（正式版）DB15∕T 2690-2022 《青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏技术规程》

152022-07-15发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC1城师范学院、巴林左旗林业和草原局、内蒙古伊禾绿锦农业发展有I青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏技术规程GB/T4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质GB/T6682分析实验室用水规格和SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制应使分离和保藏的菌种不染杂菌，使退化和死亡降到最低应保证菌种分离和保藏的安全性，不能对周围环境造成污染和恒温培养箱：5℃~60℃。厌氧培养装置：5℃~60℃。冰箱：4℃冰箱、超低温冰箱（-50℃~-86℃)。光学显微镜：4×~100×。水浴锅：0℃~100℃。126.2稀释液：称取氯化钠8.5g,溶于1000mL蒸馏水中，分装后，121℃高压灭菌30min。6.3所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682三级水规格。以无菌操作称取10g样品置于盛有90mL无菌生理盐水的聚乙烯均质袋内，用拍打式无菌均质器拍打2min,制成1:10的样品菌液。用1mL无菌吸管(移液枪)吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL无菌水的无菌试管×10²、1→1×10³、1→1×10⁴,1→1×10⁵稀释的样品菌液(每个稀释度应更换移液管或枪头)。 (可包括原液),吸取20μL样品菌液于制备好养皿翻转，倒置于恒温培养箱(乳酸菌：30℃厌氧条件下培养72h)。过革兰氏染色(呈阳性)和过氧化氢(呈阴性)试验，初步判断乳酸菌种类。用接种环挑取典型菌落1~2于MRS琼脂斜面培养基上，用接种环从底部自下而上划密“之”字形线，在30℃恒温厌氧培养箱中培养48h～72h,重复划线分离培养3次，得到纯化的单菌株。乳酸菌菌种分离及筛选程序见图1。将分离纯化的乳酸菌菌液混匀并提取其悬液以6%的浓度接种至MRS培养基中，恒温培养(37℃)将乳酸菌菌株以3%的浓度接种于MRS液体培养基，分别在4℃,10℃,30℃,45℃条件下进行培养，其中4℃培养10d,10℃与30℃培养3d,45℃培养7d,培养结束后观察乳酸菌菌株对温度3的响应情况。分别在pH值为3.0,3.5,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0以及浓度为3.0%和6.5%NaCl的MRS液体培养基中30℃培养48h,观察乳酸菌菌株对酸碱与盐的耐受能力。采用紫外可见分光光度计测生长：0.5小于OD值小于0.1,不生长：OD值小于0.2,生长好：OD值大于1.0)。用细菌微量生化鉴定管检测乳酸菌菌株对49种碳源的利用情况，均重复测定3次。样品采集10g样品+90mL无菌水，利用拍打式无菌均质器提取浸提液10倍系列稀释样品采集10g样品+90mL无菌水，利用拍打式无菌均质器提取浸提液10倍系列稀释菌种分离选择2~3个适宜稀释度的样品浸提液，各取20μL分别加入无菌配备好的固体培养皿中培养根据菌落形态特征和生长状况选择并分离纯化乳酸菌菌株形态学观察、革兰氏染色、过氧化氢实验进行初检乳酸菌的筛选生理生化特性和耐受性试验产酸能力和生长繁殖能力测定耐酸和耐盐试验糖发酵试验MgSO4•7H2OMnSO4•4H2O4B.3.3保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冰箱、冷库等的温度、湿度，不可使培养基干枯，如发B.3.4在传代过程中，将保藏菌种在营养贫乏和丰富的新鲜培养基中作交替培养，有利于保持菌种的B.3.5每次移植培养后，应于原保藏菌株及其登记卡片（包含菌株名称、编号、所用培养基等信息）B.3.6保藏菌种的移植不宜频繁，每按照GB/T4789.28和SN/T15用接种环从斜面底部自下而上划稀“之”字形线。用接种铲挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到），挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基将接种后的培养基放入30℃~38℃的恒温培养箱中，培养至良好状态，根据菌种类别确定设定温培养好的菌种于4℃~6℃保藏，有些菌种（如：部分弧菌、假单胞菌等）4℃~6℃容易死亡，基中，在30℃~38℃培养，根据菌种类别确定设定温度。6本方法适用于大多数需要长期保藏的细菌、真菌、放线菌、C.3.3注意低温冰箱的故障和停电事故，可以在低温槽内留有一定的空间，如果发生使低温冰箱温度min，备用。也可使用商品化的菌种保藏管。注意冻存管不能有裂纹。5mm～10mm