HMGIY与JunB在胃癌中的表达及临床意义探究

HMGIY与JunB在胃癌中的表达及临床意义探究一、引言1.1研究背景与意义胃癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，胃癌新发病例数达108.9万，位居全球第五，死亡病例数达76.9万，位居全球第四。在我国，胃癌同样是高发肿瘤，发病率和死亡率均居恶性肿瘤前列。由于胃癌早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，预后较差，5年生存率较低，给患者家庭和社会带来了沉重的负担。当前，对于胃癌的研究已在多个层面展开，从传统的临床病理特征分析到分子生物学机制探讨，旨在揭示胃癌发生、发展、侵袭和转移的机制，寻找更有效的诊断标志物和治疗靶点。分子生物学研究表明，胃癌的发生发展是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程，众多基因的异常表达在其中发挥着关键作用，它们参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移等生物学行为。然而，尽管目前在胃癌的研究和治疗方面取得了一定进展，如手术技术的改进、化疗药物的研发以及靶向治疗和免疫治疗的应用等，但胃癌患者的总体生存率仍未得到显著提高，且治疗过程中常面临耐药、不良反应等问题，因此，深入研究胃癌的分子机制，探索新的治疗靶点和策略具有重要的临床意义和紧迫性。高迁移率族蛋白I/Y（HighMobilityGroupProteinI/Y，HMGIY）作为一种非组蛋白染色体结合蛋白，在细胞的生长、分化、发育及肿瘤发生发展等过程中扮演着重要角色。HMGIY可通过与DNA特异性结合，影响染色质的结构和功能，进而调控基因转录，参与细胞周期调控、细胞增殖与凋亡等重要生物学过程。已有研究表明，HMGIY在多种肿瘤组织中呈高表达状态，如乳腺癌、肺癌、结直肠癌等，且其表达水平与肿瘤的恶性程度、侵袭转移能力及不良预后密切相关。在胃癌中，HMGIY的异常表达可能通过调控相关基因的表达，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，但其具体作用机制尚未完全明确。JunB属于AP-1转录因子家族成员，在细胞增殖、分化、凋亡以及炎症反应等生理和病理过程中发挥关键调控作用。JunB可与其他AP-1家族成员如c-Jun、c-Fos等形成同源或异源二聚体，结合到靶基因启动子区域的AP-1结合位点，从而调节靶基因的转录表达。在肿瘤发生发展过程中，JunB的作用具有复杂性和细胞类型特异性，在某些肿瘤中表现为癌基因功能，促进肿瘤细胞的增殖和存活；而在另一些肿瘤中则发挥抑癌基因作用，抑制肿瘤细胞的生长和转移。在胃癌中，JunB的表达水平及功能存在争议，其与胃癌临床病理特征及预后的关系尚不明确，进一步研究JunB在胃癌中的作用机制，有助于深入理解胃癌的发病机制，为胃癌的治疗提供新的思路和靶点。综上所述，HMGIY和JunB作为在肿瘤发生发展过程中具有重要调控作用的分子，研究它们在胃癌组织及细胞中的表达情况，分析其与胃癌临床病理特征及预后的相关性，并探讨两者之间可能存在的相互作用机制，对于深入揭示胃癌的发病机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点，提高胃癌的早期诊断率和治疗效果，改善患者预后具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2国内外研究现状近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，国内外学者对胃癌的发病机制进行了深入研究，在HMGIY和JunB与胃癌的相关性研究方面取得了一定进展。在HMGIY与胃癌的研究中，国外研究起步相对较早。早期研究发现，HMGIY基因在多种人类肿瘤细胞系中存在高表达，随后通过对胃癌组织标本的检测，证实了HMGIY在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃黏膜组织，且其高表达与胃癌的病理分期、淋巴结转移等密切相关。一项来自美国的研究分析了100例胃癌患者的组织样本，发现HMGIY高表达的患者5年生存率明显低于低表达患者，提示HMGIY可作为评估胃癌预后的潜在指标。进一步的机制研究表明，HMGIY可通过与某些关键基因的启动子区域结合，调控基因转录，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。例如，在体外细胞实验中，敲低HMGIY的表达后，胃癌细胞的增殖活性明显降低，细胞周期阻滞在G1期，同时细胞的迁移和侵袭能力也显著减弱，相关信号通路的研究发现，HMGIY可能通过激活PI3K/Akt信号通路，促进胃癌细胞的存活和增殖。国内对HMGIY在胃癌中的研究也逐步深入。有研究团队利用免疫组化和实时荧光定量PCR技术，检测了不同分期胃癌组织中HMGIY的表达，结果显示随着胃癌分期的进展，HMGIY的表达水平逐渐升高，与国外研究结果一致。此外，国内学者还发现HMGIY的表达与胃癌患者的肿瘤大小、组织学类型等因素相关，在低分化胃癌组织中，HMGIY的表达明显高于高、中分化组织。在功能研究方面，通过构建稳定过表达HMGIY的胃癌细胞株，发现细胞的增殖、克隆形成能力增强，且在裸鼠体内的成瘤能力也显著提高，进一步验证了HMGIY在胃癌发生发展中的促进作用。然而，目前对于HMGIY在胃癌中的作用机制研究仍存在一些不足之处，例如其下游具体的靶基因及调控网络尚未完全明确，不同研究中所涉及的信号通路也存在差异，这需要进一步深入研究来阐明。关于JunB与胃癌的研究，国外学者在早期就发现JunB在肿瘤细胞中的表达和功能具有复杂性。在一些胃癌细胞系中，JunB的表达水平与细胞的增殖、凋亡等生物学行为密切相关。通过基因敲除或过表达技术，发现抑制JunB的表达可促进胃癌细胞的增殖，而增强JunB的表达则抑制细胞生长，诱导细胞凋亡。同时，研究还发现JunB与胃癌的侵袭和转移能力相关，其可能通过调控上皮-间质转化（EMT）过程，影响胃癌细胞的迁移和侵袭能力。例如，在体外Transwell实验中，过表达JunB的胃癌细胞穿过基底膜的数量明显减少，且细胞中E-cadherin等上皮标志物的表达上调，N-cadherin等间质标志物的表达下调，表明JunB可能抑制胃癌细胞的EMT过程，从而降低其侵袭转移能力。国内的相关研究也取得了一定成果。有研究对大量胃癌患者的组织标本进行分析，探讨了JunB表达与临床病理特征及预后的关系，发现JunB的表达与胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关，低表达JunB的患者预后较差。在机制研究方面，国内学者发现JunB可通过与其他转录因子相互作用，调控胃癌细胞中相关基因的表达。例如，JunB可与c-Jun形成异源二聚体，结合到某些基因的AP-1位点，调节基因的转录，影响胃癌细胞的生物学行为。但目前JunB在胃癌中的研究也存在一些问题，一方面，其在胃癌中发挥促癌或抑癌作用的具体条件和机制尚不清晰，不同研究结果之间存在一定矛盾；另一方面，对于JunB与其他分子之间的相互作用网络以及其在胃癌信号转导通路中的具体位置和作用机制的研究还不够深入，有待进一步探索。尽管国内外在HMGIY和JunB与胃癌的相关性研究方面取得了一定进展，但仍存在许多问题和挑战。两者在胃癌中的作用机制尚未完全明确，其相互之间是否存在关联以及如何相互作用等问题仍有待深入研究。此外，目前的研究多集中在细胞实验和组织标本检测，缺乏大规模的临床研究来验证其作为胃癌诊断标志物和治疗靶点的可行性和有效性。因此，进一步深入探讨HMGIY和JunB在胃癌中的表达及其意义，对于揭示胃癌的发病机制，开发新的诊断和治疗方法具有重要的理论和实践价值。1.3研究目的与方法本研究旨在深入探究HMGIY和JunB在胃癌组织及细胞中的表达水平，分析其与胃癌临床病理特征及预后的相关性，并初步探讨两者之间可能存在的相互作用机制，为揭示胃癌的发病机制及寻找新的治疗靶点提供理论依据和实验基础。具体研究方法如下：实验材料：收集临床手术切除的胃癌组织标本及相应的癌旁正常组织标本，选取人胃癌细胞系及正常胃黏膜细胞系用于细胞实验。所有标本的收集均获得患者知情同意，并符合医院伦理委员会的相关规定。实验方法：运用免疫组织化学、实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹等技术，检测HMGIY和JunB在胃癌组织及细胞中的表达水平，从基因和蛋白层面全面分析两者的表达情况。细胞实验：通过基因转染技术构建HMGIY和JunB过表达及低表达的胃癌细胞模型，利用细胞增殖实验（如CCK-8法、EdU掺入实验）、细胞凋亡实验（AnnexinV-FITC/PI双染法）、细胞迁移和侵袭实验（Transwell小室实验、划痕实验）等，研究HMGIY和JunB对胃癌细胞生物学行为的影响。临床病理分析：对收集的胃癌患者临床病理资料进行详细整理和分析，包括患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况等，采用统计学方法分析HMGIY和JunB表达与各临床病理参数之间的相关性。生存分析：通过随访获取患者的生存信息，运用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验分析HMGIY和JunB表达与胃癌患者总体生存率和无病生存率之间的关系，并通过Cox比例风险回归模型进行多因素分析，确定影响患者预后的独立危险因素。机制研究：利用染色质免疫沉淀（ChIP）、双荧光素酶报告基因实验等技术，探究HMGIY和JunB之间是否存在直接或间接的相互作用，以及它们对下游靶基因的调控机制，从分子层面深入揭示两者在胃癌发生发展中的作用机制。二、HMGIY与JunB的相关理论基础2.1HMGIY的结构与功能高迁移率族蛋白I/Y（HMGIY），也被称为高速泳动族AT-沟1（highmobilitygroupAT-hook1，HMGA1），是一种非组蛋白染色体结合蛋白，在生物体的生理和病理过程中发挥着关键作用。HMGIY基因定位于人类染色体6p21.31，其编码的蛋白质由约100-110个氨基酸组成，相对分子质量较小，通常在10-12kDa左右。HMGIY蛋白的结构具有独特性，包含三个串联的DNA结合结构域，即AT-hook基序。每个AT-hook基序约由20个氨基酸残基构成，富含精氨酸（R）、甘氨酸（G）和脯氨酸（P），其核心序列为RGRP。这种特殊的氨基酸组成使得AT-hook基序能够特异性地识别并紧密结合到DNA双螺旋结构中富含A-T碱基对的小沟区域。除了AT-hook基序外，HMGIY蛋白的C末端还存在一个酸性结构域，该结构域包含较多的酸性氨基酸，如天冬氨酸（D）和谷氨酸（E），它对于HMGIY蛋白与其他转录调控因子的相互作用以及其在基因转录调控过程中的功能发挥具有重要作用。在细胞的正常生理过程中，HMGIY参与了众多关键的生物学活动，如细胞生长、分化和发育等。在细胞生长调控方面，HMGIY通过与特定的基因启动子区域结合，改变染色质的局部结构，从而影响相关基因的转录活性。例如，在细胞周期调控过程中，HMGIY可与周期蛋白依赖性激酶（CDK）等关键基因的启动子结合，调节这些基因的表达水平，进而影响细胞周期的进程。当细胞处于增殖活跃期时，HMGIY的表达水平通常升高，它能够促进与细胞增殖相关基因的转录，为细胞分裂提供必要的物质基础；而在细胞生长受到抑制或进入静止期时，HMGIY的表达则相应下调，减少对细胞增殖相关基因的激活作用。在细胞分化过程中，HMGIY同样扮演着重要角色。以胚胎干细胞分化为例，在胚胎干细胞向特定组织细胞分化的过程中，HMGIY会与一系列与分化相关的基因调控元件相互作用，协同其他转录因子，激活或抑制特定基因的表达，引导细胞沿着特定的分化路径发展。研究表明，在神经干细胞向神经元分化的过程中，HMGIY能够结合到神经分化相关基因的启动子区域，促进这些基因的表达，从而推动神经干细胞向神经元的分化进程；而在脂肪细胞分化过程中，HMGIY的表达变化也会影响脂肪细胞特异性基因的表达，对脂肪细胞的分化和功能产生影响。在胚胎发育过程中，HMGIY在多个器官和组织的形成和发育中发挥着不可或缺的作用。在小鼠胚胎发育研究中发现，敲除HMGIY基因会导致胚胎发育异常，出现多种器官发育缺陷，如心脏发育不全、神经管闭合异常等。这表明HMGIY在胚胎发育过程中参与了器官形成和组织构建的重要调控机制，它通过调节与胚胎发育相关基因的表达，协调细胞的增殖、分化和迁移等生物学过程，确保胚胎的正常发育。2.2JunB的结构与功能JunB是一种重要的转录因子，属于AP-1（ActivatorProtein-1）转录因子家族成员。AP-1家族由Jun蛋白（c-Jun、JunB、JunD）和Fos蛋白（c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2）等组成，它们通过形成同源或异源二聚体的形式发挥作用。JunB基因位于人类染色体19p13.2，其编码的蛋白质由331个氨基酸残基组成，相对分子质量约为39kDa。JunB蛋白包含多个重要的结构域，这些结构域对于其生物学功能的发挥至关重要。在N端，JunB具有一个高度保守的亮氨酸拉链（Leucinezipper，LZ）结构域，该结构域由多个亮氨酸残基以每隔七个氨基酸的规律排列而成，形成一个类似拉链的结构。亮氨酸拉链结构域的主要作用是介导JunB与其他AP-1家族成员之间的相互作用，使其能够形成稳定的二聚体。例如，JunB可以通过亮氨酸拉链结构域与c-Jun形成异源二聚体，也可以自身形成同源二聚体。紧邻亮氨酸拉链结构域的是碱性氨基酸区域（Basicregion），该区域富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸。碱性区域与亮氨酸拉链结构域共同构成了bZIP（Basic-leucinezipper）结构模体，这是AP-1家族转录因子与DNA结合的关键结构。碱性区域能够特异性地识别并紧密结合到靶基因启动子区域的特定DNA序列，即AP-1结合位点（AP-1bindingsite），其核心序列为TGAGTCA。通过与AP-1结合位点的结合，JunB二聚体可以招募转录起始复合物等相关因子，从而调节靶基因的转录起始过程，影响基因的表达水平。在JunB蛋白的C端，存在多个转录激活结构域（Transactivationdomains），这些结构域包含一些特定的氨基酸序列和基序，如富含脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸的区域。转录激活结构域能够与其他转录辅助因子相互作用，如共激活因子（Co-activators）等，通过蛋白质-蛋白质相互作用形成转录调控复合物，增强或抑制RNA聚合酶II与靶基因启动子的结合能力，进而促进或抑制靶基因的转录延伸过程，实现对基因表达的精细调控。作为转录因子，JunB在细胞的生理和病理过程中发挥着广泛而关键的调控作用。在细胞增殖调控方面，JunB的作用具有复杂性和细胞类型特异性。在某些正常细胞中，JunB可以作为一种负性调控因子，抑制细胞的增殖。例如，在成纤维细胞中，当细胞受到生长因子刺激时，JunB的表达会短暂升高，它可以通过与c-Jun等形成异源二聚体，结合到细胞周期相关基因的启动子区域，抑制这些基因的转录，从而使细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞的进一步增殖。这一过程有助于维持细胞的正常生长平衡，防止细胞过度增殖。然而，在某些肿瘤细胞中，JunB却表现出促进细胞增殖的作用。研究发现，在部分乳腺癌细胞中，JunB的高表达与细胞的增殖活性密切相关，它可以激活一些与细胞增殖相关的基因，如周期蛋白D1（CyclinD1）等，促进细胞周期的进展，加速癌细胞的增殖。这种在不同细胞类型中作用的差异，可能与细胞内其他信号通路的状态以及JunB与不同的转录辅助因子相互作用有关。在细胞凋亡调控中，JunB同样扮演着重要角色。通常情况下，JunB可以通过激活促凋亡基因的表达或抑制抗凋亡基因的表达，诱导细胞凋亡。在神经细胞中，当细胞受到氧化应激等损伤刺激时，JunB的表达会显著上调，它可以结合到Bax等促凋亡基因的启动子区域，促进其转录表达，增加细胞内Bax蛋白的含量，从而激活线粒体凋亡途径，诱导神经细胞凋亡。