（正式版）DB15∕T 2832-2022 《旱獭源性成分检测 实时荧光PCR法》

15Real-timePCRmethodforde2022-12-08发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件主要起草人：王伊琴、陈少博、杨帆、郝静云、包勇敢、荆文魁、张志峰、常鸿、赵治国。I旱獭源性成分检测实时荧光PCR法本文件规定了动物源性产品中旱獭源性成分实时荧光PCR检本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛制品、饲料等）中旱獭源性成分的鉴定，灵敏度为GB/T6682分析实验室用水规格和GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromiDNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicaEDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticaFAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescePCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreactioTAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamTris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethan125.1水：符合GB/T6682的要求。a)上游：5′-CCCTATTAATCTTAACAGCA-3′;b)下游：5′-GGGATTAGAGTAGCTTCA-3′;c)探针序列：5′-(FAM)-TATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCA-(TAMRA)-3′。5.8蛋白酶K溶液(20mg/mL)。5.13阳性对照样品：采用已知含有旱獭源性成分样品的DNA,或经测序确认的阳性质粒。见附录B。5.14阴性对照样品：采用已知不含有旱獭源性成分样品的DNA。6.2高速台式离心机(最高转速12000rpm)。6.3旋涡振荡器(最高转速3000rpm)。6.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6天平(感量0.01g)。6.7单孔道微量移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA,也可采用等效商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值A26o/Azo在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、阳性及空白提取对照。反应体系体积为25.0μL,见表1。———a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于40.0；b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于40.0；c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果Ct值大于等于40.0，可判定被检样品为阴性。8.3.1结果为阳性者，表述为“检出旱獭检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定3A.1溶液配制及提取方法将5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL后，定容至250mL，115℃高压A.2CTAB-沉淀液称0.2gCTAB,0.234gN称取28gNaCl，定容至400mL，115℃高压15A.4.1称取样品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB提取液中，再加入12L～20L蛋白酶K样品膨胀，则可再多加CTAB,每次多1mL，最多A.4.24000rpm/min～5000r/min离心10A.4.4取上清600L～650L加入无菌EP管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1A.4.6加入350L氯仿，涡旋30min，12000rpm离in，12000rpm离心10min，去上清，沉淀用500L75%的乙醇洗涤，再12000rpm离心10A.4.9将沉淀溶于100L灭菌水或TEbuffer或DEPC水中。4CCCTATTAATCTTAACAGCATGACTTCTACCCCTTATAATTATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCAAGAGCCATCG