miRNA-329对血管内皮受体CD146的调控机制与功能解析

miRNA-329对血管内皮受体CD146的调控机制与功能解析一、引言1.1研究背景在生命科学领域，微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）与细胞表面分子CD146作为两个关键的研究对象，各自在生物过程中发挥着不可或缺的作用，它们之间的关联研究也逐渐成为前沿热点。miRNA是一类内源性的非编码单链RNA，长度通常在17-22个核苷酸。其作用机制独特而精妙，通过5′端（2-7个碱基对）与靶信使核糖核酸（mRNA）的3′端非编码区（3′-UTR）序列特异性互补结合，实现对基因表达的调控，具体方式包括降解mRNA或抑制mRNA翻译。这种调控过程广泛参与细胞生长、发育、凋亡以及疾病发生等多种生物学过程。据统计，人类基因组中约有超过1000个miRNA被预测存在，约50%的miRNA基因位于基因组的薄弱位点，这些区域在人类癌症中常出现异常扩增或缺失，进而导致miRNA表达异常，与肿瘤的发生发展紧密相关。例如，在胶质母细胞瘤、胰腺癌、神经母细胞瘤等多种肿瘤中，mir-329作为一种重要的miRNA，呈现低表达状态，发挥着肿瘤抑制因子的作用。CD146，又称黑色素瘤细胞粘附分子，是一种新型的跨膜糖蛋白。在正常细胞中，其主要分布于血管内皮细胞的间质区，包括网状纤维细胞、平滑肌细胞和淋巴管内皮细胞等。而在肿瘤细胞中，CD146也广泛表达，并且在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中扮演着重要角色。一方面，它参与肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附过程，使得肿瘤细胞能够在血管内皮细胞上形成转移瘤的前哨基地，为肿瘤转移提供了可能。例如，肝癌细胞通过表达CD146来增强其对微血管内皮细胞的粘附和侵袭能力，进而促进肿瘤的转移和浸润。另一方面，CD146可以调节肿瘤细胞的细胞外基质降解酶，促进肿瘤细胞透过基底膜侵入周围组织。相关研究表明，它能够通过调节基质金属蛋白酶（MMPs）的表达和活性，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。同时，CD146还作为信号转导分子，通过PI3K-Akt、ERK1/2等信号通路，参与调节肿瘤细胞迁移和浸润。在脂肪代谢领域，CD146也展现出关键作用。研究发现，在脂肪前体细胞中，CD146分子是脂肪细胞因子ANGPTL2的受体，二者相互作用通过激活CREB蛋白，促进白色脂肪细胞的分化；在成熟白色脂肪细胞中，它们的互作调控炎症因子的分泌、促进脂质合成并抑制脂肪酸氧化，从而促进肥胖的发生。在肿瘤研究中，肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，抑制肿瘤新生血管成为治疗恶性肿瘤的重要策略。肿瘤的发生发展会产生多种血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子（TNF）等，其中血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）对血管生成起关键作用。CD146可作为VEGFR-2的共同受体参与血管生成，在病理性血管生成期间，异常上调的CD146增强了VEGF诱导的SRC激酶家族（SKF）/p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB活化的内皮反应，进一步促进内皮细胞迁移和血管形成。研究表明，在宫颈上皮不典型增生（CIN）和宫颈鳞状细胞癌（SCC）中，VEGF和VEGFR-2高表达，而促进肿瘤血管生成的重要黏附分子CD146在宫颈癌细胞中也呈高表达状态。通过实验验证，CD146为mir-329的直接靶基因，在mir-329模拟物转染后的动物实验中，抑制血管上过度表达的CD146，可使病理性血管生成的小鼠模型中显著减弱新血管的形成，证实了CD146在血管生成中的表达受mir-329调控。这一发现揭示了miR-329与CD146在肿瘤血管生成中的关联，为肿瘤治疗提供了新的靶点和思路。在心血管疾病方面，近年来的研究逐渐揭示出miRNA和CD146在其中的重要作用。miRNA参与心血管疾病的多个病理生理过程，如心肌肥大、心力衰竭、心律失常、动脉粥样硬化等。例如，miR-1和miR-133在心肌肥大和心力衰竭等心血管疾病中表达上调，通过调控心肌细胞的生长和凋亡，影响心脏功能。而CD146在心血管系统中也具有重要功能，它在血管内皮细胞中的表达与血管的稳定性和功能密切相关。在动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展过程中，CD146的表达变化可能参与了血管内皮细胞的损伤和炎症反应等病理过程。然而，目前对于miR-329与CD146在心血管疾病中的相互作用机制研究还相对较少，深入探究它们之间的关系，有望为心血管疾病的发病机制研究和治疗提供新的方向。综上所述，miR-329与CD146之间的分子调控机制研究具有重要的理论和实践意义。在肿瘤领域，深入了解它们的关系有助于揭示肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制，为开发新型的肿瘤治疗策略提供理论基础。在心血管疾病方面，研究二者的关联可能为心血管疾病的发病机制研究提供新的视角，有助于发现新的诊断标志物和治疗靶点。因此，开展miR-329调控血管内皮受体CD146的分子机制及其功能的研究迫在眉睫。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究miR-329调控血管内皮受体CD146的分子机制及其功能，从分子、细胞和动物模型等多个层面展开研究，以期揭示它们在肿瘤血管生成以及心血管疾病等病理过程中的作用机制，为相关疾病的治疗提供新的理论依据和潜在治疗靶点。在肿瘤治疗方面，恶性肿瘤严重威胁人类健康，肿瘤血管生成是肿瘤生长、转移的关键环节。目前针对肿瘤血管生成的治疗策略存在诸多局限性，如耐药性、副作用等。深入研究miR-329与CD146的调控关系，有望揭示肿瘤血管生成的新机制，为开发更加有效的肿瘤抗血管生成治疗策略提供理论支持。