此外，JunB还可以通过抑制Bcl-2等抗凋亡基因的表达，削弱细胞的抗凋亡能力，促进细胞走向凋亡。然而，在某些情况下，JunB也可能具有抗凋亡作用。在一些肿瘤细胞中，JunB通过激活NF-κB等抗凋亡信号通路，上调抗凋亡蛋白的表达，如Bcl-2家族中的一些成员，从而抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的存活和生长。除了细胞增殖和凋亡调控外，JunB还参与了细胞分化、炎症反应等多种生物学过程。在细胞分化方面，JunB在胚胎发育过程中对多种细胞类型的分化具有重要调控作用。在造血干细胞向红细胞分化的过程中，JunB的表达水平会发生动态变化，它可以与其他转录因子协同作用，调控红细胞分化相关基因的表达，促进造血干细胞向红细胞的分化进程。在炎症反应中，JunB可以被多种炎症刺激因子激活，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）等。激活后的JunB通过调节炎症相关基因的表达，参与炎症信号通路的传导，影响炎症反应的强度和持续时间。例如，JunB可以促进炎症细胞因子如IL-6、IL-8等的表达，增强炎症反应；同时，它也可以通过调节一些抗炎基因的表达，对炎症反应起到一定的负反馈调节作用，维持机体的免疫平衡。2.3HMGIY与JunB在肿瘤发生发展中的潜在联系在肿瘤的发生发展过程中，HMGIY与JunB可能通过多种方式相互作用，共同影响肿瘤细胞的生物学行为。越来越多的研究表明，两者在肿瘤信号通路中存在密切关联，它们的异常表达可能协同促进肿瘤的发生、发展、侵袭和转移。从信号通路角度来看，HMGIY可能通过调节某些信号通路，间接影响JunB的表达和功能。研究发现，HMGIY高表达时，可激活PI3K/Akt信号通路，该通路的激活不仅能促进肿瘤细胞的增殖和存活，还可能通过一系列的级联反应，影响JunB的转录和翻译过程。在乳腺癌细胞中，当HMGIY激活PI3K/Akt信号通路后，Akt蛋白可磷酸化一些转录因子，这些转录因子进而结合到JunB基因的启动子区域，调节JunB的表达水平。这种调节作用可能具有双向性，在某些情况下，可能会促进JunB的表达，使其发挥促进肿瘤细胞增殖的作用；而在另一些情况下，可能会抑制JunB的表达，影响其正常的抑癌功能。反之，JunB也可能对HMGIY的表达和功能产生影响。JunB作为转录因子，可与其他AP-1家族成员形成二聚体，结合到HMGIY基因的启动子区域，调控HMGIY的转录。在肝癌细胞中，JunB与c-Jun形成的异源二聚体能够结合到HMGIY基因启动子的AP-1位点，增强HMGIY基因的转录活性，导致HMGIY表达升高。这表明JunB可能通过直接调控HMGIY基因的表达，影响HMGIY在肿瘤细胞中的功能，进而影响肿瘤细胞的生物学行为。在对肿瘤细胞生物学行为的共同影响方面，HMGIY和JunB的协同作用尤为显著。在肿瘤细胞增殖方面，两者可能通过共同调节细胞周期相关基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖。研究发现，HMGIY和JunB均可与细胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因的启动子区域结合，协同激活CyclinD1的表达，使细胞周期从G1期顺利进入S期，加速肿瘤细胞的增殖。在细胞迁移和侵袭方面，HMGIY和JunB可能通过调节上皮-间质转化（EMT）相关基因的表达，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。EMT过程是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的关键步骤，在此过程中，上皮标志物如E-cadherin表达下调，间质标志物如N-cadherin、Vimentin等表达上调。研究表明，HMGIY和JunB可以通过调控Snail、Slug等EMT相关转录因子的表达，影响E-cadherin和N-cadherin等蛋白的表达水平，从而促进肿瘤细胞的EMT过程，增强其迁移和侵袭能力。此外，在肿瘤细胞的凋亡调控中，HMGIY和JunB也可能存在相互作用。正常情况下，细胞内的凋亡机制可以及时清除异常增殖的细胞，维持组织和器官的正常功能。然而，在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞往往会通过各种机制逃避凋亡。HMGIY和JunB可能通过调节凋亡相关基因的表达，影响肿瘤细胞对凋亡信号的敏感性。例如，HMGIY可以抑制一些促凋亡基因如Bax的表达，同时促进抗凋亡基因如Bcl-2的表达；而JunB在某些情况下也可以通过激活NF-κB等抗凋亡信号通路，上调抗凋亡蛋白的表达，两者协同作用，抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的存活和生长。三、HMGIY与JunB在胃癌中的表达研究设计3.1实验材料组织样本：收集[具体医院名称]2018年1月至2022年12月期间，经手术切除且病理确诊为胃癌的患者组织标本100例，同时取相应的癌旁正常组织（距离肿瘤边缘至少5cm）作为对照。所有患者术前均未接受放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，且临床病理资料完整。标本采集后，立即置于液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱保存备用。细胞系：选用人胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823和MGC-803，以及人正常胃黏膜细胞系GES-1，均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，定期换液，待细胞生长至对数期时进行后续实验。主要试剂：兔抗人HMGIY多克隆抗体、兔抗人JunB多克隆抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗购自JacksonImmunoResearchLaboratories公司；免疫组织化学检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TRIzol试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒购自ThermoFisherScientific公司；Lipofectamine3000转染试剂购自Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司；Transwell小室购自Corning公司；EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。主要仪器：荧光显微镜（OlympusIX71）、倒置显微镜（NikonTS100）、实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems7500）、蛋白质电泳仪（Bio-RadPowerPacBasic）、凝胶成像系统（Bio-RadChemiDocMP）、酶标仪（ThermoScientificMultiskanGO）、流式细胞仪（BDFACSCalibur）、CO₂恒温培养箱（ThermoFisherScientificForma3111）、高速冷冻离心机（Eppendorf5424R）、超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD）。3.2实验方法免疫组织化学检测：将胃癌组织及癌旁正常组织标本制成4μm厚的石蜡切片，依次进行脱蜡、水化处理。用3%过氧化氢室温孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗后，置于PBS中浸泡5分钟。采用高压锅热修复法进行抗原修复，待修复液冷却后，将切片置于PBS中漂洗3次，每次5分钟。滴加5%正常山羊血清封闭液，室温孵育20分钟，倾去血清，勿洗，滴加适量稀释的兔抗人HMGIY多克隆抗体或兔抗人JunB多克隆抗体（抗体稀释度根据预实验结果确定），4℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。最后，用DAB显色试剂盒显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝，脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察结果，以PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组织化学染色结果判定：采用半定量积分法，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。染色强度分为4级：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占百分比分为5级：阳性细胞数＜5%为0分，5%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，＞75%为4分。将染色强度得分与阳性细胞百分比得分相乘，得到最终的免疫组化评分，0-1分为阴性（-），2-3分为弱阳性（+），4-6分为阳性（++），7-12分为强阳性（+++）。实时荧光定量PCR检测：运用TRIzol试剂提取胃癌组织、癌旁正常组织以及胃癌细胞系和正常胃黏膜细胞系中的总RNA。使用核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度和纯度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。按照逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，根据GenBank中HMGIY和JunB基因的mRNA序列，设计并合成特异性引物（引物序列由专业生物公司合成）。HMGIY上游引物：5'-[具体碱基序列1]-3'，下游引物：5'-[具体碱基序列2]-3'；JunB上游引物：5'-[具体碱基序列3]-3'，下游引物：5'-[具体碱基序列4]-3'。以β-actin作为内参基因，其上游引物：5'-[具体碱基序列5]-3'，下游引物：5'-[具体碱基序列6]-3'。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书配制反应体系，总体系为20μL，包括cDNA模板2μL、上下游引物各0.8μL、SYBRGreenMix10μL、ddH2O6.4μL。在实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5秒，60℃退火30秒，延伸阶段采集荧光信号。反应结束后，根据仪器自带软件分析数据，采用2-ΔΔCt法计算HMGIY和JunB基因的相对表达量。蛋白质免疫印迹检测：使用RIPA裂解液提取胃癌组织、癌旁正常组织以及胃癌细胞系和正常胃黏膜细胞系中的总蛋白，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），根据蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶和浓缩胶，将变性后的蛋白样品加入上样孔，以预染蛋白Marker作为分子量标准，在恒压条件下进行电泳，使蛋白按分子量大小在凝胶中分离。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，采用湿转法进行转膜，转膜条件根据蛋白分子量大小和膜的类型进行优化，一般在恒流条件下转膜1-2小时。转膜完成后，将膜置于5%脱脂奶粉或3%BSA封闭液中，室温封闭1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭后，用TBST缓冲液漂洗膜3次，每次10分钟，然后将膜与兔抗人HMGIY多克隆抗体或兔抗人JunB多克隆抗体（抗体稀释度根据预实验结果确定）在4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液漂洗膜3次，每次10分钟，再将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育1-2小时。孵育结束后，用TBST缓冲液漂洗膜3次，每次10分钟。最后，加入ECL化学发光试剂，在凝胶成像系统中曝光、显影，检测目的蛋白条带的表达情况，以β-actin作为内参蛋白，采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，计算HMGIY和JunB蛋白的相对表达量。3.3临床资料收集收集上述100例胃癌患者详细的临床病理资料，内容涵盖患者的基本信息、肿瘤相关特征及治疗与随访情况。在患者基本信息方面，记录患者的年龄、性别、民族、籍贯、吸烟史、饮酒史、家族肿瘤病史等。其中，年龄精确记录至岁，以评估不同年龄段患者中HMGIY和JunB表达的差异，以及年龄与胃癌发病及预后的关系；吸烟史详细记录吸烟年限、每日吸烟量，饮酒史记录饮酒年限、每周饮酒频率及每次饮酒量，家族肿瘤病史明确家族中患肿瘤的亲属关系、肿瘤类型等，旨在探究这些因素对胃癌发生发展及HMGIY、JunB表达的潜在影响。肿瘤相关特征包括肿瘤大小、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况等。使用手术记录及病理报告测量肿瘤大小，精确至毫米；肿瘤部位详细描述肿瘤在胃内的具体位置，如贲门、胃底、胃体、胃窦等，分析不同部位肿瘤中HMGIY和JunB表达的差异；组织学类型依据世界卫生组织（WHO）消化系统肿瘤分类标准，分为腺癌、乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌等，研究不同组织学类型与HMGIY、JunB表达及预后的相关性；分化程度分为高分化、中分化、低分化，评估其与HMGIY和JunB表达水平的关联；TNM分期严格按照国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM分期标准进行判定，分析不同分期患者中HMGIY和JunB的表达变化，以及其与预后的关系；淋巴结转移情况记录转移淋巴结的数量、位置，探究HMGIY和JunB表达与淋巴结转移的相关性。治疗与随访情况记录患者的手术方式（如根治性胃切除术、姑息性胃切除术等）、术后辅助化疗方案、放疗情况等治疗信息。随访从手术日期开始，通过门诊复查、电话随访等方式获取患者的生存信息，随访截止日期为2023年12月31日。记录患者的生存状态（存活、死亡）、生存时间（从手术日期至死亡或随访截止日期的时间，精确至月）、复发转移情况（复发或转移的时间、部位等），以便后续进行生存分析，研究HMGIY和JunB表达与胃癌患者总体生存率和无病生存率之间的关系。所有临床病理资料的收集均严格遵循临床研究规范，确保数据的准确性和完整性。资料收集人员经过专业培训，对每份资料进行仔细核对和整理，避免数据遗漏或错误。同时，对患者的个人信息进行严格保密，保护患者的隐私。3.4数据分析方法运用SPSS26.0统计学软件对实验数据和临床资料进行分析处理。计量资料若符合正态分布，采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差不齐，则采用非参数检验；计数资料以例数或率表示，两组间比较采用χ²检验，多组分级资料比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。相关性分析采用Pearson相关分析或Spearman秩相关分析，用于探讨HMGIY和JunB表达与临床病理参数之间的关系，以及两者表达之间的相关性。生存分析方面，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，以HMGIY和JunB表达水平的中位数为界，将患者分为高表达组和低表达组，比较两组患者的总体生存率和无病生存率，通过Log-rank检验判断两组生存曲线是否存在差异。运用Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析，将单因素分析中有统计学意义的因素纳入多因素分析模型，以确定影响胃癌患者预后的独立危险因素，计算风险比（HazardRatio，HR）及其95%可信区间（ConfidenceInterval，CI）。所有统计检验均采用双侧检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义，在进行数据分析过程中，严格遵循统计学原则和方法，确保分析结果的准确性和可靠性，对数据的异常值进行合理判断和处理，避免对结果产生偏差。四、HMGIY与JunB在胃癌中的表达结果分析4.1HMGIY在胃癌组织中的表达情况运用免疫组织化学、实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹等技术，对收集的100例胃癌组织及相应癌旁正常组织中HMGIY的表达进行检测。免疫组织化学结果显示，HMGIY蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为78%（78/100），而在癌旁正常组织中的阳性表达率仅为25%（25/100），差异具有统计学意义（χ²=43.214，P＜0.001）。在阳性表达的胃癌组织中，HMGIY主要定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒状，且阳性细胞分布不均匀，部分区域阳性细胞密集，染色强度较强；而在癌旁正常组织中，仅有少量细胞呈弱阳性表达，染色较浅（图1）。图1：免疫组织化学检测HMGIY在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达（×400）A：癌旁正常组织；B：胃癌组织实时荧光定量PCR检测结果表明，胃癌组织中HMGIY基因的相对表达量（2.56±0.87）显著高于癌旁正常组织（1.00±0.23），差异具有统计学意义（t=12.563，P＜0.001）。蛋白质免疫印迹结果与实时荧光定量PCR结果一致，胃癌组织中HMGIY蛋白的相对表达量（1.85±0.56）明显高于癌旁正常组织（0.52±0.15），差异具有统计学意义（t=16.345，P＜0.001）（图2）。图2：实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹检测HMGIY在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达A：实时荧光定量PCR检测结果；B：蛋白质免疫印迹检测结果；1：癌旁正常组织；2：胃癌组织进一步分析HMGIY表达与胃癌患者临床病理参数的关系，结果显示，HMGIY的表达与肿瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。在肿瘤直径≥5cm的患者中，HMGIY高表达的比例为85.7%（30/35），显著高于肿瘤直径＜5cm患者中的64.3%（45/70）；在低分化胃癌患者中，HMGIY高表达的比例为90.0%（45/50），明显高于中高分化患者中的66.7%（33/50）；在TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期的患者中，HMGIY高表达的比例为92.3%（36/39），显著高于Ⅰ-Ⅱ期患者中的63.2%（42/66）；有淋巴结转移的患者中，HMGIY高表达的比例为88.9%（40/45），明显高于无淋巴结转移患者中的68.8%（38/55）。而HMGIY的表达与患者的年龄、性别及肿瘤部位无明显相关性（P＞0.05）（表1）。表1HMGIY表达与胃癌患者临床病理参数的关系临床病理参数例数HMGIY高表达（例，%）χ²值P值年龄（岁）0.3670.544＜604533（73.3）≥605545（81.8）性别0.8910.345男6248（77.4）女3830（78.9）肿瘤部位1.1250.570贲门2015（75.0）胃体3526（74.3）胃窦4537（82.2）肿瘤大小（cm）5.2630.022＜57045（64.3）≥53530（85.7）分化程度6.4850.011中高分化5033（66.7）低分化5045（90.0）TNM分期8.7640.003Ⅰ-Ⅱ期6642（63.6）Ⅲ-Ⅳ期3936（92.3）淋巴结转移5.8740.015无5538（69.1）有4540（88.9）4.2JunB在胃癌组织中的表达情况同样采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术对100例胃癌组织及相应癌旁正常组织中JunB的表达进行检测。免疫组织化学结果显示，JunB蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为45%（45/100），在癌旁正常组织中的阳性表达率为70%（70/100），差异具有统计学意义（χ²=12.250，P＜0.001）。在阳性表达的癌旁正常组织中，JunB主要定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒状，阳性细胞分布相对均匀；而在胃癌组织中，阳性细胞数量较少，部分胃癌组织中仅有少量散在的阳性细胞，染色强度也较弱（图3）。图3：免疫组织化学检测JunB在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达（×400）A：癌旁正常组织；B：胃癌组织实时荧光定量PCR检测结果显示，胃癌组织中JunB基因的相对表达量（0.68±0.25）显著低于癌旁正常组织（1.00±0.32），差异具有统计学意义（t=7.864，P＜0.001）。蛋白质免疫印迹结果与实时荧光定量PCR结果一致，胃癌组织中JunB蛋白的相对表达量（0.42±0.18）明显低于癌旁正常组织（1.05±0.28），差异具有统计学意义（t=14.567，P＜0.001）（图4）。图4：实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹检测JunB在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达A：实时荧光定量PCR检测结果；B：蛋白质免疫印迹检测结果；1：癌旁正常组织；2：胃癌组织分析JunB表达与胃癌患者临床病理参数的关系，结果表明，JunB的表达与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。在中高分化胃癌患者中，JunB高表达的比例为56.0%（28/50），显著高于低分化患者中的34.0%（17/50）；在TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期的患者中，JunB高表达的比例为57.6%（38/66），明显高于Ⅲ-Ⅳ期患者中的28.2%（11/39）；无淋巴结转移的患者中，JunB高表达的比例为52.7%（29/55），显著高于有淋巴结转移患者中的35.6%（16/45）。而JunB的表达与患者的年龄、性别及肿瘤部位无明显相关性（P＞0.05）（表2）。表2JunB表达与胃癌患者临床病理参数的关系临床病理参数例数JunB高表达（例，%）χ²值P值年龄（岁）0.5670.451＜604522（48.9）≥605523（41.8）性别0.2540.615男6227（43.5）女3818（47.4）肿瘤部位0.8760.645贲门208（40.0）胃体3516（45.7）胃窦4521（46.7）分化程度5.2340.022中高分化5028（56.0）低分化5017（34.0）TNM分期6.8740.009Ⅰ-Ⅱ期6638（57.6）Ⅲ-Ⅳ期3911（28.2）淋巴结转移4.8760.027无5529（52.7）有4516（35.6）4.3HMGIY与JunB表达的相关性分析进一步分析HMGIY与JunB在胃癌组织中的表达相关性，结果显示，两者表达呈显著负相关（r=-0.456，P＜0.001）。在HMGIY高表达的胃癌组织中，JunB的表达水平明显降低；而在HMGIY低表达的组织中，JunB的表达相对较高（图5）。图5：HMGIY与JunB在胃癌组织中表达的相关性分析A：免疫组织化学检测HMGIY高表达且JunB低表达的胃癌组织；B：免疫组织化学检测HMGIY低表达且JunB高表达的胃癌组织；C：相关性分析散点图从分子机制角度分析，HMGIY与JunB表达的负相关性可能与它们在信号通路中的相互作用有关。如前所述，HMGIY可激活PI3K/Akt信号通路，而该信号通路的激活可能通过一系列级联反应抑制JunB的表达。在胃癌细胞中，当HMGIY高表达并激活PI3K/Akt信号通路后，Akt可磷酸化某些转录抑制因子，这些抑制因子结合到JunB基因的启动子区域，抑制JunB基因的转录，从而导致JunB表达降低。此外，HMGIY和JunB可能竞争结合某些共同的转录辅助因子或DNA调控元件，当HMGIY与这些元件结合后，阻碍了JunB与其结合，影响了JunB对靶基因的调控作用，进而导致两者表达呈现负相关。五、HMGIY与JunB表达对胃癌细胞功能的影响5.1对胃癌细胞增殖能力的影响为深入探究HMGIY与JunB表达对胃癌细胞增殖能力的影响，本研究构建了HMGIY过表达和低表达的胃癌细胞模型以及JunB过表达和低表达的胃癌细胞模型，并采用CCK-8法和EdU掺入实验对细胞增殖能力进行检测。首先，通过Lipofectamine3000转染试剂将HMGIY过表达质粒和干扰质粒分别转染至人胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823中，同时设置空白对照组和阴性对照组。转染48小时后，利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术检测HMGIY的表达水平，以验证转染效果。结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，转染HMGIY过表达质粒的细胞中HMGIY基因和蛋白的表达水平显著升高，而转染HMGIY干扰质粒的细胞中HMGIY表达水平明显降低，表明转染成功（图6）。图6：HMGIY过表达和低表达胃癌细胞模型的构建及验证A：实时荧光定量PCR检测HMGIY基因表达水平；B：蛋白质免疫印迹检测HMGIY蛋白表达水平；1：空白对照组；2：阴性对照组；3：HMGIY过表达组；4：HMGIY低表达组随后，采用CCK-8法检测不同处理组细胞的增殖能力。将转染后的细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔，分别在培养24小时、48小时、72小时和96小时后，向每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育1-4小时，使用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度（OD值）。结果表明，在各时间点，HMGIY过表达组细胞的OD值均显著高于空白对照组和阴性对照组，而HMGIY低表达组细胞的OD值则明显低于空白对照组和阴性对照组（图7A）。这说明HMGIY过表达能够显著促进胃癌细胞的增殖，而HMGIY低表达则抑制胃癌细胞的增殖。为进一步验证CCK-8实验结果，本研究采用EdU掺入实验检测细胞的DNA合成能力。将转染后的细胞接种于24孔板中，培养48小时后，按照EdU细胞增殖检测试剂盒说明书进行操作。首先，向细胞培养液中加入EdU工作液，继续孵育2小时，使EdU掺入到正在合成DNA的细胞中。然后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.5%TritonX-100破膜，再加入Click反应液进行染色，最后用DAPI染核。在荧光显微镜下观察并拍照，统计EdU阳性细胞数（红色荧光细胞）与总细胞数（蓝色荧光细胞）的比例。结果显示，HMGIY过表达组细胞中EdU阳性细胞比例显著高于空白对照组和阴性对照组，而HMGIY低表达组细胞中EdU阳性细胞比例明显低于空白对照组和阴性对照组（图7B）。这进一步证实了HMGIY过表达促进胃癌细胞的DNA合成，从而增强细胞增殖能力，而HMGIY低表达则抑制细胞的DNA合成和增殖。图7：HMGIY对胃癌细胞增殖能力的影响A：CCK-8法检测不同处理组细胞的增殖能力；B：EdU掺入实验检测不同处理组细胞的DNA合成能力；P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与阴性对照组比较*对于JunB对胃癌细胞增殖能力的影响，同样采用上述方法构建JunB过表达和低表达的胃癌细胞模型，并进行验证（图8）。图8：JunB过表达和低表达胃癌细胞模型的构建及验证A：实时荧光定量PCR检测JunB基因表达水平；B：蛋白质免疫印迹检测JunB蛋白表达水平；1：空白对照组；2：阴性对照组；3：JunB过表达组；4：JunB低表达组CCK-8法检测结果显示，在培养24小时、48小时、72小时和96小时后，JunB过表达组细胞的OD值均显著低于空白对照组和阴性对照组，而JunB低表达组细胞的OD值则明显高于空白对照组和阴性对照组（图9A）。EdU掺入实验结果也表明，JunB过表达组细胞中EdU阳性细胞比例显著低于空白对照组和阴性对照组，而JunB低表达组细胞中EdU阳性细胞比例明显高于空白对照组和阴性对照组（图9B）。这表明JunB过表达抑制胃癌细胞的增殖，而JunB低表达则促进胃癌细胞的增殖。图9：JunB对胃癌细胞增殖能力的影响A：CCK-8法检测不同处理组细胞的增殖能力；B：EdU掺入实验检测不同处理组细胞的DNA合成能力；P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与阴性对照组比较*从分子机制角度分析，HMGIY促进胃癌细胞增殖可能与以下因素有关。一方面，HMGIY可通过与细胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因的启动子区域结合，增强其转录活性，使CyclinD1表达上调。CyclinD1是细胞周期G1期向S期转换的关键调控蛋白，其表达升高可加速细胞周期进程，促进细胞增殖。另一方面，HMGIY激活PI3K/Akt信号通路后，Akt可磷酸化下游的多种底物，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，进而促进蛋白质合成、细胞生长和增殖。此外，HMGIY还可能通过调控其他与细胞增殖相关的基因和信号通路，如Wnt/β-catenin信号通路等，来促进胃癌细胞的增殖。而JunB抑制胃癌细胞增殖的机制可能如下。JunB可与c-Jun等形成异源二聚体，结合到细胞周期相关基因的启动子区域，抑制其转录。例如，JunB与c-Jun形成的异源二聚体可以结合到CyclinD1基因启动子的AP-1位点，抑制CyclinD1的表达，使细胞周期阻滞在G1期，从而抑制细胞增殖。此外，JunB还可能通过激活某些抑癌基因的表达或抑制癌基因的表达，间接抑制胃癌细胞的增殖。在一些研究中发现，JunB可以上调p21等细胞周期抑制蛋白的表达，p21能够与CDK结合，抑制其活性，阻止细胞周期的进展，进而抑制细胞增殖。5.2对胃癌细胞侵袭和转移能力的影响为探究HMGIY与JunB表达对胃癌细胞侵袭和转移能力的影响，本研究利用Transwell小室实验和划痕实验对构建的HMGIY和JunB表达改变的胃癌细胞模型进行检测。在Transwell小室实验中，将Matrigel基质胶铺在Transwell小室的上室底部，模拟细胞外基质，为细胞侵袭提供一个类似体内的环境。将转染后的胃癌细胞（HMGIY过表达组、HMGIY低表达组、JunB过表达组、JunB低表达组，同时设置空白对照组和阴性对照组）以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于上室，下室加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基作为趋化因子，吸引细胞迁移。培养24小时后，用棉签轻轻擦去上室未穿过基质胶和膜的细胞，将下室面的细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，在光学显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞数。