生物学基因遗传实验题库

生物学基因遗传实验题库一、基础实验技术：基因遗传研究的底层工具基础实验技术是基因遗传研究的“敲门砖”，涵盖DNA/RNA提取、扩增、分离等核心操作，是后续进阶实验的基础。（一）PCR扩增技术：基因片段的“分子复印机”实验目的掌握聚合酶链式反应（PCR）的原理与操作，实现特定DNA片段的体外扩增。实验原理PCR通过变性-退火-延伸的循环反应，利用热稳定DNA聚合酶（如Taq酶）复制目标DNA片段。具体步骤：1.变性（94-95℃）：双链DNA解链为单链；2.退火（50-65℃）：引物与单链模板互补结合；3.延伸（72℃）：Taq酶以dNTP为原料，沿引物5’→3’方向合成新链。循环25-35次后，目标片段呈指数级扩增（2ⁿ倍）。步骤要点1.引物设计：长度18-25bp，GC含量40%-60%，避免发卡结构（ΔG<-3kcal/mol）和引物二聚体（ΔG<-6kcal/mol）；退火温度（Tm）计算公式：`Tm=4*(G+C)+2*(A+T)`，实际退火温度比Tm低5℃左右。2.反应体系（25μL）：模板DNA（1-100ng）、正反向引物（各0.5μM）、dNTP（0.2mM）、Taq酶（1U）、10×PCR缓冲液（2.5μL）、ddH₂O补至25μL。3.循环参数：预变性（95℃，5min）→循环（变性30s→退火30s→延伸1min/kb）→终延伸（72℃，10min）。常见问题及解决无扩增产物：检查引物设计（是否与模板匹配）、模板质量（是否降解）、酶活性（是否失活）；解决：重新设计引物、更换模板、使用新鲜酶。非特异性条带：降低退火温度（或采用梯度PCR优化）、减少引物浓度（≤0.5μM）、减少循环次数（≤35次）。条带模糊：增加延伸时间（1min/kb）、提高模板纯度（去除蛋白/RNA污染）。思考题为什么PCR需要热稳定DNA聚合酶？（提示：普通酶在变性温度下失活）引物二聚体对PCR结果有什么影响？（提示：消耗引物和dNTP，降低目标片段产量）（二）琼脂糖凝胶电泳技术：DNA片段的“分子尺子”实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳的原理与操作，分离、鉴定DNA片段的大小。实验原理DNA分子带负电，在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶的多孔结构对DNA片段具有分子筛效应：小片段DNA迁移快，大片段迁移慢。通过与已知大小的DNAMarker对比，可确定目标片段的大小。步骤要点1.凝胶配制：称取琼脂糖（1%-2%，片段越大浓度越低），加入1×TAE缓冲液（Tris-乙酸-EDTA），加热溶解；冷却至50℃左右，加入荧光染料（如EB，终浓度0.5μg/mL，或替代物如SYBRSafe），倒入模具插梳子。2.上样：样品与loadingbuffer（含溴酚蓝、甘油）按1:5混合，缓慢加入样品孔（避免溢出）。3.电泳：正负极接对（DNA向正极移动），电压1-5V/cm（电压过高会导致条带模糊），电泳时间30-60min（至溴酚蓝迁移至凝胶1/2-2/3处）。4.观察：紫外灯下观察条带（EB激发橙红色荧光），拍照记录。常见问题及解决条带拖尾：DNA样品降解（避免反复冻融）、凝胶浓度过高（降低琼脂糖浓度）、上样量过大（减少至100ng以下）。无条带：染料未加入（重新配制凝胶）、电泳方向反了（调换正负极）、样品未加入孔中（检查上样操作）。条带扭曲：凝胶未凝固完全（延长凝固时间）、电压过高（降低电压）。思考题为什么loadingbuffer中要加甘油？（提示：增加样品密度，使样品沉入孔底）1%琼脂糖凝胶适合分离多大的DNA片段？（提示：100bp-10kb）（三）基因组DNA提取技术：基因研究的“原料库”实验目的掌握植物/动物/微生物基因组DNA的提取方法，获得高质量的基因组DNA。实验原理通过裂解细胞（如CTAB法用于植物，SDS法用于动物）、去除杂质（蛋白、RNA、多糖）、沉淀DNA（乙醇或异丙醇）三个步骤，分离基因组DNA。步骤要点（以植物CTAB法为例）1.样品处理：取新鲜叶片（0.1g），液氮研磨成粉末；2.细胞裂解：加入65℃预热的CTAB提取液（含CTAB、NaCl、EDTA、Tris-HCl），混匀后65℃水浴30min（期间颠倒混匀）；3.去除蛋白：加入等体积氯仿-异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀，离心（____rpm，10min），取上清；4.