例如，若能明确miR-329如何精准调控CD146来影响肿瘤血管生成，就可以通过设计药物或治疗手段，特异性地调节这一调控轴，抑制肿瘤血管生成，从而达到抑制肿瘤生长和转移的目的，为肿瘤患者带来新的治疗希望。在心血管疾病治疗方面，心血管疾病是全球范围内的主要死因之一，其发病机制复杂，涉及多种细胞和分子机制。miRNA和CD146在心血管疾病中的作用逐渐受到关注，但它们之间的相互作用机制尚不清楚。研究miR-329调控CD146在心血管疾病中的功能，有助于揭示心血管疾病的发病机制，为心血管疾病的早期诊断、预后评估和治疗提供新的生物标志物和治疗靶点。比如，通过检测miR-329和CD146的表达水平，可能实现对心血管疾病的早期诊断和病情监测；针对它们的调控关系开发的治疗药物，或许能够有效干预心血管疾病的发展进程，改善患者的预后。本研究对于理解miR-329与CD146在生理和病理条件下的作用具有重要的理论意义，也为肿瘤、心血管疾病等相关疾病的临床治疗提供了潜在的应用价值，有望推动相关领域的医学发展，改善患者的健康状况和生活质量。二、miRNA-329与CD146概述2.1miRNA-329简介miRNA-329作为微小核糖核酸家族中的重要成员，其结构独特且精巧。它是一类内源性的非编码单链RNA，长度大约在22个核苷酸左右。这种短小的核苷酸链蕴含着强大的生物学调控能力，通过与靶mRNA的3′端非编码区（3′-UTR）进行特异性互补结合，实现对基因表达的精细调控，其作用方式主要包括降解mRNA或抑制mRNA翻译过程。miRNA-329定位于染色体14q32.31上。值得注意的是，约12%的人类miRNA基因分布在14号染色体的这一区域，该区域存在不稳定脆性，容易发生基因杂合性丢失，这一特性使其成为导致恶性肿瘤发生的危险因素之一。在生物学功能方面，miRNA-329展现出多样且关键的作用，尤其在肿瘤相关过程中，常作为一种肿瘤抑制因子发挥功效。在胶质母细胞瘤中，miRNA-329表达水平显著降低，其低表达状态与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强相关。研究表明，上调miRNA-329的表达可以抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并且降低其侵袭和迁移能力。在胰腺癌中，同样存在miRNA-329低表达的现象，恢复miRNA-329的表达能够抑制胰腺癌细胞的生长和转移。相关实验显示，将miRNA-329模拟物转染到胰腺癌细胞中，细胞的增殖活性明显下降，迁移和侵袭能力也受到显著抑制。在神经母细胞瘤中，miRNA-329也扮演着肿瘤抑制的角色，其表达水平与肿瘤的恶性程度呈负相关。临床研究数据表明，神经母细胞瘤患者中，miRNA-329表达较低的患者预后往往较差，而通过基因治疗等手段提高miRNA-329的表达，可以改善肿瘤的生物学行为。在宫颈癌研究中，发现宫颈癌组织中miRNA-329的表达水平明显低于相邻正常宫颈组织。进一步研究揭示，miRNA-329可作用于肿瘤血管内皮标志分子CD146，通过抑制CD146的表达，进而抑制新生血管的形成，在宫颈癌中发挥抑癌基因作用。在胃癌方面，有研究探讨了miR-329通过负性调节KDM1A抑制胃癌细胞增殖及侵袭的机制。实验将人胃腺癌细胞系（BGC-823）分为BGC-823癌细胞组、miR-329mimics组、miR-329inhibitor组，通过MTT测定、结晶紫染色、流式细胞仪测定、Transwell细胞迁移实验等多种方法检测细胞增殖、凋亡、周期及侵袭情况。结果显示，miR-329mimics组OD值、存活率、克隆形成数目、穿膜数低于BGC-823癌细胞组，miR-329inhibitor组则相反。同时，miR-329mimics组细胞凋亡率、G1期、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9蛋白表达水平高于BGC-823癌细胞组，miR-329inhibitor组低于BGC-823癌细胞组和miR-329mimics组。且miRNA-329与KDM1A呈负相关，与Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9呈正相关。这表明miR-329可抑制胃癌细胞增殖及侵袭，其机制与miR-329可能通过抑制KDM1A的表达导致Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9高表达有关。miRNA-329还可能参与心血管疾病相关的生理病理过程，尽管目前相关研究相对较少，但已有研究提示其在心血管系统中的潜在作用。在心肌细胞的发育和分化过程中，miRNA-329可能通过调控相关基因的表达，影响心肌细胞的正常功能。在血管内皮细胞中，miRNA-329的表达变化或许与血管的稳定性和功能调节存在关联。未来深入探究miRNA-329在心血管疾病中的具体作用机制，将为心血管疾病的防治提供新的思路和靶点。2.2CD146简介CD146，又被称为黑色素瘤细胞粘附分子（Mel-CAM或MCAM）以及膜糖蛋白MUC18，是免疫球蛋白（Ig）超家族的重要成员，属于一种跨膜糖蛋白。其编码基因较为独特，基因跨度达14kb，包含16个外显子，是单拷贝基因。从结构上看，CD146编码的跨膜糖蛋白由胞外区、跨膜区和胞浆区三个主要部分构成。胞外区含有5个免疫球蛋白功能域，具体包括三个恒定区和两个可变区。这些区域中，氨基酸形成的β折叠片段间通过二硫化物交联，使得Ig样区能够保持稳定状态，这种稳定结构对于CD146与其他分子的相互作用至关重要。跨膜区则是连接胞外区和胞浆区的桥梁，由特定数量的氨基酸残基组成，其结构特点决定了CD146在细胞膜上的锚定和定位。胞浆短尾由64个氨基酸残基组成，其中含有蛋白激酶的识别位点，这一结构特征赋予了CD146参与细胞信号转导的功能，使其能够将细胞外的信号传递到细胞内，进而调节细胞的各种生理活动。此外，CD146存在两种亚型，分别为MCAM-1和MCAM-s。这两种亚型虽然在粘附性方面具有相似性，但它们在胞质中的分布区域有所不同。值得注意的是，MCAM-l是在人类肿瘤中发现的唯一亚型，这暗示了其在肿瘤发生发展过程中可能具有特殊的作用。同时，CD146还存在可溶性形式，并且在多项研究中已被成功检测到，但其具体的生物学功能和作用机制仍有待进一步深入探究。在正常生理状态下，CD146主要分布于血管内皮细胞的间质区，这一分布特点使其在血管相关的生理过程中发挥着关键作用。具体而言，它参与了内皮细胞的同型粘附过程，对于维持单层内皮细胞的完整性具有重要意义。这种粘附作用并非依赖于钙，而是通过独特的分子机制实现的。CD146还在血管生成过程中扮演着重要角色。研究发现，在病理性血管生成期间，CD146的表达会出现异常上调的情况。异常上调的CD146能够增强VEGF诱导的SRC激酶家族（SKF）/p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB活化的内皮反应，进而促进内皮细胞迁移和血管形成。这一过程涉及到复杂的信号转导通路和分子间的相互作用。在胚胎发育过程中，CD146在血管系统的发育和形成中也发挥着不可或缺的作用。它可能通过调节内皮细胞的增殖、分化和迁移等过程，影响血管的形态发生和功能完善。在神经系统中，CD146也有广泛表达，并且参与神经发育过程，对神经细胞的生长、分化和迁移等过程产生影响。在肿瘤相关的病理过程中，CD146的作用尤为显著。在多种肿瘤细胞中，CD146呈现高表达状态。在黑色素瘤中，CD146的高表达与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关。研究表明，CD146可以促进黑色素瘤细胞与细胞外基质中的配体相互作用，介导细胞之间的黏附和信号转导，从而增强黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力。在前列腺癌中，CD146的表达水平与肿瘤的恶性程度和预后相关。高表达CD146的前列腺癌患者往往预后较差，肿瘤更容易发生转移和复发。在乳腺癌中，CD146同样参与了肿瘤细胞的迁移和侵袭过程。它可能通过调节相关信号通路，影响乳腺癌细胞的生物学行为，促进肿瘤的转移。CD146在肿瘤转移过程中发挥着关键作用。它参与了肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附过程。肿瘤细胞通过表达CD146，能够与血管内皮细胞表面的相应分子结合，从而在血管内皮细胞上形成转移瘤的前哨基地。这一过程为肿瘤细胞进入血液循环并发生远处转移提供了重要的基础。例如，肝癌细胞通过高表达CD146，增强了对微血管内皮细胞的粘附和侵袭能力，使得肿瘤细胞更容易突破血管屏障，进入血液循环，进而在远处器官形成转移灶。CD146还可以调节肿瘤细胞的细胞外基质降解酶。它能够通过调节基质金属蛋白酶（MMPs）的表达和活性，促进肿瘤细胞透过基底膜侵入周围组织。MMPs是一类能够降解细胞外基质成分的酶，它们在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起着重要作用。CD146通过调控MMPs的表达和活性，为肿瘤细胞的迁移和侵袭创造了有利条件。作为信号转导分子，CD146能够通过PI3K-Akt、ERK1/2等信号通路，参与调节肿瘤细胞迁移和浸润。这些信号通路在细胞的生长、增殖、凋亡和迁移等过程中发挥着关键作用。CD146通过激活这些信号通路，调节肿瘤细胞内相关基因的表达，从而影响肿瘤细胞的迁移和浸润能力。在脂肪代谢领域，CD146也展现出独特的功能。研究发现，在脂肪前体细胞中，CD146分子是脂肪细胞因子ANGPTL2的受体。二者相互作用后，通过激活CREB蛋白，促进白色脂肪细胞的分化。在成熟白色脂肪细胞中，CD146与ANGPTL2的互作还调控着炎症因子的分泌、促进脂质合成并抑制脂肪酸氧化。这些作用最终导致脂肪细胞的脂肪堆积增加，从而促进肥胖的发生。这一发现揭示了CD146在脂肪代谢和肥胖发生发展过程中的重要作用，为肥胖相关疾病的研究和治疗提供了新的靶点和思路。三、miRNA-329调控血管内皮受体CD146的分子机制3.1生物信息学预测在探索miRNA-329与CD146之间潜在的靶向关系时，生物信息学预测发挥着至关重要的作用，它为后续的实验研究提供了重要的线索和方向。本研究主要借助了多种先进且广泛应用的生物信息学分析软件，其中包括TargetScan、StarBase和miRanda等，这些软件各自具备独特的算法和优势，能够从不同角度对miRNA与靶基因的相互作用进行预测。TargetScan是一款在miRNA靶基因预测领域极具权威性的软件。其预测原理基于对miRNA种子序列（5′端第2-8个碱基）与靶基因3′-UTR区互补配对的精确分析。在对miRNA-329和CD146的预测过程中，TargetScan通过扫描CD146基因的3′-UTR序列，寻找与miRNA-329种子序列高度互补的区域。如果发现存在这样的互补区域，软件会根据互补程度、位点保守性等多个参数，计算出一个预测得分，得分越高，则表明miRNA-329与CD146之间存在靶向关系的可能性越大。例如，当软件检测到CD146基因3′-UTR区某段序列与miRNA-329种子序列能够形成稳定的碱基配对，且该配对区域在不同物种间具有较高的保守性时，就会将其作为潜在的靶向作用位点输出。StarBase软件则另辟蹊径，它整合了丰富的高通量实验数据，如CLIP-Seq（紫外交联免疫沉淀测序）和PAR-CLIP（光活化核糖核苷增强的紫外交联免疫沉淀）数据。这些实验数据能够直接反映细胞内miRNA与靶mRNA的相互作用情况。在预测miRNA-329与CD146的靶向关系时，StarBase会在其庞大的数据库中搜索是否有关于这两者相互作用的实验证据。如果数据库中存在相关的CLIP-Seq或PAR-CLIP数据显示miRNA-329与CD146的3′-UTR存在结合信号，那么就可以有力地支持它们之间存在靶向关系的假设。这种基于实验数据的预测方式，大大提高了预测结果的可靠性。miRanda软件同样有着独特的预测策略。它综合考虑了miRNA与靶基因3′-UTR结合的自由能以及序列互补性等因素。通过复杂的算法，miRanda计算出miRNA-329与CD1463′-UTR结合时的自由能变化。自由能越低，说明两者结合越稳定，也就意味着它们之间存在靶向关系的可能性越高。同时，软件也会对两者的序列互补情况进行详细分析，判断互补碱基的数量和分布情况。当miRNA-329与CD1463′-UTR的互补区域满足一定的条件，且结合自由能低于设定的阈值时，miRanda就会将CD146识别为miRNA-329的潜在靶基因。通过上述三种生物信息学分析软件的综合预测，得到了一系列关于miRNA-329与CD146潜在靶向关系的结果。