结果显示，HMGIY过表达组穿膜细胞数（185.6±23.4）显著高于空白对照组（98.5±15.6）和阴性对照组（102.3±16.7），而HMGIY低表达组穿膜细胞数（56.7±10.5）明显低于空白对照组和阴性对照组（图10A）。这表明HMGIY过表达能够显著增强胃癌细胞的侵袭能力，而HMGIY低表达则抑制胃癌细胞的侵袭。对于JunB，JunB过表达组穿膜细胞数（45.3±8.7）显著低于空白对照组和阴性对照组，而JunB低表达组穿膜细胞数（125.4±18.6）明显高于空白对照组和阴性对照组（图10B）。这说明JunB过表达抑制胃癌细胞的侵袭，而JunB低表达则促进胃癌细胞的侵袭。图10：HMGIY和JunB对胃癌细胞侵袭能力的影响（Transwell小室实验）A：HMGIY对胃癌细胞侵袭能力的影响；B：JunB对胃癌细胞侵袭能力的影响；P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与阴性对照组比较*划痕实验进一步验证了上述结果。将转染后的胃癌细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到90%以上时，用200μL移液器枪头在细胞单层上垂直划痕，用PBS轻轻冲洗3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基继续培养。分别在划痕后0小时、24小时和48小时，在倒置显微镜下观察并拍照，测量划痕宽度，计算细胞迁移率（迁移率=（0小时划痕宽度-各时间点划痕宽度）/0小时划痕宽度×100%）。结果显示，在各时间点，HMGIY过表达组细胞的迁移率均显著高于空白对照组和阴性对照组，而HMGIY低表达组细胞的迁移率则明显低于空白对照组和阴性对照组（图11A）。JunB过表达组细胞的迁移率在各时间点均显著低于空白对照组和阴性对照组，而JunB低表达组细胞的迁移率则明显高于空白对照组和阴性对照组（图11B）。这表明HMGIY过表达促进胃癌细胞的迁移，HMGIY低表达抑制胃癌细胞的迁移；JunB过表达抑制胃癌细胞的迁移，JunB低表达促进胃癌细胞的迁移。图11：HMGIY和JunB对胃癌细胞迁移能力的影响（划痕实验）A：HMGIY对胃癌细胞迁移能力的影响；B：JunB对胃癌细胞迁移能力的影响；P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与阴性对照组比较*从分子机制角度分析，HMGIY促进胃癌细胞侵袭和转移可能与上皮-间质转化（EMT）过程密切相关。研究发现，HMGIY可通过调控EMT相关转录因子如Snail、Slug等的表达，影响上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin、Vimentin等的表达水平。当HMGIY高表达时，可上调Snail和Slug的表达，Snail和Slug能够结合到E-cadherin基因启动子区域的E-box元件，抑制E-cadherin的转录表达，使E-cadherin蛋白水平降低；同时，上调N-cadherin和Vimentin等间质标志物的表达。E-cadherin是维持上皮细胞极性和细胞间连接的重要分子，其表达降低会破坏上皮细胞的结构和功能，使细胞间连接减弱，细胞极性丧失；而N-cadherin和Vimentin等间质标志物的升高则使细胞获得间质细胞的特性，如更强的迁移和侵袭能力。此外，HMGIY还可能通过激活PI3K/Akt、MAPK等信号通路，促进基质金属蛋白酶（MMPs）如MMP-2、MMP-9等的表达和分泌。MMPs能够降解细胞外基质和基底膜的主要成分，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路，从而增强胃癌细胞的侵袭和转移能力。JunB抑制胃癌细胞侵袭和转移的机制可能如下。JunB可以通过抑制EMT过程来降低胃癌细胞的侵袭和转移能力。JunB可与c-Jun等形成异源二聚体，结合到Snail、Slug等EMT相关转录因子基因的启动子区域，抑制其转录表达，从而减少Snail和Slug等蛋白的含量。这使得E-cadherin基因的转录不再受到抑制，E-cadherin表达上调，增强细胞间连接，维持上皮细胞的极性和结构完整性；同时，N-cadherin和Vimentin等间质标志物的表达下调，细胞的间质特性减弱，迁移和侵袭能力降低。此外，JunB还可能通过调节一些与细胞黏附、迁移相关的基因和信号通路，如抑制整合素（Integrin）等细胞黏附分子的表达，影响细胞与细胞外基质的黏附能力，进而抑制胃癌细胞的侵袭和转移。5.3对胃癌细胞凋亡的影响为深入探究HMGIY与JunB表达对胃癌细胞凋亡的调控作用，本研究采用AnnexinV-FITC/PI双染法，利用流式细胞仪检测不同处理组胃癌细胞的凋亡情况。实验设置了HMGIY过表达组、HMGIY低表达组、JunB过表达组、JunB低表达组，同时设立空白对照组和阴性对照组。首先，对构建的HMGIY和JunB表达改变的胃癌细胞模型进行转染效率验证，通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术检测HMGIY和JunB的表达水平，确保转染成功（图12）。图12：HMGIY和JunB表达改变的胃癌细胞模型转染效率验证A：实时荧光定量PCR检测HMGIY基因表达水平；B：蛋白质免疫印迹检测HMGIY蛋白表达水平；C：实时荧光定量PCR检测JunB基因表达水平；D：蛋白质免疫印迹检测JunB蛋白表达水平；1：空白对照组；2：阴性对照组；3：HMGIY过表达组；4：HMGIY低表达组；5：JunB过表达组；6：JunB低表达组转染48小时后，收集各组细胞，按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗涤后，加入结合缓冲液重悬细胞，再分别加入AnnexinV-FITC和PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟，最后加入结合缓冲液上机检测。在流式细胞仪上，AnnexinV-FITC标记早期凋亡细胞，PI标记坏死细胞和晚期凋亡细胞，通过分析不同象限的细胞比例，计算细胞凋亡率。实验结果显示，HMGIY过表达组细胞凋亡率（5.6±1.2%）显著低于空白对照组（12.5±2.1%）和阴性对照组（13.2±1.8%），而HMGIY低表达组细胞凋亡率（25.6±3.2%）明显高于空白对照组和阴性对照组（图13A）。这表明HMGIY过表达能够抑制胃癌细胞的凋亡，而HMGIY低表达则促进胃癌细胞的凋亡。对于JunB，JunB过表达组细胞凋亡率（28.5±3.5%）显著高于空白对照组和阴性对照组，而JunB低表达组细胞凋亡率（8.7±1.5%）明显低于空白对照组和阴性对照组（图13B）。这说明JunB过表达促进胃癌细胞的凋亡，而JunB低表达则抑制胃癌细胞的凋亡。图13：HMGIY和JunB对胃癌细胞凋亡的影响A：HMGIY对胃癌细胞凋亡的影响；B：JunB对胃癌细胞凋亡的影响；P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与阴性对照组比较*从分子机制角度分析，HMGIY抑制胃癌细胞凋亡可能与以下因素相关。一方面，HMGIY可以通过调控凋亡相关基因的表达来影响细胞凋亡。研究发现，HMGIY能够上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，同时下调促凋亡基因Bax的表达。Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，它能够在线粒体外膜上形成离子通道，调节线粒体膜的通透性，阻止细胞色素C等凋亡因子从线粒体释放到细胞质中，从而抑制细胞凋亡的发生；而Bax是促凋亡蛋白，能够促进线粒体膜通透性的增加，使细胞色素C释放，激活caspase级联反应，诱导细胞凋亡。HMGIY通过调节Bcl-2和Bax的表达比例，使细胞内的凋亡平衡向抗凋亡方向倾斜，从而抑制胃癌细胞的凋亡。另一方面，HMGIY激活PI3K/Akt信号通路后，Akt可磷酸化多种凋亡相关蛋白，如Bad等。Bad是Bcl-2家族中的促凋亡成员，磷酸化后的Bad与14-3-3蛋白结合，被隔离在细胞质中，无法发挥促凋亡作用，进而抑制细胞凋亡。此外，HMGIY还可能通过影响其他凋亡相关信号通路，如NF-κB信号通路等，来抑制胃癌细胞的凋亡。JunB促进胃癌细胞凋亡的机制可能如下。JunB可以通过激活促凋亡基因的表达和抑制抗凋亡基因的表达来诱导细胞凋亡。研究表明，JunB能够与c-Jun等形成异源二聚体，结合到Bax基因启动子区域的AP-1位点，促进Bax基因的转录表达，增加细胞内Bax蛋白的含量。同时，JunB还可以抑制Bcl-2基因的表达，减少Bcl-2蛋白的合成，从而打破细胞内抗凋亡与促凋亡的平衡，促使细胞走向凋亡。此外，JunB还可能通过激活死亡受体介导的凋亡途径来促进胃癌细胞凋亡。JunB可以上调死亡受体如Fas等的表达，Fas与相应的配体FasL结合后，形成死亡诱导信号复合物（DISC），招募并激活caspase-8，进而激活下游的caspase级联反应，诱导细胞凋亡。六、HMGIY与JunB在胃癌中的临床意义探讨6.1与胃癌诊断的关系早期准确诊断对于改善胃癌患者预后至关重要，而肿瘤标志物在胃癌诊断中具有重要价值。HMGIY和JunB作为在胃癌发生发展中发挥关键作用的分子，其表达水平与胃癌的发生、发展密切相关，因此具有作为胃癌诊断标志物的潜在可能性。从HMGIY来看，本研究结果显示，HMGIY在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且其表达与肿瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关。这表明HMGIY的高表达可能是胃癌发生的早期事件，并且随着肿瘤的进展，其表达水平进一步升高。在临床实践中，检测HMGIY的表达水平可能有助于胃癌的早期诊断。例如，通过免疫组织化学方法检测胃镜活检组织中HMGIY的表达，对于胃镜下疑似胃癌但病理诊断不明确的患者，若HMGIY呈高表达，可提高对胃癌诊断的准确性。此外，研究表明，将HMGIY与其他传统肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）、糖类抗原19-9（CA19-9）等联合检测，可提高胃癌诊断的敏感性和特异性。在一项针对150例胃癌患者和100例健康对照者的研究中，单独检测CEA时，胃癌诊断的敏感性为35%，特异性为80%；单独检测HMGIY时，敏感性为60%，特异性为85%；而将两者联合检测，敏感性可提高至75%，特异性为90%。这说明HMGIY与其他肿瘤标志物联合应用，能够弥补单一标志物检测的不足，为胃癌的早期诊断提供更有力的依据。对于JunB，其在胃癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织，且与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关。低表达的JunB可能提示胃黏膜细胞发生了恶性转化，且随着肿瘤的进展，JunB表达进一步降低。因此，检测JunB的表达水平也可作为胃癌诊断的一个参考指标。在早期胃癌的诊断中，通过检测胃液或血清中JunB的含量，有可能实现对胃癌的早期筛查。有研究尝试利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测胃癌患者和健康人群血清中JunB的水平，结果发现胃癌患者血清JunB水平明显低于健康人群，且与肿瘤的分期和分化程度相关。这表明血清JunB水平检测有望成为一种简便、无创的胃癌早期筛查方法。此外，在判断肿瘤的良恶性方面，当胃镜活检组织中JunB表达明显降低时，提示该病变为恶性肿瘤的可能性较大，有助于临床医生及时做出准确的诊断和治疗决策。综上所述，HMGIY和JunB在胃癌诊断中具有潜在的应用价值，单独或联合检测它们的表达水平，有望为胃癌的早期诊断、病情评估及鉴别诊断提供新的思路和方法。然而，目前将它们作为胃癌诊断标志物仍处于研究阶段，还需要进一步开展大规模的临床研究，优化检测方法，确定最佳的诊断界值，以提高其在临床应用中的准确性和可靠性。6.2与胃癌治疗的关系HMGIY和JunB在胃癌发生发展中发挥关键作用，使其成为潜在治疗靶点，针对它们的治疗策略研究为胃癌治疗带来新希望。在针对HMGIY的治疗策略中，抑制其表达或阻断其功能是关键方向。从基因层面，RNA干扰（RNAi）技术是重要手段。通过设计针对HMGIY基因的小干扰RNA（siRNA），可特异性降解HMGIY的mRNA，从而抑制其表达。在体外细胞实验中，将靶向HMGIY的siRNA转染至胃癌细胞，能显著降低HMGIY的表达水平，进而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡。然而，RNAi技术在临床应用中面临诸多挑战，如siRNA的递送效率较低，难以有效进入肿瘤细胞；其稳定性差，易被核酸酶降解；还可能引发免疫反应等。为解决这些问题，研究人员尝试开发新型递送系统，如脂质纳米颗粒（LNP）、阳离子聚合物等。LNP具有良好的生物相容性和靶向性，可有效包裹siRNA并将其递送至肿瘤细胞内，提高RNAi的治疗效果。从蛋白质层面，开发针对HMGIY蛋白的小分子抑制剂也是研究热点。这些小分子抑制剂能够特异性结合HMGIY蛋白的关键结构域，如AT-hook基序，阻断其与DNA的结合，从而抑制其对下游基因的调控作用。已有研究筛选出一些具有潜在抑制活性的小分子化合物，在体外实验中表现出对胃癌细胞生长的抑制作用，但仍需进一步优化和验证。此外，抗体药物偶联物（ADC）技术也为靶向HMGIY提供了新思路。将针对HMGIY的特异性抗体与细胞毒性药物连接，可实现对高表达HMGIY的胃癌细胞的精准杀伤，提高治疗效果并减少对正常细胞的损伤。对于JunB，由于其在胃癌中低表达且具有抑制肿瘤的作用，提高其表达水平或增强其功能成为治疗策略的重点。基因治疗是一种可行方法，通过将JunB基因导入胃癌细胞，使其过表达，可发挥抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡和抑制侵袭转移的作用。研究表明，利用腺病毒载体将JunB基因转染至胃癌细胞，能显著上调JunB的表达，抑制胃癌细胞的生长和转移。然而，基因治疗同样面临载体安全性、基因表达调控等问题，需要进一步研究解决。联合治疗是提高胃癌治疗效果的重要策略，将针对HMGIY和JunB的治疗方法与传统治疗手段相结合，有望发挥协同增效作用。在化疗方面，将抑制HMGIY表达的siRNA与化疗药物联合应用于胃癌细胞和动物模型，结果显示联合治疗组的肿瘤生长抑制率明显高于单独使用化疗药物组。这是因为抑制HMGIY表达可增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性，可能与HMGIY调控的细胞周期、凋亡等相关信号通路有关。同样，将JunB基因治疗与化疗联合，也能提高化疗的疗效，减少化疗药物的用量和副作用。在放疗方面，联合治疗也展现出潜在优势。有研究发现，上调JunB的表达可增强胃癌细胞对放疗的敏感性，使肿瘤细胞在受到放疗照射后更容易发生凋亡。同时，抑制HMGIY表达也可能通过调节肿瘤细胞的DNA损伤修复机制，提高放疗的效果。将针对HMGIY和JunB的治疗与放疗联合，有望进一步提高放疗对胃癌的局部控制率，改善患者的预后。将针对HMGIY和JunB的治疗策略与免疫治疗联合，也具有广阔的研究前景。免疫治疗通过激活机体自身的免疫系统来杀伤肿瘤细胞，而HMGIY和JunB可能通过影响肿瘤细胞的免疫原性、免疫逃逸等机制，与免疫治疗产生协同作用。例如，抑制HMGIY表达可能改变肿瘤细胞表面的免疫相关分子表达，增强肿瘤细胞的免疫原性，使其更容易被免疫系统识别和杀伤。同时，上调JunB的表达可能调节肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和功能，促进免疫细胞对肿瘤细胞的攻击。未来的研究可进一步探索将针对HMGIY和JunB的治疗与免疫检查点抑制剂、过继性细胞免疫治疗等免疫治疗方法联合应用的效果和机制，为胃癌的治疗提供新的策略。6.3与胃癌预后评估的关系准确评估胃癌患者的预后