沉淀DNA：加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min，离心（____rpm，10min），收集沉淀；5.洗涤与溶解：用75%乙醇洗涤沉淀2次，晾干后加入TE缓冲液（含RNaseA，10μg/mL），37℃水浴30min去除RNA，-20℃保存。常见问题及解决DNA产量低：样品量太少（增加至0.2g）、裂解不充分（延长水浴时间）、沉淀不彻底（增加乙醇体积或延长放置时间）。DNA纯度低（OD₂₆₀/OD₂₈₀<1.8）：蛋白去除不彻底（增加氯仿-异戊醇抽提次数）、RNA未除尽（增加RNaseA用量）。DNA降解：操作过程中剧烈震荡（轻柔混匀）、未使用EDTA（抑制DNA酶活性）。思考题CTAB在植物DNA提取中的作用是什么？（提示：破坏细胞膜，结合多糖）为什么要用75%乙醇洗涤DNA沉淀？（提示：去除残留的盐离子，保持DNA结构）二、进阶实验技术：基因操作的核心手段进阶实验技术聚焦于基因的克隆、修饰与表达，是研究基因功能的关键步骤。（一）基因克隆技术：目标基因的“分子捕获”实验目的掌握基因克隆的原理与操作，将目标基因插入载体，构建重组质粒。实验原理基因克隆是通过限制性内切酶切割（获得粘性末端或平末端）、DNA连接酶连接（将目标基因与载体连接）、转化（将重组质粒导入感受态细胞）三个步骤，实现目标基因的体外重组。步骤要点1.载体选择：常用质粒载体（如pUC19、pET-28a），需具备：多克隆位点（MCS）（用于插入目标基因）、抗性基因（如氨苄青霉素抗性，用于筛选阳性克隆）、报告基因（如lacZ，用于蓝白斑筛选）。2.酶切反应：选择两种不同的限制性内切酶（如EcoRⅠ和BamHⅠ），分别切割目标基因（从PCR产物或基因组DNA中获得）和载体；酶切体系（20μL）：DNA（1μg）、酶（各1U）、10×酶切缓冲液（2μL）、ddH₂O补至20μL，37℃水浴1h。3.连接反应：用DNA连接酶（如T4DNA连接酶）连接酶切后的目标基因和载体；连接体系（10μL）：目标基因（3μL）、载体（1μL）、10×连接缓冲液（1μL）、T4连接酶（1U）、ddH₂O补至10μL，16℃水浴过夜。4.转化：将连接产物导入感受态细胞（如E.coliDH5α）；热激法：冰浴30min→42℃热激90s→冰浴2min→加入LB培养基，37℃振荡培养1h→涂布于含抗性的LB平板（如氨苄青霉素，100μg/mL），37℃倒置培养过夜。5.筛选：通过蓝白斑筛选（lacZ基因插入失活，阳性克隆为白色，阴性为蓝色）或PCR鉴定（挑取单菌落，提取质粒，用目标基因引物进行PCR扩增）获得阳性克隆。常见问题及解决转化效率低：感受态细胞质量差（使用新鲜制备的感受态细胞）、连接产物浓度低（增加目标基因与载体的比例，如3:1）、热激时间不当（严格控制90s）。假阳性克隆：载体自连（使用碱性磷酸酶处理载体，去除5’磷酸基团，防止自连）、引物设计错误（重新设计引物）。无阳性克隆：酶切不彻底（增加酶量或延长酶切时间）、连接失败（检查连接酶活性或缓冲液）。思考题为什么要用两种不同的限制性内切酶进行双酶切？（提示：防止载体自连和目标基因反向插入）蓝白斑筛选的原理是什么？（提示：lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，分解X-gal产生蓝色；插入目标基因后，lacZ基因失活，无法分解X-gal，呈白色）（二）定点突变技术：基因序列的“精准编辑”实验目的掌握定点突变的原理与操作，实现目标基因特定碱基的替换、插入或缺失。实验原理定点突变是通过PCR扩增（使用含突变位点的引物），将突变引入目标基因；常用方法为重叠延伸PCR（OverlapExtensionPCR），分为两步：1.第一轮PCR：用两对引物（其中一对含突变位点）分别扩增目标基因的两段片段，获得含突变位点的重叠片段；2.第二轮PCR：用外侧引物扩增重叠片段，获得完整的突变基因。步骤要点（以替换某碱基为例）1.引物设计：突变引物（F1、R1）：长度25-30bp，突变位点位于引物中间（避免末端突变），GC含量40%-60%；外侧引物（F2、R2）：位于目标基因的两端，与模板结合。2.第一轮PCR：用F1和R2扩增片段A（含突变位点的5’端），用F2和R1扩增片段B（含突变位点的3’端）；PCR体系与常规PCR相同。3.重叠延伸：将片段A和片段B混合（各1μL），作为模板，用外侧引物F2和R2进行PCR扩增，获得完整的突变基因。4.克隆与验证：将突变基因插入载体，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，通过测序验证突变位点是否正确。常见问题及解决突变效率低：突变引物设计不当（突变位点位于引物中间，避免末端）、PCR循环次数太少（增加至35次）、模板量过高（减少至1ng）。非特异性扩增：降低退火温度（或采用梯度PCR）、减少引物浓度（≤0.5μM）。测序结果无突变：引物合成错误（重新合成引物）、PCR过程中突变位点被修复（使用高保真DNA聚合酶，如Pfu酶）。思考题为什么定点突变需要使用高保真DNA聚合酶？（提示：高保真酶错配率低，避免引入随机突变）重叠延伸PCR中，重叠片段的长度对结果有什么影响？（提示：重叠长度太短（<15bp）会导致连接效率低，太长（>30bp）会增加引物设计难度）（三）实时荧光定量PCR（qPCR）技术：基因表达的“量化工具”实验目的掌握qPCR的原理与操作，定量分析目标基因的mRNA表达水平。实验原理qPCR通过荧光染料（如SYBRGreenⅠ）或荧光探针（如TaqMan探针）实时监测PCR扩增过程中荧光信号的变化，从而定量目标基因的初始模板量。Ct值（循环阈值，即荧光信号达到阈值时的循环次数）与初始模板量呈负相关（`Ct=-lg(初始模板量)+K`，K为常数）。步骤要点1.RNA提取与反转录：用Trizol法提取总RNA（注意避免RNA酶污染），用反转录酶（如M-MLV）将RNA反转录为cDNA；反转录体系（20μL）：RNA（1μg）、Oligo(dT)引物（1μL）、dNTP（0.5mM）、M-MLV酶（10U）、10×反转录缓冲液（2μL）、ddH₂O补至20μL，42℃水浴1h，70℃灭活10min。2.qPCR反应：使用SYBRGreenⅠ染料法；反应体系（20μL）：cDNA（1μL）、正反向引物（各0.4μM）、SYBRGreenⅠ混合液（10μL）、ddH₂O补至20μL；循环参数：预变性（95℃，3min）→循环（变性10s→退火30s→延伸30s）×40次→熔解曲线分析（95℃→60℃→95℃）。3.结果分析：用2⁻ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量（ΔΔCt=(Ct目标基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目标基因-Ct内参基因)对照组）；内参基因选择稳定表达的基因（如β-actin、GAPDH）。常见问题及解决Ct值过高（>35）：RNA质量差（重新提取RNA）、反转录效率低（增加反转录酶用量）、引物效率低（重新设计引物，效率应在90%-110%）。熔解曲线出现多个峰：非特异性扩增（优化退火温度、设计特异性引物）、引物二聚体（降低引物浓度）。重复性差：模板浓度不均（稀释模板时充分混匀）、操作误差（使用移液器校准）。思考题SYBRGreenⅠ染料法与TaqMan探针法的区别是什么？（提示：SYBRGreenⅠ结合所有双链DNA，非特异性高；TaqMan探针结合特定序列，特异性高）内参基因的作用是什么？（提示：校正RNA提取量、反转录效率、PCR扩增效率的差异）三、综合设计实验：基因功能的“实证研究”综合设计实验将基础与进阶技术结合，聚焦于基因功能的验证，是基因遗传研究的核心。（一）CRISPR-Cas9基因敲除实验：基因功能的“缺失验证”实验目的掌握CRISPR-Cas9系统的原理与操作，构建基因敲除细胞/植株，验证基因功能。实验原理CRISPR-Cas9系统通过sgRNA（单引导RNA）识别目标基因的特定序列（需紧邻PAM序列，即NGG，N为任意碱基），引导Cas9核酸酶切割DNA双链，造成双链断裂（DSB）；细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复DSB，导致插入/缺失突变（Indel），从而破坏基因的阅读框，实现基因敲除。步骤要点（以动物细胞为例）1.sgRNA设计：使用在线工具（如CRISPRDesign、ZhangLab）设计sgRNA，选择目标基因的外显子区域（避免内含子），确保sgRNA的特异性（无脱靶效应）；sgRNA序列长度为20bp，3’端紧邻PAM序列。2.载体构建：将sgRNA插入CRISPR-Cas9载体（如pSpCas9-2A-GFP）；载体包含：Cas9基因（编码Cas9酶）、sgRNA表达框（U6启动子驱动）、报告基因（GFP，用于筛选阳性细胞）。3.