（正式版）DB15∕T 3279-2023 《苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法》

152023-12-29发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC1I1判定。由锐顶镰刀菌(Fusariumacuminatum)引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近会出现烂霉变，并发生坏死，根茎出现中空，侧根出现大量腐烂坏死5.1.6凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE,LoadingBuffer,DL2000DNAMarker。5.2.1水琼脂培养基(WA:WaterAgar):琼脂粉15g,加蒸馏水定容至1000mL,122灭菌20min。5.2.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA:PotatoDextroseAgar):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂粉15g,加蒸馏水定容至1000mL,121℃高压灭菌20min。5.2.3马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB:PotatoDextroseBroth):马铃薯200g,葡萄糖20g,加蒸馏水定容至1000mL,121℃高压灭菌20min。5.2.4绿豆琼脂培养基(MBA:MungBeanAgar):绿豆粉60g,琼脂粉15g,加蒸馏水定容至1000约0.5cm×0.5cm的小组织块，用75%酒精和1%次氯酸钠分别处理3min和5min,无菌水清洗5次。把表收集菌丝，液氮下研磨，使用真菌基因组提取试剂盒提取病原菌DNACRTGGATCTTRTCRTCSACC-3'）以及镰刀菌PHO序列引物Fusphoo-f(5'-ATGCARGGYATYGTHGT-3')和Fusphoo-r(5'-ACRTTRGTRGCATCCTTRGWRGART-3')进行PC聚类分析结果表明，以ITS序列构建的系统发育树中，菌株与NCBI数据库中的三线镰刀菌(JX989827.1)、燕麦镰刀菌（KX058547.1）、锐顶镰刀菌（MT557673.1）聚为同一类，见附录A中的图A.5。以fRPB2序列构建的系统发育树见附录A中的图A.6。以PHO序列构建的系统发育树中，菌株与NCBI数据库中的锐顶镰刀菌(KJ200247.1)聚于同一类，见附录A中的图A.7。选取形态特征与F.acuminatum形态特征相符且PCR检测鉴定阳性的分离菌株，在绿豆培养基上培养接种发病的苜蓿根部再做病原菌分离、培养，观察是否与F.acuminatum的形态特征一致，并对分离菌相符，PCR扩增鉴定为F.acuminatum，且苜蓿致病性测试的分34(资料性)苜蓿根腐病锐顶镰刀菌的分离鉴定过程苜蓿根腐病锐顶镰刀菌的分离鉴定过程见图A.1~图A.7。取取样清洗分离涂板摇菌摇菌镜检再次分离Gen3arkGuaphicsDislance暖ofrsulsNnMSAMeweFueaniusLESkimiNauCuve提取测序比对图A.1苜蓿根腐病病原菌的分离纯化图A.2PDA培养基锐顶镰刀菌生长形态5注：A:小型分生孢子B:大型分生孢子C:菌丝。图A.3锐顶镰刀菌孢子与菌丝形态6FusariumacuminatFusariumoxysporumMKB2937FusariumsolaniMH582400.1图A.5系统发育树—ITS序列FusariumtreinchumK43Fusarunavena图A.6系统发育树—fPRB2