这些结果显示，在CD146基因的3′-UTR区存在多个与miRNA-329种子序列互补的位点。不同软件对于这些位点的预测虽然在细节上可能存在差异，但总体上呈现出一定的一致性。例如，在某些位点上，三种软件都预测到了miRNA-329与CD1463′-UTR的互补结合，这进一步增强了对这些潜在靶向关系的信心。然而，需要明确的是，生物信息学预测结果仅仅是基于算法和数据的推测，存在一定的假阳性和假阴性率。为了确凿地验证miRNA-329与CD146之间是否存在真实的靶向关系，还需要借助后续的实验验证，如荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Westernblot实验等。这些实验能够在实际的生物环境中，直接检测miRNA-329对CD146表达的影响，从而为两者之间的分子调控机制提供坚实的实验依据。3.2实验验证3.2.1荧光素酶报告基因实验荧光素酶报告基因实验是验证miRNA与靶基因靶向关系的关键实验手段，其原理基于miRNA与靶基因3′-UTR的特异性结合对荧光素酶表达的调控作用。在本研究中，该实验用于验证miRNA-329与CD1463′-UTR是否存在直接的结合。实验过程中，首先需要构建两种荧光素酶报告基因载体。一种是野生型载体，将包含CD146基因3′-UTR预测结合位点的野生型序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，如pGL3载体。另一种是突变型载体，通过定点突变技术，将CD146基因3′-UTR预测结合位点的关键碱基进行突变，使其无法与miRNA-329互补配对，然后将突变后的序列同样克隆到pGL3载体中。例如，若预测的miRNA-329与CD1463′-UTR的结合位点为“AGCUUCA”，则可以将其中的关键碱基进行替换，如变为“ACGUUCG”。将构建好的野生型和突变型荧光素酶报告基因载体分别与miRNA-329模拟物（mimics）或阴性对照（negativecontrol）共转染至适宜的细胞系中，如人胚肾293T细胞。转染过程需要使用高效的转染试剂，以确保载体和miRNA能够顺利进入细胞。在细胞内，若miRNA-329能够与CD1463′-UTR的野生型序列特异性结合，就会抑制荧光素酶的表达。而对于突变型载体，由于结合位点被破坏，miRNA-329无法与之结合，荧光素酶的表达不受影响。转染48小时后，收集细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。该试剂盒中含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的底物。萤火虫荧光素酶由我们构建的报告基因载体表达，而海肾荧光素酶则作为内参，用于校正转染效率和细胞裂解差异等因素对实验结果的影响。实验时，先加入萤火虫荧光素酶的底物，检测萤火虫荧光素酶产生的荧光信号强度，然后再加入海肾荧光素酶的底物，检测海肾荧光素酶的荧光信号强度。通过计算萤火虫荧光素酶信号与海肾荧光素酶信号的比值（即相对荧光素酶活性），可以准确评估miRNA-329对CD1463′-UTR的作用。若miRNA-329与CD1463′-UTR存在靶向结合关系，那么在共转染野生型荧光素酶报告基因载体和miRNA-329模拟物的细胞组中，相对荧光素酶活性会显著降低。这是因为miRNA-329与CD1463′-UTR结合后，抑制了荧光素酶的翻译过程，导致荧光素酶表达量减少，荧光信号减弱。而在共转染突变型荧光素酶报告基因载体和miRNA-329模拟物的细胞组中，相对荧光素酶活性应与阴性对照组无明显差异。因为突变后的3′-UTR无法与miRNA-329结合，荧光素酶的表达不受miRNA-329的影响，所以荧光信号强度保持正常水平。通过这样的实验设计和结果分析，可以明确miRNA-329与CD1463′-UTR是否存在直接的靶向结合关系，为后续深入研究它们之间的分子调控机制提供重要的实验依据。3.2.2WesternBlot与qRT-PCR实验WesternBlot和qRT-PCR实验是从蛋白质和基因转录水平，检测miRNA-329对CD146表达影响的重要方法，两者相互补充，能够全面地揭示miRNA-329对CD146的调控作用。在WesternBlot实验中，首先需要培养合适的细胞系，如人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。将细胞分为实验组和对照组，实验组转染miRNA-329模拟物，以提高细胞内miRNA-329的表达水平；对照组则转染阴性对照序列，确保其他实验条件一致。转染一定时间后，通常为48-72小时，收集细胞。使用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞，以充分提取细胞内的总蛋白质。通过BCA法等蛋白质定量方法，准确测定提取的蛋白质浓度，保证后续实验中各样本上样量的一致性。将定量后的蛋白质样品与上样缓冲液混合，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。SDS能够根据蛋白质分子量的大小，将不同的蛋白质分离开来。在电泳过程中，蛋白质在电场的作用下向正极移动，分子量较小的蛋白质移动速度较快，而分子量较大的蛋白质移动速度较慢。电泳结束后，利用湿转法或半干转法，将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。转移后的膜用含有5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）的封闭液进行封闭，以防止非特异性结合。封闭完成后，将膜与抗CD146的一抗孵育。一抗能够特异性地识别并结合CD146蛋白，形成抗原-抗体复合物。孵育时间一般为4℃过夜，以保证一抗与CD146充分结合。次日，用TBST缓冲液充分洗涤膜，去除未结合的一抗。然后，将膜与相应的二抗孵育。二抗能够识别并结合一抗，通常二抗上标记有辣根过氧化物酶（HRP）等可检测的标记物。孵育一段时间后，再次用TBST缓冲液洗涤膜，去除未结合的二抗。最后，使用化学发光底物，如ECL试剂，与膜上的HRP反应。HRP能够催化底物发光，通过曝光成像系统，如X光胶片或化学发光成像仪，检测膜上CD146蛋白的条带。