转染细胞：用脂质体转染法（如Lipofectamine3000）将重组载体导入目标细胞（如HEK293细胞）；转染体系：细胞（1×10⁵个/孔）、载体（1μg）、脂质体（2μL），37℃培养24h。4.筛选阳性细胞：通过荧光显微镜观察GFP表达，收集阳性细胞（用流式细胞术分选）。5.验证敲除效率：分子验证：提取阳性细胞的基因组DNA，用PCR扩增目标基因片段，测序分析Indel突变（如使用T7E1酶切法检测突变率）；表达验证：提取总RNA，用qPCR检测目标基因的mRNA水平（敲除后mRNA水平降低）；提取总蛋白，用Westernblot检测目标蛋白水平（敲除后蛋白水平降低）。6.表型分析：观察敲除细胞的表型变化（如增殖能力、凋亡率、形态变化），与野生型细胞对比，验证基因功能。常见问题及解决敲除效率低：sgRNA设计不当（重新设计sgRNA，选择评分高的序列）、转染效率低（优化脂质体用量或使用病毒转染）、Cas9酶活性低（使用新鲜制备的载体）。脱靶效应：选择特异性高的sgRNA（避免与其他基因序列同源）、使用双sgRNA系统（减少脱靶）。表型不明显：基因功能冗余（敲除多个同源基因）、表型检测方法不当（选择更敏感的检测指标）。思考题PAM序列在CRISPR-Cas9系统中的作用是什么？（提示：Cas9酶识别PAM序列，启动DNA切割）如何设计实验验证CRISPR-Cas9的脱靶效应？（提示：通过全基因组测序分析潜在的脱靶位点）（二）基因过表达实验：基因功能的“增益验证”实验目的掌握基因过表达的原理与操作，构建过表达细胞/植株，验证基因功能。实验原理基因过表达是通过将目标基因插入过表达载体（含强启动子，如CMV启动子、35S启动子），导入细胞/植株后，使目标基因的mRNA和蛋白水平显著高于野生型，从而观察过表达后的表型变化（如促进生长、增强抗逆性）。步骤要点（以植物为例）1.载体选择：常用过表达载体（如pCAMBIA1300），包含：强启动子（35S启动子，驱动目标基因表达）、抗性基因（如潮霉素抗性，用于筛选转基因植株）、报告基因（如GUS，用于检测基因表达部位）。2.基因克隆：用PCR扩增目标基因的CDS序列（编码区），插入过表达载体的多克隆位点（如XbaⅠ和SacⅠ）；克隆方法与基因克隆技术相同。3.转化植株：用农杆菌介导法转化植物（如拟南芥）；步骤：农杆菌（含重组载体）培养至OD₆₀₀=0.5→浸泡植物花序（10min）→暗培养24h→正常培养至收获种子→筛选转基因种子（涂布于含潮霉素的MS平板）。4.验证过表达效率：分子验证：提取转基因植株的基因组DNA，用PCR扩增目标基因（验证是否插入）；提取总RNA，用qPCR检测目标基因的mRNA水平（过表达后mRNA水平升高）；表达验证：用GUS染色法检测报告基因的表达部位（如叶片、根）；用Westernblot检测目标蛋白水平（过表达后蛋白水平升高）。5.表型分析：观察转基因植株的表型变化（如株高、开花时间、抗逆性），与野生型对比，验证基因功能（如过表达抗逆基因后，植株的耐旱性增强）。常见问题及解决过表达效率低：启动子选择不当（更换强启动子，如35S启动子）、载体插入方向错误（用双酶切验证插入方向）、转基因植株沉默（选择低拷贝插入的植株）。表型异常：过表达导致基因功能获得性突变（如毒性蛋白积累）、环境因素影响（控制培养条件一致）。无表型：基因功能冗余（过表达多个基因）、表型检测时间不当（选择合适的发育阶段检测）。思考题为什么过表达载体需要强启动子？（提示：强启动子能驱动目标基因高效表达，使mRNA和蛋白水平显著升高）如何区分转基因植株的单拷贝与多拷贝插入？（提示：用Southernblot检测基因组DNA的杂交条带数，单拷贝为1条带，多拷贝为多条带）（三）基因互补实验：基因功能的“恢复验证”实验目的掌握基因互补实验的原理与操作，通过回补突变体的目标基因，验证突变体表型是否恢复，确认基因功能。实验原理基因互补实验是将野生型基因导入突变体（如敲除突变体或自然突变体），若突变体的表型恢复为野生型，则说明该基因是导致突变表型的原因。步骤要点（以拟南芥突变体为例）1.突变体选择：选择目标基因的突变体（如T-DNA插入突变体，通过PCR鉴定纯合突变体），突变体表现出特定表型（如矮化、晚花）。2.互补载体构建：将目标基因的全长序列（包括启动子、CDS、终止子）插入互补载体（如pCAMBIA1300）；启动子需包含基因的调控区域（如1-2kb的上游序列），确保基因在突变体中正常表达。3.转化突变体：用农杆菌介导法将互补载体导入突变体植株，筛选转基因互补植株（用潮霉素抗性筛选）。