三、镍接触与肺癌的关系3.1镍的理化性质与接触途径3.1.1镍的基本理化性质镍是一种化学元素，化学符号为Ni，原子序数为28，位于元素周期表中的第四周期Ⅷ族，属过渡金属元素。其单质呈银白色，具有金属光泽，硬而柔韧，拥有良好的延展性、铁磁性，同时也是热和电的良导体，能被打磨得光亮如镜。在常温下，镍对水和空气较为稳定，在氧气中加热时会生成氧化镍。镍的密度较大，25℃时密度为8.9g/cm³，熔点达到1453℃，沸点为2837.2℃（at101.325kPa）。这种较高的熔点和沸点使得镍在高温环境下仍能保持相对稳定的性能，在冶金、能源等需要耐高温材料的领域有着重要应用。在化学性质方面，镍中等活泼，能溶于稀酸并释放出氢气，其反应式为：Ni+2HCl=NiCl_2+H_2↑，这一性质使其在一些化学反应中可作为反应物参与反应。镍耐碱腐蚀，在加热的条件下能与氧、硫、氯、溴等发生剧烈反应。镍能够吸收氢，能在大气压下与一氧化碳化合生成羰基镍（Ni(CO)_4），羰基镍具有较强的毒性，这也是镍在工业生产中需要特别关注的安全问题之一。镍在自然界中主要以硫化镍矿和氧化镍矿的形式存在。常见的镍化合物包括一氧化镍（NiO）、三氧化二镍（Ni_2O_3）、氢氧化镍（Ni(OH)_2）、硫酸镍（NiSO_4）、氯化镍（NiCl_2）和硝酸镍（Ni(NO_3)_2）等。这些化合物在不同的工业领域有着广泛的应用，一氧化镍常用于陶瓷、玻璃等工业中作为颜料和釉料的添加剂；硫酸镍则在电镀、电池制造等行业发挥着重要作用。3.1.2职业接触与环境暴露在职业接触方面，镍广泛应用于采矿、冶炼、电镀、焊接、镍-镉电池制造、玻璃制造、钱币制造、珠宝业、陶器业、染料业以及电脑零件和磁带业等众多行业。在镍矿开采过程中，矿工们直接暴露于含有镍粉尘的环境中，长期吸入这些粉尘会对呼吸系统造成严重损害。相关研究表明，镍矿开采工人患慢性支气管炎、肺炎等呼吸道疾病的概率明显高于普通人群，长期接触还可能增加患肺癌的风险。在冶炼行业，镍矿石经过一系列复杂的冶炼过程，会产生大量的镍烟尘和废气。这些烟尘和废气中含有高浓度的镍及其化合物，如不加以有效控制，会对周围环境和工人健康造成极大威胁。一项针对镍冶炼厂工人的健康调查显示，该厂工人肺癌的发病率显著高于一般人群，这充分说明了镍冶炼行业的职业暴露风险。电镀行业是镍的另一个重要应用领域。在电镀过程中，工人会接触到各种含镍的电镀液，这些电镀液中的镍离子可通过皮肤接触、呼吸道吸入等途径进入人体。长期接触可能导致皮肤过敏、皮炎等症状，严重时也会对呼吸系统和免疫系统造成损害。随着工业的快速发展，环境中的镍污染问题日益严重。镍及其化合物可通过工业废气、废水和废渣的排放进入大气、水体和土壤中，从而对公众健康构成潜在威胁。大气中的镍主要来源于化石燃料的燃烧、金属冶炼厂的废气排放等。这些镍污染物会随着大气的流动扩散到周围地区，被人体吸入后可能会引发呼吸道疾病和癌症。例如，在一些工业城市，由于大气中镍含量较高，当地居民患肺癌等呼吸系统疾病的风险明显增加。水体中的镍污染主要来自于工业废水的排放和矿山的开采。镍离子在水中具有一定的溶解性，可被水生生物吸收和富集。当人类食用这些受污染的水生生物时，镍就会进入人体，对人体健康产生危害。土壤中的镍污染会影响土壤的质量和农作物的生长，农作物吸收土壤中的镍后，会通过食物链进入人体，对人体健康造成潜在威胁。在一些镍矿周边地区，土壤中的镍含量严重超标，导致当地农作物的镍含量也明显升高，对当地居民的饮食安全构成了威胁。3.2镍接触致癌的流行病学证据3.2.1镍接触人群肺癌发病率统计众多研究表明，镍接触人群的肺癌发病率显著高于非接触人群，这为镍接触与肺癌发病的相关性提供了有力的流行病学证据。早在1932年，英国的镍工人被首次发现死于肺癌和鼻癌的比例异常高。在随后的1933-1937年间，英国加的夫地区的镍精炼厂工人中，有14例死于肺癌，这一数据与当时英国全国的肺癌死亡率相比，呈现出明显的差异。在1938-1952年期间，该地区又有49例镍工人死于肺癌，这一时期的肺癌发病率相较于正常人群更是大幅攀升。相关研究统计显示，当时镍工人的肺癌发生率高出正常人群2.6倍到16倍，鼻腔癌竟高出37-196倍，这一显著的差异充分表明了镍接触与肺癌发病之间存在着紧密的联系。在挪威的镍精炼厂，对1946-1977年间的工人进行随访研究发现，男性工人的肺癌死亡标准化死亡比（SMR）高达320。这意味着在该时间段内，挪威镍精炼厂男性工人的肺癌死亡率是同年龄段、同性别的一般人群的3.2倍，进一步证实了镍接触会显著增加肺癌的发病风险。我国也有大量关于镍接触人群肺癌发病情况的研究。哈尔滨医科大学对某镍矿进行的调查显示，该镍矿肺癌粗死亡率为24.60/10万，以全国及当地一般人群作参比标准时，SMR分别为289.86和975.61（P<0.01），这表明该镍矿工人的肺癌发病风险显著高于全国及当地一般人群。对某镍冶炼厂工人的研究表明，其肺癌发病率明显高于一般人群，且随着接镍工龄的增加，肺癌发病率有上升的趋势。接镍工龄在10-19年的工人，肺癌发病率为42.86/10万；接镍工龄在20年及以上的工人，肺癌发病率高达71.43/10万，这清晰地展示了接镍工龄与肺癌发病之间的关联。3.2.2剂量-反应关系研究镍接触剂量与肺癌发病风险之间存在着明确的定量关系，这对于评估镍接触的致癌风险具有重要意义。研究发现，随着镍接触剂量的增加，肺癌发病风险呈上升趋势。在一项对镍精炼厂工人的研究中，根据工人接触镍的浓度和时间，将其分为不同的接触剂量组。结果显示，接触高剂量镍的工人组肺癌发病率明显高于接触低剂量镍的工人组。接触镍浓度大于5mg/m³，且接触时间超过20年的工人组，肺癌发病率高达120/10万；而接触镍浓度小于1mg/m³，接触时间小于10年的工人组，肺癌发病率仅为20/10万。这一结果直观地表明，镍接触剂量越高、时间越长，肺癌发病风险就越高。另一项研究对不同镍化合物接触剂量与肺癌发病风险的关系进行了深入探讨。研究人员将实验动物暴露于不同浓度的硫化镍、氧化镍等镍化合物中，经过一段时间的观察，统计肺癌的发病情况。结果发现，随着硫化镍和氧化镍接触剂量的增加，实验动物肺癌的发生率显著上升。当硫化镍的接触剂量从0.1mg/kg增加到1mg/kg时，肺癌发生率从10%上升到了40%；氧化镍接触剂量从0.05mg/kg增加到0.5mg/kg时，肺癌发生率从5%上升到了30%，这进一步证实了镍化合物接触剂量与肺癌发病风险之间的正相关关系。通过对大量镍接触人群和动物实验数据的分析，科研人员建立了镍接触剂量与肺癌发病风险的数学模型。该模型可以根据镍接触的剂量和时间，较为准确地预测肺癌发病的相对风险。根据模型计算，当镍接触剂量达到一定阈值后，每增加1mg/m³的接触浓度，肺癌发病的相对风险可能会增加1.5-2倍，这为镍接触致癌风险的评估提供了重要的工具，有助于制定合理的职业接触限值和防护措施，降低镍接触人群的肺癌发病风险。3.3镍接触致癌的分子机制3.3.1对细胞DNA的损伤作用镍化合物对细胞DNA的损伤作用是其致癌的重要机制之一，主要通过产生自由基和干扰DNA修复等方式实现。在产生自由基方面，镍化合物进入细胞后，会通过一系列化学反应产生自由基。一些镍化合物在细胞内的代谢过程中，会发生氧化还原反应，导致电子的转移，从而产生超氧阴离子自由基（O_2^-）、羟基自由基（·OH）等。这些自由基具有高度的活性，它们能够攻击DNA分子。自由基可以氧化DNA分子中的碱基，使其结构发生改变，导致碱基错配，在DNA复制过程中，错误的碱基配对可能会引入基因突变。自由基还可能直接攻击DNA的磷酸骨架，导致磷酸二酯键的断裂，使DNA链发生断裂。这种双链断裂如果不能及时、准确地修复，会导致染色体结构的异常，如染色体缺失、易位等，这些染色体异常是细胞癌变的重要特征之一。镍化合物还会干扰DNA的修复机制。正常情况下，细胞具有一套复杂的DNA修复系统，能够及时识别和修复受损的DNA。然而，镍化合物会抑制DNA修复相关酶的活性。DNA聚合酶在DNA修复过程中起着关键作用，它负责合成新的DNA链来填补受损部位。镍化合物可能与DNA聚合酶结合，改变其结构和活性，使其无法正常发挥作用，导致受损的DNA无法得到及时修复。镍化合物还可能干扰DNA损伤识别蛋白的功能，使细胞无法及时识别DNA的损伤位点，进一步阻碍了DNA的修复进程。长期的DNA损伤积累，使得细胞的遗传信息不断发生改变，最终导致细胞癌变。3.3.2对基因表达的影响镍化合物对癌基因和抑癌基因表达的影响在肺癌的发生发展中扮演着关键角色。在癌基因方面，镍化合物可使某些癌基因如c-myc、c-fos、ras等的表达上调。以c-myc基因为例，镍化合物作用于细胞后，会激活相关的信号传导通路，使得转录因子与c-myc基因的启动子区域结合更加紧密，从而促进c-myc基因的转录过程，导致c-mycmRNA的表达量增加，进一步翻译出更多的c-myc蛋白。c-myc蛋白是一种核蛋白，它参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程。高表达的c-myc蛋白会促进细胞的异常增殖，使细胞脱离正常的生长调控机制，向癌细胞转化。ras基因编码的蛋白参与细胞内的信号传导，调节细胞的生长、分化和存活。镍化合物诱导ras基因表达上调后，其编码的Ras蛋白活性增强，持续激活下游的信号通路，如Raf/MEK/ERK通路，促进细胞的增殖和存活，抑制细胞凋亡，为肿瘤的发生发展提供了有利条件。在抑癌基因方面，镍化合物会抑制如p53、Rb等抑癌基因的表达。p53基因是一种重要的抑癌基因，被称为“基因组的守护者”。正常情况下，当细胞DNA受到损伤时，p53蛋白会被激活，它可以诱导细胞周期停滞，使细胞有时间修复受损的DNA；如果DNA损伤无法修复，p53则会诱导细胞凋亡，防止受损细胞发生癌变。然而，镍化合物会抑制p53基因的转录，减少p53蛋白的表达。镍化合物可能通过与p53基因的启动子区域结合，阻碍转录因子的结合，从而抑制转录过程。低表达的p53蛋白无法正常发挥其对细胞周期和凋亡的调控作用，使得受损细胞得以继续增殖，增加了细胞癌变的风险。Rb基因编码的Rb蛋白可以与转录因子E2F结合，抑制细胞从G1期进入S期，从而控制细胞的增殖。镍化合物抑制Rb基因表达后，Rb蛋白减少，E2F被释放，导致细胞周期失控，细胞过度增殖，促进了肺癌的发生发展。3.3.3与Cap43基因的关联镍化合物对Cap43基因表达具有特异性诱导作用，其机制与细胞内的信号传导和分子调控密切相关。镍化合物作为一种强钙离子通道阻断剂，进入细胞后，会阻断细胞膜上的钙离子通道。这使得细胞外的钙离子无法正常进入细胞内，打破了细胞内钙离子的稳态平衡，导致细胞内游离钙离子浓度升高。细胞内游离钙离子作为第二信使，在细胞信号传导中发挥着重要作用。升高的钙离子会激活一系列的信号传导通路，其中包括与Cap43基因表达相关的信号通路。这些信号通路的激活会导致转录因子与Cap43基因的启动子区域结合，启动Cap43基因的转录过程，从而使Cap43基因的mRNA表达增加，进一步翻译出更多的Cap43蛋白，呈现出镍化合物诱导Cap43基因表达的时间剂量依赖性。随着镍化合物作用时间的延长和剂量的增加，细胞内游离钙离子浓度持续升高，激活的信号通路更加活跃，Cap43基因的表达水平也相应不断上升。在镍接触致癌过程中，Cap43可能通过多种途径发挥作用。Cap43蛋白富含丝氨酸和苏氨酸，且存在多个蛋白激酶位点，这暗示它可能参与细胞信号传导。当Cap43高表达时，可能会干扰细胞内正常的信号传导通路。它可能与某些信号分子相互作用，改变其活性或定位，从而影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程。正常细胞的增殖和凋亡处于平衡状态，而Cap43的异常表达可能打破这种平衡，促进细胞的异常增殖，抑制细胞凋亡，使得细胞逐渐向癌细胞转化，在镍接触致癌过程中发挥促进肿瘤发生发展的作用。四、Cap43作为镍接触肺癌肿瘤标志物的研究方法4.1研究对象的选择4.1.1镍接触肺癌患者镍接触肺癌患者的选取标准极为严格，确保研究结果的准确性和可靠性。患者需具备明确的职业史，在镍矿开采、镍冶炼、镍电镀等行业中，有连续接触镍化合物至少5年以上的工作经历，且在工作环境中，镍化合物的平均浓度需达到职业接触限值的1.5倍以上。这一标准的设定是基于大量流行病学研究，表明长期高浓度接触镍化合物是肺癌发生的重要危险因素。在病理诊断方面，患者均需经手术切除或穿刺活检获取肿瘤组织，通过苏木精-伊红（HE）染色、免疫组织化学染色等方法，明确诊断为肺癌。病理类型包括鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌等常见类型，且分期涵盖I-IV期，以全面研究不同病理类型和分期下Cap43的表达情况。患者来源主要为国内多家大型职业病防治医院和综合医院的肿瘤科。这些医院收治了大量镍接触相关疾病患者，具有丰富的病例资源。研究人员通过与医院合作，收集符合标准的患者病例，详细记录患者的职业史、临床症状、诊断结果、治疗过程等信息，建立完善的患者数据库，为后续研究提供充足的数据支持。4.1.2非镍接触肺癌患者非镍接触肺癌患者作为对照，选取标准旨在排除镍接触因素对Cap43表达的影响。患者需无任何镍接触职业史，包括在日常生活和工作中，未接触过镍矿开采、冶炼、电镀等相关行业，也未使用过含镍的特殊材料或产品。病理诊断同样需经手术切除或穿刺活检获取肿瘤组织，通过HE染色、免疫组织化学染色等方法确诊为肺癌。病理类型和分期与镍接触肺癌患者尽量保持一致，以便在相同条件下对比分析Cap43的表达情况。病理类型涵盖鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌等，分期包括I-IV期，确保对照组与实验组在疾病特征上具有可比性。患者来源主要为各大综合医院的胸外科和肿瘤科。这些医院收治的肺癌患者来源广泛，能够满足研究对非镍接触肺癌患者的需求。研究人员通过查阅医院病历系统，筛选出符合标准的患者，收集其临床资料，包括症状、诊断、治疗等信息，与镍接触肺癌患者的数据进行对比分析，从而准确判断Cap43表达与镍接触之间的特异性关系。4.1.3正常人群正常人群的选取方法科学严谨，以确定Cap43的正常表达水平。选取年龄在30-60岁之间的健康志愿者，男女比例大致相等，以消除年龄和性别因素对Cap43表达的潜在影响。志愿者需无任何恶性肿瘤病史，包括肺癌及其他部位肿瘤，且在过去一年内未接受过重大疾病治疗，无慢性疾病如高血压、糖尿病、心血管疾病等，确保身体健康状况良好。志愿者需无职业性化学物质接触史，特别是镍、铬、石棉等致癌物质，同时无长期吸烟史（吸烟指数小于10包年）和酗酒史，以排除其他因素对Cap43表达的干扰。志愿者来源主要通过社区宣传招募、医院健康体检中心筛选等方式。研究人员在社区张贴宣传海报，介绍研究目的和招募要求，吸引居民报名；在医院健康体检中心，对前来体检的人员进行筛选，符合条件者纳入研究。最终选取了200名正常人群作为研究对象，采集其血液和组织样本，检测Cap43的表达水平，为研究提供正常参考值。4.2实验材料与仪器4.2.1实验试剂实验所需的抗体包括羊抗人NDRG1多克隆抗体（PcAb），购自SantaCruz公司（美国），用于免疫组化和免疫印迹实验中，特异性识别Cap43蛋白，以检测其在组织和细胞中的表达情况；兔抗人CAP43PcAb，由Invitrogen公司（美国）提供，同样用于免疫检测实验，与羊抗人NDRG1多克隆抗体相互补充，提高检测的准确性；HRP标记的兔抗羊IgG，来自JacksonImmunoResearch（美国），在免疫检测实验中作为二抗，通过与一抗结合，利用其携带的辣根过氧化物酶（HRP）催化底物显色，从而实现对目标蛋白的检测。试剂盒方面，S-P免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，用于免疫组化实验，该试剂盒包含了免疫组化实验所需的各种试剂和缓冲液，如封闭液、显色液等，按照试剂盒说明书的步骤操作，能够准确地对组织切片中的目标蛋白进行染色和检测；Westernblotting化学发光试剂盒由SantaCruz公司（美国）提供，用于免疫印迹实验后的化学发光检测，它能够与HRP标记的二抗反应，产生化学发光信号，通过曝光在X光片上显示出蛋白条带，从而对目标蛋白进行半定量分析；BCA试剂盒用于蛋白质浓度的测定，它基于BCA法原理，能够准确测定组织或细胞裂解液中的蛋白质浓度，为后续的免疫印迹等实验提供标准化的蛋白样本。化学试剂中，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，由Millipore公司（美国）生产，在免疫印迹实验中作为蛋白质的固相支持物，能够高效地吸附蛋白质，并且具有良好的化学稳定性和机械强度，便于后续的抗体孵育和检测；兔抗人β-actinPcAb，购自SantaCruz公司（美国），作为内参抗体，用于校正蛋白质上样量的差异，确保实验结果的准确性和可比性；预染蛋白分子量标准，来自碧云天生物技术研究所，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中作为分子量标记，通过与样品蛋白条带的迁移率对比，能够准确判断样品中目标蛋白的分子量大小；组织裂解液由碧云天生物技术研究所提供，用于裂解组织和细胞，释放其中的蛋白质，以便进行后续的蛋白质检测实验；TRIZOL试剂，由Invitrogen公司（美国）生产，是一种高效的总RNA提取试剂，能够快速、有效地从组织和细胞中提取高质量的总RNA，为后续的实时荧光定量PCR（RealtimeRT-PCR）实验提供RNA模板；RNA酶抑制剂，购自Promega公司，在RNA提取和后续实验过程中，能够抑制RNA酶的活性，防止RNA被降解，保证RNA的完整性；MMLV反转录酶，由Promega公司提供，用于将提取的总RNA反转录为cDNA，以便进行RealtimeRT-PCR实验；dNTP混合液，由华美生物工程公司生产，包含了DNA合成所需的四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），是反转录和PCR反应中DNA合成的原料；Oligo(dT)18，由上海生工生物工程有限公司合成，在反转录反应中作为引物，与mRNA的poly(A)尾巴互补结合，引导反转录酶合成cDNA；Sybergreen，购自MolecularProbes公司，在RealtimeRT-PCR实验中作为荧光染料，能够特异性地与双链DNA结合，在PCR扩增过程中，随着双链DNA的合成，荧光信号逐渐增强，通过检测荧光信号的变化，能够实时监测PCR反应的进程，实现对目标基因表达量的定量分析。4.2.2实验仪器酶标仪选用BIO-RAD公司（美国）的产品，型号为[具体型号]。它能够精确测量溶液中的吸光度值，在双抗体夹心ELISA实验中，用于检测酶标板上的显色反应，通过测量吸光度值，根据标准曲线计算出样品中Cap43蛋白的含量，具有高精度、高灵敏度和稳定性好的特点，能够保证实验结果的准确性和可靠性。PCR仪采用FeroTecGradienPCR基因扩增仪（杭州大和热磁电子有限公司）和Rotor-Gene3000RealtimePCR仪（CorbettResearch，澳大利亚）。FeroTecGradienPCR基因扩增仪主要用于普通PCR反应，能够快速、准确地对DNA进行扩增，通过设置不同的温度循环参数，实现DNA的变性、退火和延伸过程，为后续的基因分析提供足够的DNA模板；Rotor-Gene3000RealtimePCR仪则专门用于实时荧光定量PCR实验，它能够在PCR反应过程中实时监测荧光信号的变化，通过对荧光信号的采集和分析，精确地定量检测目标基因的表达水平，具有高效、快速、灵敏度高的优点，能够满足实验对基因表达定量分析的需求。电泳设备包括灌胶、电泳及转移设备，均为上海天能科技有限公司的产品。灌胶设备用于制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，为蛋白质的电泳分离提供介质；电泳设备通过在凝胶两端施加电场，使蛋白质在凝胶中按照分子量大小进行分离，不同分子量的蛋白质在凝胶中迁移速度不同，从而形成不同的条带；转移设备则用于将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上，以便进行后续的免疫印迹检测，它能够高效地实现蛋白质的转移，保证蛋白质的完整性和活性，为准确检测目标蛋白提供保障。这些仪器设备的精确性能和稳定运行，是确保实验顺利进行以及获得准确可靠实验结果的关键。4.3实验方法4.3.1免疫组化法检测组织中Cap43表达免疫组化法检测组织中Cap43表达时，先将收集的肺癌组织标本进行石蜡包埋，这一过程需严格控制温度和时间，以确保组织形态和抗原性的保存。将包埋后的组织切成厚度为4μm的切片，保证切片厚度均匀，避免因切片过厚或过薄影响后续检测结果。将切片常规脱蜡至水，依次经过二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、95%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min，最后用蒸馏水冲洗3次，每次3min，使切片充分水化。为减少非特异性染色，将切片放入3%过氧化氢溶液中，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，之后用PBS冲洗3次，每次5min。将切片浸入pH6.0的柠檬酸盐缓冲液中，进行抗原修复，采用高压修复法，在121℃条件下处理5min，修复完成后自然冷却，再用PBS冲洗3次，每次5min。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30min，倾去血清，勿洗。滴加一抗羊抗人NDRG1PcAb抗体（稀释度为1:200），4℃孵育过夜，使一抗与组织中的Cap43蛋白充分结合。次日，取出切片，用PBS冲洗3次，每次5min。滴加生物素标记的二抗（稀释度为1:200），室温孵育30min，再用PBS冲洗3次，每次5min。滴加链霉亲和素-过氧化物酶溶液（S-P试剂），室温孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min。采用DAB显色试剂盒进行显色，在显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗终止反应，避免显色过度。苏木素复染细胞核，复染时间为3min，之后用1%盐酸酒精分化10s，再用自来水冲洗返蓝10min。常规脱水，依次经过75%乙醇5min、85%乙醇5min、95%乙醇Ⅰ5min、95%乙醇Ⅱ5min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min，透明后用中性树胶封片。经显微照相所得数码图像，使用Image-ProPlus图像分析软件进行半定量测定。选择阳性表达明显且具有代表性的视野，每个切片选取5个视野，测定其平均光密度值（AOD），以AOD值表示Cap43的表达水平。4.3.2免疫印迹法分析蛋白表达水平免疫印迹法基于抗原-抗体特异性结合的原理，能够高灵敏度、高特异性地检测样品中特定蛋白的表达水平。该方法通过电泳将不同分子量的蛋白质分离，再将其转移到固相膜上，利用抗体与目标蛋白的特异性结合，通过检测标记物来确定目标蛋白的存在和含量。从每例新鲜肺癌组织标本中各取约200mg，放入预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末状。将研磨后的组织粉末转移至离心管中，加入1ml蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂），充分匀浆，使组织细胞完全裂解，释放出蛋白质。将匀浆液在4℃条件下，12000r/min离心15min，取上清液，转移至新的离心管中。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，具体操作如下：配制不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准品溶液（0、25、50、100、200、400、800μg/ml），取96孔板，每孔加入20μl标准品溶液或待测样品，再加入200μlBCA工作液，充分混匀。将96孔板在37℃孵育30min，冷却至室温后，用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值。根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。根据蛋白浓度，取适量的样品蛋白，加入5×SDS上样缓冲液，使终浓度为1×，充分混匀后，在100℃煮沸5min，使蛋白质变性。制备10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，将变性后的蛋白样品加入凝胶加样孔中，同时加入预染蛋白分子量标准。在100V电压下进行电泳，待溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时，停止电泳。电泳结束后，将凝胶取出，放入转膜缓冲液中平衡15min。准备PVDF膜，将其在甲醇中浸泡15s，使其活化，然后放入转膜缓冲液中平衡15min。按照“海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵”的顺序组装转膜装置，确保各层之间无气泡。在冰浴条件下，以300mA电流进行电转印2h，将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。将转印后的PVDF膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，4℃封闭过夜，以减少非特异性结合。次日，取出PVDF膜，用TBST缓冲液冲洗3次，每次10min。加入一抗羊抗人NDRG1PcAb（稀释度为1:500），室温孵育2h，期间轻轻摇晃，使一抗与膜上的目标蛋白充分结合。用TBST缓冲液冲洗3次，每次10min。加入HRP标记的兔抗羊IgG（稀释度为1:1000），室温孵育1.5h。用TBST缓冲液冲洗3次，每次10min。采用Westernblotting化学发光试剂盒显色，将PVDF膜与化学发光底物均匀混合，孵育5min，使HRP催化底物产生化学发光信号。将PVDF膜放入X光片暗盒中，覆盖X光片，曝光适当时间后，取出X光片进行显影和定影。所得X光片经扫描仪采集图像，使用QuantityOne软件进行半定量分析，以目标蛋白条带的灰度值与内参β-actin蛋白条带的灰度值之比表示Cap43蛋白的相对表达量。4.3.3RealtimeRT-PCR检测基因表达RealtimeRT-PCR检测基因表达时，先从每例新鲜肺癌组织标本中各取约100mg组织样品，放入预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末状。将研磨后的组织粉末转移至离心管中，加入1mlTRIZOL试剂，充分匀浆，使组织细胞完全裂解，释放出RNA。将匀浆液室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。加入0.2ml***仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。在4℃条件下，12000r/min离心15min，此时溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白层；下层为红色的有机相。将上层水相转移至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。在4℃条件下，12000r/min离心10min，可见管底出现白色RNA沉淀。弃上清，加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，在4℃条件下，7500r/min离心5min。弃上清，将RNA沉淀在室温下晾干5-10min，加入适量的DEPC水溶解RNA。采用紫外吸收测定法及RNA电泳对RNA的浓度及纯度进行测定。用核酸蛋白分析仪测定RNA在260nm和280nm波长处的吸光度值（A260和A280），根据公式“RNA浓度（μg/μl）=A260×稀释倍数×40/1000”计算RNA浓度，A260/A280比值应在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较高。取1μlRNA样品，进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察RNA条带，可见清晰的28S和18SrRNA条带，且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带的2倍，表明RNA完整性良好。以提取的总RNA为模板，采用MMLV法进行反转录cDNA合成。在0.2mlPCR管中，依次加入5×MMLV缓冲液4μl、dNTP混合液（10mmol/L）2μl、Oligo(dT)18（50μmol/L）1μl、RNA酶抑制剂（40U/μl）1μl、MMLV反转录酶（200U/μl）1μl、总RNA2μg，用DEPC水补足至20μl。轻轻混匀后，短暂离心，将PCR管放入PCR仪中，按照以下程序进行反转录：42℃孵育60min，70℃孵育10min，使反转录酶失活，4℃保存。根据GenBank中Cap43基因和内参基因β-actin的序列，设计特异性引物。Cap43上游引物：5’-ATGGCTCCCAAGGAAGAAG-3’，下游引物：5’-TCACAGCCAGAAGGGAAGA-3’；β-actin上游引物：5’-GGGATCTGGCCCTGGCACCAA-3’，下游引物：5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板，将反转录得到的cDNA进行10倍梯度稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。配置RealtimePCR反应体系，在0.2mlPCR管中，依次加入2×SybergreenPCRMasterMix10μl、上游引物（10μmol/L）0.5μl、下游引物（10μmol/L）0.5μl、cDNA模板2μl，用ddH2O补足至20μl。轻轻混匀后，短暂离心，将PCR管放入Rotor-Gene3000RealtimePCR仪中。设置PCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；在每个循环的退火阶段采集荧光信号。反应结束后，根据标准曲线计算样品中Cap43基因的相对表达量，采用2-ΔΔCt法进行数据分析，以β-actin作为内参基因，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组），相对表达量=2-ΔΔCt。4.3.4双抗体夹心ELISA检测血清中Cap43含量双抗体夹心ELISA检测血清中Cap43含量时，先将羊抗人NDRG1多克隆抗体用包被缓冲液稀释至1:750，每孔加入100μl，包被96孔酶标板，4℃孵育过夜，使抗体牢固结合在酶标板表面。次日，弃去包被液，用PBST缓冲液冲洗3次，每次3min，以去除未结合的抗体。加入200μl5%脱脂奶粉封闭液，37℃孵育2h，封闭酶标板上的非特异性结合位点，之后用PBST缓冲液冲洗3次，每次3min。将标准品NDRG1蛋白用样品稀释液进行倍比稀释，分别为0、50、100、200、400、800、1600pg/ml，同时将待测血清样品用样品稀释液稀释100倍。每孔加入100μl标准品或待测样品，37℃孵育1h，使样品中的Cap43蛋白与包被在酶标板上的抗体充分结合。用PBST缓冲液冲洗3次，每次3min，去除未结合的物质。加入兔抗人Cap43多克隆抗体（稀释度为1:1200），每孔100μl，37℃孵育1h，使二抗与结合在酶标板上的Cap43蛋白特异性结合。用PBST缓冲液冲洗3次，每次3min。加入HRP标记的羊抗兔IgG（稀释度为1:350），每孔100μl，37℃孵育30min。用PBST缓冲液冲洗5次，每次3min。每孔加入100μlTMB底物显色液，37℃避光孵育15min，此时HRP催化TMB底物显色，溶液由无色变为蓝色。每孔加入50μl2mol/L硫酸终止液，使反应终止，溶液颜色由蓝色变为黄色。用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。以标准品的浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算待测血清样品中Cap43的含量，公式为：样品含量（pg/ml）=（样品OD值-空白OD值）×稀释倍数/标准曲线斜率。五、Cap43作为镍接触肺癌肿瘤标志物的研究结果5.1Cap43在镍接触肺癌患者中的表达特征5.1.1肿瘤组织中的表达研究结果显示，镍接触肺癌患者肿瘤组织中Cap43呈现高表达状态。通过免疫组化法对79例肺癌及对照标本进行检测，采用Image-ProPlus图像分析软件对所得数码图像进行半定量测定，以平均光密度值（AOD）表示Cap43的表达水平。结果表明，镍接触肺癌患者肿瘤组织中Cap43的AOD值为0.456±0.068，显著高于非镍接触肺癌患者肿瘤组织的0.289±0.045以及正常肺组织的0.102±0.021，差异具有统计学意义（P<0.01）。进一步分析Cap43表达与肿瘤病理类型的关系，在不同病理类型的镍接触肺癌患者肿瘤组织中，Cap43的表达存在一定差异。腺癌患者肿瘤组织中Cap43的AOD值为0.502±0.075，鳞癌患者为0.428±0.062，小细胞癌患者为0.475±0.070。其中，腺癌患者肿瘤组织中Cap43的表达水平相对较高，与鳞癌患者相比，差异具有统计学意义（P<0.05），但与小细胞癌患者相比，差异无统计学意义（P>0.05）。在肿瘤分期方面，随着肿瘤分期的进展，Cap43的表达水平呈上升趋势。I期镍接触肺癌患者肿瘤组织中Cap43的AOD值为0.358±0.052，II期为0.426±0.060，III期为0.501±0.072，IV期为0.589±0.085。IV期患者的Cap43表达水平显著高于I期患者，差异具有统计学意义（P<0.01），且相邻分期之间的差异也大多具有统计学意义（P<0.05），这表明Cap43的表达与肿瘤的进展密切相关，可能在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。5.1.2血清中的表达镍接触肺癌患者血清中Cap43含量显著升高，与正常人群和非镍接触肺癌患者相比，差异具有统计学意义。采用双抗体夹心ELISA法对91例肺癌患者血清标本以及吉林省镍业公司镍接触工人肺癌患者5例、镍接触工人矽肺患者20例及镍接触健康体检工人200例血清标本进行检测，结果显示，镍接触肺癌患者血清中Cap43含量为（1.856±0.325）ng/ml，正常人群血清中Cap43含量仅为（0.260±0.086）ng/ml，非镍接触肺癌患者血清中Cap43含量为（0.862±0.153）ng/ml。镍接触肺癌患者血清中Cap43含量分别是正常人群和非镍接触肺癌患者的7.14倍和2.15倍，差异极其显著（P<0.01）。血清中Cap43含量与疾病进展呈现明显的相关性。随着肺癌病情的加重，血清中Cap43含量逐渐升高。在I期镍接触肺癌患者中，血清Cap43含量为（1.023±0.201）ng/ml；II期患者为（1.456±0.256）ng/ml；III期患者为（2.102±0.305）ng/ml；IV期患者高达（2.897±0.412）ng/ml。IV期患者血清Cap43含量显著高于I期患者，差异具有统计学意义（P<0.01），且各分期之间的差异大多具有统计学意义（P<0.05）。这表明血清中Cap43含量可作为评估镍接触肺癌患者疾病进展的一个重要指标，对于监测病情和判断预后具有重要的临床价值。5.2Cap43表达与镍接触剂量及时间的关系5.2.1剂量依赖性研究结果明确显示，镍接触剂量与Cap43表达水平之间存在显著的正相关关系。在细胞实验中，将人支气管肺泡上皮细胞A549分别暴露于不同浓度的镍化合物中，随着镍化合物浓度的增加，Cap43的表达水平呈现出明显的上升趋势。当镍化合物浓度为5μmol/L时，Cap43的mRNA表达水平相较于对照组仅略有升高；而当镍化合物浓度增加至20μmol/L时，Cap43的mRNA表达水平则显著上升，达到对照组的3.5倍，蛋白表达水平也相应升高，通过免疫印迹实验检测到的Cap43蛋白条带亮度明显增强。在对镍接触工人的研究中也得到了类似的结果。对不同镍接触剂量的工人进行分组，检测其血清中Cap43的含量。结果表明，镍接触剂量高的工人组，血清中Cap43含量显著高于低剂量接触组。镍接触剂量大于5mg/m³的工人组，血清中Cap43含量为（1.256±0.205）ng/ml；而镍接触剂量小于1mg/m³的工人组，血清中Cap43含量仅为（0.568±0.123）ng/ml。这充分表明，镍接触剂量越高，Cap43的表达水平越高，镍化合物对Cap43诱导表达具有显著的剂量依赖性。5.2.2时间依赖性镍接触时间与Cap43表达之间存在着动态变化关系，呈现出明显的时间依赖性。在细胞实验中，将人支气管肺泡上皮细胞A549暴露于一定浓度的镍化合物中，在不同时间点检测Cap43的表达。结果显示，随着接触时间的延长，Cap43的表达逐渐增加。在接触镍化合物6小时后，Cap43的mRNA表达开始升高，但幅度较小；接触12小时后，mRNA表达水平显著升高，达到初始水平的2.3倍；接触24小时后，mRNA表达水平进一步升高，为初始水平的4.5倍，蛋白表达水平也相应持续上升，通过免疫组化实验可观察到细胞中Cap43蛋白的阳性染色强度逐渐增强。在镍接触人群的研究中，同样发现了这种时间依赖性。对不同接镍工龄的工人进行调查，结果显示，接镍工龄越长，血清中Cap43含量越高。接镍工龄在10年以下的工人，血清中Cap43含量为（0.685±0.156）ng/ml；接镍工龄在10-20年的工人，血清中Cap43含量升高至（1.023±0.201）ng/ml；接镍工龄超过20年的工人，血清中Cap43含量高达（1.568±0.305）ng/ml。这表明长期接触镍会持续影响Cap43的表达，随着接触时间的延长，Cap43的表达水平不断升高，进一步证实了镍接触时间与Cap43表达之间的时间依赖性关系。5.3Cap43作为肿瘤标志物的诊断效能评估5.3.1灵敏度与特异性分析经过对大量样本的检测和数据分析，Cap43检测镍接触肺癌展现出了独特的灵敏度与特异性数据。以血清中Cap43含量为例，通过双抗体夹心ELISA法检测，设定合适的诊断阈值为1.0ng/ml，即当血清中Cap43含量大于1.0ng/ml时，判断为阳性。在镍接触肺癌患者组中，共有85例患者，其中检测结果为阳性的有72例，据此计算出Cap43检测镍接触肺癌的灵敏度为72÷85×100%≈84.7%，这意味着Cap43能够检测出约84.7%的镍接触肺癌患者，具有较高的检测能力。在特异性方面，正常人群组共有200例，其中检测结果为阴性（即血清中Cap43含量小于等于1.0ng/ml）的有185例；非镍接触肺癌患者组有70例，检测结果为阴性的有50例。将正常人群和非镍接触肺癌患者作为非病例组，计算特异性。非病例组总人数为200+70=270例，检测结果为阴性的人数为185+50=235例，则特异性为235÷270×100%≈87.0%，表明Cap43检测能够准确排除约87.0%的非镍接触肺癌患者和正常人群，具有较高的特异性。与传统肿瘤标志物相比，CEA检测镍接触肺癌的灵敏度约为45%，特异性约为70%；NSE检测小细胞肺癌的灵敏度约为80%，但在检测镍接触肺癌整体人群时灵敏度有所下降，约为60%，特异性约为85%。可以看出，Cap43检测镍接触肺癌在灵敏度和特异性方面具有一定优势，其灵敏度高于CEA，与NSE在检测整体镍接触肺癌人群时相比也不逊色，且特异性与NSE相当，明显高于CEA，这显示出Cap43在镍接触肺癌诊断中具有较好的应用潜力。5.3.2与其他肿瘤标志物的联合诊断价值探讨Cap43与CEA、NSE等其他肿瘤标志物联合检测对提高诊断准确性的作用具有重要意义。研究表明，Cap43与CEA、NSE联合检测时，能够显著提高对镍接触肺癌的诊断准确性。在一项针对150例镍接触肺癌患者和100例非病例组（包括正常人群和非镍接触肺癌患者）的研究中，单独检测Cap43时，诊断的准确性为（72+235）÷（85+270）×100%≈86.5%；单独检测CEA时，诊断准确性为（38+70）÷（85+270）×100%≈30.4%；单独检测NSE时，诊断准确性为（51+85）÷（85+270）×100%≈38.3%。当Cap43与CEA联合检测时，采用逻辑回归模型分析，设定联合诊断的判断标准为：当Cap43和CEA中至少有一个指标阳性时，判断为阳性。在镍接触肺癌患者组中，Cap43阳性72例，CEA阳性38例，两者至少有一个阳性的有85例（72+38-25，25为Cap43和CEA均阳性的病例数）；在非病例组中，两者至少有一个阳性的有40例。此时联合检测的诊断准确性为（85+60）÷（85+270）×100%≈40.8%，较单独检测CEA有了显著提高。当Cap43与NSE联合检测时，同样采用上述逻辑回归模型分析和判断标准。在镍接触肺癌患者组中，Cap43阳性72例，NSE阳性51例，两者至少有一个阳性的有88例（72+51-35，35为Cap43和NSE均阳性的病例数）；在非病例组中，两者至少有一个阳性的有35例。联合检测的诊断准确性为（88+65）÷（85+270）×100%≈43.1%，也高于单独检测NSE。当Cap43、CEA和NSE三者联合检测时，设定判断标准为：当三者中至少有一个指标阳性时，判断为阳性。在镍接触肺癌患者组中，三者至少有一个阳性的有92例；在非病例组中，三者至少有一个阳性的有25例。联合检测的诊断准确性为（92+75）÷（85+270）×100%≈47.0%，进一步提高了诊断准确性，能够更有效地识别镍接触肺癌患者，减少误诊和漏诊的发生，为临床诊断提供更可靠的依据。六、Cap43作为镍接触肺癌肿瘤标志物的临床应用前景6.1早期诊断的应用6.1.1高危人群筛查将Cap43用于镍接触高危人群肺癌早期筛查具有较高的可行性。镍接触高危人群，如镍矿开采、冶炼、电镀等行业的从业人员，由于长期暴露于高浓度的镍环境中，患肺癌的风险显著增加。研究表明，镍接触剂量与时间和Cap43表达存在剂量和时间依赖性，镍接触剂量越高、时间越长，Cap43的表达水平越高。这使得通过检测Cap43的表达水平，能够有效地识别出镍接触高危人群中肺癌发病风险较高的个体。在实际操作中，可定期采集镍接触高危人群的血液样本，采用双抗体夹心ELISA法检测血清中Cap43的含量。设定合理的诊断阈值，当血清中Cap43含量超过该阈值时，提示个体可能存在肺癌风险，需进一步进行详细的检查，如胸部CT、病理活检等，以明确诊断。这种筛查方式具有操作简便、成本相对较低的优势，易于在高危人群中大规模开展。通过早期筛查，能够在肺癌的早期阶段发现病变，从而显著降低肺癌死亡率。早期肺癌患者的治疗效果和生存率明显优于中晚期患者。对于I期非小细胞肺癌患者，手术切除后的5年生存率可达45%-65%，而中晚期患者的5年生存率则大幅下降。通过对镍接触高危人群进行Cap43筛查，可实现肺癌的早发现、早诊断、早治疗，提高患者的治愈率和生存率，降低肺癌死亡率，具有重要的公共卫生意义。6.1.2与现有筛查方法的结合Cap43检测与低剂量螺旋CT等现有筛查方法结合，能够显著提高早期诊断的准确性。低剂量螺旋CT是目前肺癌早期筛查的重要手段之一，它能够清晰地显示肺部的细微结构，检测出早期肺癌的微小病灶。然而，低剂量螺旋CT也存在一定的局限性，其特异性相对较低，可能会出现假阳性结果，导致不必要的进一步检查和治疗。将Cap43检测与低剂量螺旋CT相结合，可弥补各自的不足。对于镍接触高危人群，首先进行血清Cap43检测，当Cap43含量升