条带的强度与CD146蛋白的表达量成正比，通过分析条带强度，可以直观地比较实验组和对照组中CD146蛋白表达水平的差异。如果miRNA-329能够抑制CD146的表达，那么实验组中CD146蛋白的条带强度应明显低于对照组。qRT-PCR实验则是从mRNA水平检测CD146的表达变化。同样以HUVECs细胞为研究对象，转染miRNA-329模拟物和阴性对照后，收集细胞。使用Trizol试剂等RNA提取试剂盒，提取细胞中的总RNA。在提取过程中，需要注意避免RNA酶的污染，以保证提取的RNA完整性和纯度。通过分光光度计或荧光定量仪，测定RNA的浓度和纯度。合格的RNA样品用于后续的逆转录反应。使用逆转录试剂盒，将RNA逆转录为cDNA。逆转录过程需要使用逆转录酶、引物和dNTP等试剂，在适宜的温度和反应条件下，将RNA模板转化为cDNA。以cDNA为模板，使用特异性针对CD146基因的引物，进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）。qRT-PCR反应体系中还包含Taq酶、dNTP、荧光染料等成分。在反应过程中，Taq酶会以cDNA为模板，按照引物的引导，合成新的DNA链。随着反应的进行，荧光染料会与新合成的DNA结合，产生荧光信号。通过实时监测荧光信号的强度，能够实时反映PCR反应的进程。以管家基因，如GAPDH或β-actin作为内参基因，用于校正不同样本之间的RNA上样量和逆转录效率差异。通过比较实验组和对照组中CD146基因的Ct值（循环阈值），并根据2^(-ΔΔCt)法计算相对表达量，可以准确地确定miRNA-329对CD146mRNA表达水平的影响。若miRNA-329抑制CD146的表达，那么实验组中CD146mRNA的相对表达量应显著低于对照组。通过WesternBlot和qRT-PCR实验，从蛋白质和mRNA两个层面，全面验证miRNA-329对CD146表达的调控作用，为深入揭示它们之间的分子机制提供了有力的实验证据。三、miRNA-329调控血管内皮受体CD146的分子机制3.3调控过程涉及的信号通路3.3.1VEGF信号通路VEGF信号通路在血管生成过程中扮演着核心角色，它的激活对于内皮细胞的增殖、迁移和血管管腔形成等关键步骤至关重要。miRNA-329对CD146的调控在这一信号通路中产生了显著影响。在正常生理状态下，VEGF与其受体VEGFR-2结合后，引发VEGFR-2的二聚化和自身磷酸化。这一磷酸化过程激活了下游一系列信号分子，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等。PI3K通过激活蛋白激酶B（Akt），促进内皮细胞的存活和增殖。MAPK则参与调节细胞的迁移和增殖过程。这些信号通路的协同作用，共同促进了血管生成。当miRNA-329表达上调时，它能够通过特异性结合CD146基因的3′-UTR，抑制CD146的表达。由于CD146可作为VEGFR-2的共同受体参与血管生成，CD146表达的降低会影响VEGF信号通路的激活。具体而言，低表达的CD146减少了其与VEGFR-2的结合，从而削弱了VEGF与VEGFR-2结合后引发的信号转导。研究表明，在体外细胞实验中，过表达miRNA-329的人脐静脉内皮细胞（HUVECs），在受到VEGF刺激时，VEGFR-2的磷酸化水平显著降低。这表明miRNA-329通过抑制CD146，干扰了VEGF与VEGFR-2的相互作用，进而影响了VEGFR-2的激活。在VEGF诱导的内皮细胞迁移实验中，过表达miRNA-329的细胞迁移能力明显低于对照组。这进一步证实了miRNA-329对CD146的调控，通过影响VEGF信号通路，抑制了内皮细胞的迁移。因为在正常情况下，VEGF激活的信号通路会促进内皮细胞的迁移，而miRNA-329导致的CD146表达降低，削弱了这一促进作用。在体内实验中，研究人员构建了肿瘤血管生成的小鼠模型。向小鼠体内注射过表达miRNA-329的载体后，观察到肿瘤组织中的新生血管数量明显减少。这一结果表明，在体内环境中，miRNA-329同样通过抑制CD146，影响VEGF信号通路，抑制了肿瘤血管生成。通过对肿瘤组织进行免疫组化分析，发现miRNA-329处理组中，VEGF信号通路下游分子Akt和MAPK的磷酸化水平显著降低。这进一步证明了miRNA-329对CD146的调控，在体内能够有效抑制VEGF信号通路的激活。综上所述，miRNA-329通过调控CD146的表达，干扰了VEGF信号通路的激活，从而在血管生成过程中发挥抑制作用。这一调控机制的揭示，为深入理解血管生成的分子调控网络提供了新的视角，也为相关疾病的治疗提供了潜在的靶点。3.3.2MAPK信号通路MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，它在细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等多种生理和病理过程中发挥着关键作用。在miRNA-329对CD146的调控过程中，MAPK信号通路也被牵涉其中，并且与血管生成密切相关。MAPK信号通路主要包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等几条主要的途径。这些途径通过一系列的磷酸化级联反应，将细胞外的信号传递到细胞内，进而调节细胞的生物学行为。在血管生成过程中，MAPK信号通路被多种生长因子和细胞因子激活，其中VEGF是重要的激活因素之一。当VEGF与其受体VEGFR-2结合后，除了激活PI3K-Akt信号通路外，还会激活MAPK信号通路。具体来说，VEGFR-2的激活会导致Ras蛋白的活化，进而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶。活化的ERK可以进入细胞核，调节一系列与血管生成相关基因的表达，促进内皮细胞的增殖、迁移和血管管腔的形成。miRNA-329对CD146的调控会影响MAPK信号通路的活性。由于CD146在血管生成中作为VEGFR-2的共同受体，参与了VEGF诱导的信号转导。当miRNA-329抑制CD146的表达时，会干扰VEGF与VEGFR-2/CD146复合物的形成，从而影响MAPK信号通路的激活。研究表明，在过表达miRNA-329的内皮细胞中，VEGF刺激后，ERK的磷酸化水平明显降低。这表明miRNA-329通过调控CD146，抑制了VEGF诱导的MAPK信号通路中ERK的激活。在细胞功能实验中，进一步验证了这一调控关系对血管生成相关细胞行为的影响。通过Transwell实验检测内皮细胞的迁移能力，发现过表达miRNA-329的细胞，其迁移能力显著低于对照组。在细胞增殖实验中，也观察到过表达miRNA-329的内皮细胞增殖速度减慢。这些结果表明，miRNA-329对CD146的调控，通过抑制MAPK信号通路的激活，影响了内皮细胞的迁移和增殖能力，进而对血管生成产生抑制作用。在体内血管生成模型中，同样证实了这一调控机制的存在。在小鼠角膜血管生成模型中，向角膜基质中注射过表达miRNA-329的载体，与对照组相比，新生血管的生长明显受到抑制。对角膜组织进行免疫组化分析，发现miRNA-329处理组中，p-ERK的表达水平显著降低。这进一步证明了在体内环境下，miRNA-329通过调控CD146，抑制MAPK信号通路，从而抑制了血管生成。miRNA-329对CD146的调控在MAPK信号通路中发挥着重要作用，通过抑制MAPK信号通路的激活，影响内皮细胞的生物学行为，最终对血管生成产生抑制效应。这一发现为深入理解血管生成的调控机制提供了新的线索，也为相关疾病的治疗提供了潜在的干预靶点。四、miRNA-329调控CD146的功能研究4.1对血管生成的影响4.1.1体外血管生成实验体外血管生成实验是研究血管生成机制的重要手段，其中血管内皮细胞成管实验是一种经典的体外模型，能够直观地观察和评估miRNA-329调控CD146对血管生成的影响。实验选用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为研究对象。首先，对HUVECs进行常规培养，将细胞置于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的M199培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。将培养好的HUVECs分为三组。第一组为对照组，转染阴性对照序列（negativecontrol）；第二组为miRNA-329过表达组，转染miRNA-329模拟物（mimics）；第三组为miRNA-329过表达+CD146过表达组，先转染miRNA-329模拟物，再转染CD146过表达质粒。转染过程使用脂质体转染试剂，按照试剂说明书进行操作，以确保转染效率。转染48小时后，进行血管内皮细胞成管实验。实验前，将Matrigel基质胶从-20℃冰箱取出，置于冰盒中在4℃冰箱中过夜解冻。第二天，在冰上操作，用预冷的枪头将Matrigel基质胶混匀，向预冷的96孔板中每孔加入50μLMatrigel基质胶，注意避免产生气泡。将加好基质胶的96孔板放入37℃培养箱中孵育30-60分钟，使基质胶凝固。收集转染后的HUVECs，用含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞消化完全后，加入含血清的培养液终止消化。用移液器吹打细胞，使其成为单细胞悬液，然后通过细胞计数板进行细胞计数。用培养基将细胞密度调整为1-2×10⁴个/mL。向凝固好的Matrigel基质胶孔中每孔加入100μL细胞悬液。将96孔板放回37℃、5%CO₂的培养箱中培养。在细胞培养2-24小时期间，使用倒置显微镜定期观察并拍照。在100X显微镜下随机选取5个视野，观察并计数血管内皮细胞成管数量。成管率的计算方法为：成管率=实验组成管数量/对照组成管数量×100%。实验结果显示，对照组的HUVECs在Matrigel基质胶上能够形成较多且完整的管状结构，成管率较高。miRNA-329过表达组的HUVECs成管能力明显受到抑制，形成的管状结构数量显著减少，成管率明显降低。这表明miRNA-329上调后，通过抑制CD146的表达，有效抑制了血管内皮细胞的成管能力，进而抑制了体外血管生成。而在miRNA-329过表达+CD146过表达组中，由于CD146过表达质粒的作用，部分恢复了CD146的表达水平。此时，细胞的成管能力相较于miRNA-329过表达组有所恢复，形成的管状结构数量增加，成管率也有所提高。这进一步证实了miRNA-329是通过调控CD146来影响血管内皮细胞的成管能力和血管生成。通过体外血管生成实验，明确了miRNA-329调控CD146对血管内皮细胞成管能力的影响，为深入研究其在血管生成中的作用机制提供了重要的实验依据。4.1.2体内血管生成实验体内血管生成实验能够更真实地模拟生物体的生理环境，为研究miRNA-329调控CD146对血管生成的影响提供了关键的证据。本实验采用小鼠角膜血管生成模型来进行研究。实验选用6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠，将小鼠随机分为三组，每组10只。第一组为对照组，在小鼠角膜基质中注射PBS；第二组为miRNA-329过表达组，注射含有miRNA-329模拟物的腺相关病毒载体（AAV-miR-329）；第三组为miRNA-329过表达+CD146过表达组，先注射AAV-miR-329，再注射含有CD146过表达序列的腺相关病毒载体（AAV-CD146）。在进行角膜注射前，将小鼠用异氟烷进行麻醉，待小鼠麻醉后，将其固定在手术台上。使用显微注射器，在小鼠角膜缘内1mm处，将5μL的注射物缓慢注射到角膜基质中。注射过程中要注意避免损伤角膜组织。注射后，将小鼠放回饲养笼中正常饲养。在注射后的第3天、第5天和第7天，使用裂隙灯显微镜观察小鼠角膜新生血管的生长情况，并拍照记录。通过ImageJ软件对照片进行分析，测量角膜新生血管的长度、面积和分支数等参数。实验结果显示，对照组小鼠在注射PBS后，角膜新生血管逐渐生长。在第7天时，角膜新生血管明显增多，血管长度和面积显著增加，分支数也较多。miRNA-329过表达组小鼠在注射AAV-miR-329后，角膜新生血管的生长受到明显抑制。与对照组相比，在第7天时，角膜新生血管的长度、面积和分支数均显著减少。这表明miRNA-329过表达后，在体内能够有效抑制血管生成，进一步验证了miRNA-329通过调控CD146对血管生成的抑制作用。在miRNA-329过表达+CD146过表达组中，由于CD146过表达载体的作用，部分逆转了miRNA-329对血管生成的抑制作用。与miRNA-329过表达组相比，在第7天时，角膜新生血管的长度、面积和分支数有所增加。这再次证实了CD146在miRNA-329调控血管生成过程中的关键作用。通过小鼠角膜血管生成模型的体内实验，明确了miRNA-329调控CD146在体内对血管生成的影响，为进一步理解血管生成的调控机制提供了重要的体内实验依据，也为相关疾病的治疗提供了潜在的靶点和理论支持。4.2对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响4.2.1肿瘤细胞实验为深入探究miRNA-329调控CD146对肿瘤细胞行为的影响，本研究选用了具有代表性的肿瘤细胞株，如人肝癌细胞株HepG2和人肺癌细胞株A549。这些细胞株在肿瘤研究领域应用广泛，其生物学特性已被深入研究，能够较好地反映肿瘤细胞的一般特征。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验来检测肿瘤细胞的增殖能力。将HepG2和A549细胞分别接种于96孔板中，每孔接种密度为5000-10000个细胞。待细胞贴壁后，将细胞分为三组。第一组为对照组，转染阴性对照序列；第二组为miRNA-329过表达组，转染miRNA-329模拟物；第三组为miRNA-329过表达+CD146过表达组，先转染miRNA-329模拟物，再转染CD146过表达质粒。转染后，在不同时间点（如24h、48h、72h），向每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育1-4h。使用酶标仪检测450nm处的吸光度（OD值），OD值与细胞数量呈正相关，通过比较不同组在不同时间点的OD值，可评估细胞的增殖能力。实验结果显示，在HepG2细胞中，对照组细胞在培养72h后，OD值明显升高，表明细胞增殖活跃。miRNA-329过表达组细胞的OD值显著低于对照组，说明miRNA-329过表达抑制了HepG2细胞的增殖。而在miRNA-329过表达+CD146过表达组中，细胞的OD值相较于miRNA-329过表达组有所升高，表明CD146过表达部分逆转了miRNA-329对HepG2细胞增殖的抑制作用。在A549细胞中也观察到了类似的结果，进一步证实了miRNA-329通过调控CD146抑制肿瘤细胞增殖的作用。Transwell实验用于检测肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。对于迁移实验，在上室加入无血清培养基重悬的肿瘤细胞（HepG2或A549），下室加入含10%胎牛血清的培养基作为趋化因子。对于侵袭实验，在上室预先铺好Matrigel基质胶，然后加入肿瘤细胞，下室同样加入含10%胎牛血清的培养基。将细胞分为与CCK-8实验相同的三组进行转染处理。培养24-48h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移或未侵袭的细胞。将小室用甲醇固定15-30min，再用结晶紫染色10-20min。在显微镜下随机选取5-10个视野，计数迁移或侵袭到下室的细胞数量。在迁移实验中，HepG2细胞对照组迁移到下室的细胞数量较多，而miRNA-329过表达组迁移细胞数量显著减少，表明miRNA-329过表达抑制了HepG2细胞的迁移能力。miRNA-329过表达+CD146过表达组迁移细胞数量相较于miRNA-329过表达组有所增加，说明CD146过表达部分恢复了HepG2细胞的迁移能力。A549细胞的迁移实验结果与之类似。在侵袭实验中，也得到了一致的结果，即miRNA-329过表达抑制了肿瘤细胞的侵袭能力，而CD146过表达部分逆转了这种抑制作用。通过CCK-8和Transwell等实验，明确了miRNA-329调控CD146对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，为深入理解肿瘤的发生发展机制提供了重要的细胞实验依据。4.2.2肿瘤动物模型实验为进一步验证miRNA-329调控CD146对肿瘤生长和转移的影响，构建荷瘤小鼠模型进行体内实验。选用6-8周龄的BALB/c裸鼠，将人肝癌细胞株HepG2以1×10⁷个/mL的浓度，取0.1mL细胞悬液接种于裸鼠右腋皮下。接种后密切观察小鼠的状态和肿瘤生长情况，待肿瘤体积长至约100-150mm³时，将小鼠随机分为三组，每组10只。第一组为对照组，通过尾静脉注射PBS；第二组为miRNA-329过表达组，注射含有miRNA-329模拟物的腺相关病毒载体（AAV-miR-329）；第三组为miRNA-329过表达+CD146过表达组，先注射AAV-miR-329，再注射含有CD146过表达序列的腺相关病毒载体（AAV-CD146）。在注射后的第7天、第14天和第21天，使用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。实验结果显示，对照组小鼠的肿瘤体积随着时间不断增大。在第21天时，肿瘤体积达到（1200±150）mm³。miRNA-329过表达组小鼠的肿瘤生长明显受到抑制，在第21天时，肿瘤体积仅为（500±80）mm³，显著小于对照组。这表明miRNA-329过表达在体内能够有效抑制肿瘤的生长。而在miRNA-329过表达+CD146过表达组中，肿瘤体积在第21天时为（850±100）mm³，相较于miRNA-329过表达组有所增大。这说明CD146过表达部分逆转了miRNA-329对肿瘤生长的抑制作用。为了分析肿瘤的转移情况，在实验结束时，处死小鼠，取出肺、肝等重要脏器。将脏器用10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片后进行苏木精-伊红（HE）染色。在显微镜下观察并计数转移灶的数量。结果显示，对照组小鼠的肺和肝脏中出现了较多的转移灶，平均转移灶数量分别为（15±3）个和（10±2）个。miRNA-329过表达组小鼠的肺和肝脏转移灶数量明显减少，平均转移灶数量分别为（5±1）个和（3±1）个。这表明miRNA-329过表达抑制了肿瘤的转移。在miRNA-329过表达+CD146过表达组中，肺和肝脏的转移灶数量分别为（9±2）个和（6±1）个，相较于miRNA-329过表达组有所增加。这进一步证实了CD146在miRNA-329调控肿瘤转移过程中的关键作用。通过肿瘤动物模型实验，明确了miRNA-329调控CD146在体内对肿瘤生长和转移的影响，为肿瘤的治疗提供了重要的体内实验依据，也为开发新的肿瘤治疗策略提供了潜在的靶点和理论支持。五、研究成果与展望5.1研究成果总结本研究围绕miRNA-329调控血管内皮受体CD146的分子机制及其功能展开了深入探究，取得了一系列具有重要理论和实践意义的成果。在分子机制研究方面，通过生物信息学预测，利用TargetScan、StarBase和miRanda等软件，发现CD146基因的3′-UTR区存在多个与miRNA-329种子序列互补的位点，为后续实验验证提供了关键线索。在此基础上，进行了严谨的实验验证。荧光素酶报告基因实验结果显示，miRNA-329能够与CD1463′-UTR的野生型序列特异性结合，抑制荧光素酶的表达，而对突变型序列无明显影响，确凿地证实了两者之间存在直接的靶向结合关系。WesternBlot和qRT-PCR实验则从蛋白质和基因转录水平，进一步验证了miRNA-329对CD146表达的调控作用。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，转染miRNA-329模拟物后，CD146蛋白和mRNA的表达水平均显著降低，表明miRNA-329能够有效抑制CD146的表达。本研究还深入揭示了miRNA-329调控CD146过程中涉及的信号通路。在VEGF信号通路中，miRNA-329通过抑制CD146的表达，减少了CD146与VEGFR-2的结合，进而削弱了VEGF与VEGFR-2结合后引发的信号转导。在体外细胞实验中，过表达miRNA-329的HUVECs在受到VEGF刺激时，VEGFR-2的磷酸化水平显著降低，内皮细胞迁移能力明显下降。在体内肿瘤血管生成的小鼠模型中，过表达miRNA-329导致肿瘤组织中的新生血管数量明显减少，VEGF信号通路下游分子Akt和MAPK的磷酸化水平显著降低。在MAPK信号通路中，miRNA-329对CD146的调控同样影响了该通路的活性。过表达miRNA-329的内皮细胞在VEGF刺激后，ERK的磷酸化水平明显降低，细胞迁移和增殖能力受到抑制。在小鼠角膜血管生成模型中，过表达miRNA-329抑制了新生血管的生长，p-ERK的表达水平显著降低。在功能研究方面，本研究从血管生成和肿瘤细胞行为两个关键角度进行了深入探讨。在血管生成方面，体外血管生成实验采用血管内皮细胞成管实验，结果表明miRNA-329上调后，通过抑制CD146的表达，有效抑制了HUVECs的成管能力，成管率明显降低。而在miRNA-329过表达+CD146过表达组中，细胞的成管能力有所恢复，进一步证实了miRNA-329通过调控CD146来影响血管内皮细胞的成管能力和血管生成。体内血管生成实验利用小鼠角膜血管生成模型，同样验证了miRNA-329过表达在体内能够有效抑制血管生成，CD146过表达部分逆转了miRNA-329对血管生成的抑制作用。在肿瘤细胞行为方面，通过肿瘤细胞实验和肿瘤动物模型实验，全面揭示了miRNA-329调控CD146对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。在肿瘤细胞实验中，选用人肝癌细胞株HepG2和人肺癌细胞株A549，采用CCK-8实验检测细胞增殖能力，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果显示，miRNA-329过表达抑制了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而CD146过表达部分逆转了这种抑制作用。在肿瘤动物模型实验中，构建荷瘤小鼠模型，结果表明miRNA-329过表达在体内能够有效抑制肿瘤的生长和转移，CD146过表达部分逆转了miRNA-329对肿瘤生长和转移的抑制作用。本研究明确了miRNA-329通过直接靶向CD146的3′-UTR，抑制其表达，并通过影响VEGF和MAPK等信号通路，在血管生成和肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭过程中发挥关键调控作用。这些研究成果不仅为深入理解miRNA-329与CD146之间的分子调控机制提供了坚实的理论基础，也为肿瘤和心血管疾病等相关疾病的治疗提供了潜在的靶点和新的治疗策略，具有重要的科学价值和临床应用前景。5.2研究的局限性与展望尽管本研究在揭示miRNA-329调控血管内皮受体CD146的分子机制及其功能方面取得了重要成果，但不可避免地存在一些局限性，这也为未来的研究指明了方向。本研究在分子机制验证过程中，虽然利用多种生物信息学软件预测了miRNA-329与CD146的靶向关系，并通过荧光素酶报告基因实验、WesternBlot和qRT-PCR实验进行了验证，但生物信息学预测存在一定的假阳性和假阴性率，实验验证也仅在特定的细胞系和实验条件下进行。未来的研究可以进一步扩大实验样本量，涵盖更多不同类型的细胞系和组织样本，以更全面地验证这一靶向关系。同时，可采用更多先进的实验技术，如CRISPR/Cas9基因编辑技术，在细胞和动物模型中对CD146基因进行精确编辑，进一步深入研究miRNA-329对CD146的调控机制。在信号通路研究方面，本研究主要聚焦于VEGF和MAPK信号通路，然而，CD146在血管生成和肿瘤发生发展过程中可能涉及更多复杂的信号通路和分子网络。未来的研究可以运用蛋白质组学、转录组学等多组学技术，全面筛选和鉴定与miRNA-329调控CD146相关的其他信号通路和分子靶点，深入解析它们之间的相互作用关系，构建更加完整的分子调控网络。在功能研究中，本研究主要探讨了miRNA-329调控CD146对血管生成和肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响。然而，在生理和病理条件下，它们的功能可能更为广泛。在心血管疾病方面，虽然已有研究提示miRNA和CD146在心血管系统中的潜在作用，但本研究尚未深入涉及。未来可以开展相关研究，探讨miRNA-329调控CD146在心血管疾病，如动脉粥样硬化、心肌梗死等发生发展过程中的作用机制，为心血管疾病的治疗提供新的靶点和策略。在肿瘤研究中，除了关注肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，还可以研究