T-CBPIA 0012-2025 反相球形硅胶基质色谱填料的性能测定方法

ICS71.040CCSL90TDeterminationmethodofperformanceofreversed-phasesphericalsilicagel-basedchromatographicpackingmaterialIT/CBPIA0012—2025 Ⅲ 12规范性引用文件 13术语和定义 23.1粒度(μm)和粒度分布 23.2孔径(Å)、孔容(cm3/g)和比表面积(m2/g) 23.3柱效 23.4表面金属活性 23.5保留因子K 24试剂和材料 34.1实验用水 3 3 34.4三氟乙酸 34.5氢氧化钠 34.61,4-二羟基蒽醌 34.7尿嘧啶 34.8萘 34.9阿米替林 34.10针筒过滤器 35仪器和设备 3 35.2扫描电子显微镜 35.3激光粒度分布仪 45.4库尔特计数仪 45.5比表面积分析仪 4T/CBPIA0012—20255.6元素分析仪 45.7高效液相色谱仪 45.8色谱柱装柱机 46溶液及样品制备 46.1柱效测试样品储备液 46.2柱效测试液 46.3表面金属活性测试溶液 46.4阿米替林测试液 46.5碱冲洗液（适用于pH耐受上限为12.0的色谱填料） 46.6酸冲洗液 57性能测定方法 5 57.2粒度和粒度分布 57.3碳含量 57.4柱效 57.5表面金属活性 67.6碱性化合物峰对称性 77.7填料耐碱 87.8填料耐酸 98检测报告 附录A(资料性)检测报告模板 附录B(资料性)硅胶基质的检测项目及检测方法 12T/CBPIA0012—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由苏州艾捷博雅科技有限公司提出。本文件由中国生化制药工业协会归口。本文件起草单位：苏州艾捷博雅科技有限公司、江苏汉德科技有限公司、北京亦度正康健康科技有限公司。本文件主要起草人：马春青、王跃庆、汪群杰、张大兵、韩海峰、范大双、张明亮、陈震、山广志、杨化新、仲平、苏贤斌、陆益红、胡文言、周斌、范蕊萌、金燕京。1T/CBPIA0012—2025反相球形硅胶基质色谱填料的性能测定方法硅胶基质色谱填料根据固定相和流动相的极性不同，分为正相和反相色谱填料。正相色谱填料通常为硅胶及其极性官能团键合相，流动相为非极性或弱极性溶剂；反相色谱填料通常为硅胶基质表面键合非极性官能团，流动相为强极性溶剂。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)、AQC18等。其特征和用途见下表：填料名称官能团特征用途C18(ODS)十八烷基(-C18H37)疏水性强，适用于长链、疏水性强的化合物。高碳载量提供强保留，但可能导致疏水性强肽的洗脱困难。广泛用于药物分子、合成多肽、天然产物以及酸性、中性和碱性化合物等的反相分离。C8(MOS)八烷基(-C8H17)疏水性比C18稍弱，保留能力也比C18弱，适合分离中等极性的化合物。中性和碱性化合物等的反相分离。C4(Butyl)丁基(-C4H9)疏水性更弱，适合分离极性相对较大的化合物。在分析分子量较小、极性较强的代谢物时有较好的表现。C6H5(Phenyl)苯基(-C6H5)具有π-π电子相互作用等特性，对芳香族化合物的分离效果较好。适用于分离芳香族化合物，如多环芳烃、苯及其同系物等具有共轭结构的化合物。AQC18增加了亲水基团具有一定的亲水性，适用于分离含有极性基团的化合物。在分析糖类等极性较大的生物分子时有较好的表现。Phenyl-hexyl苯基己基结合了苯基的π-π电子相互作用和己基的疏水性特点。在分离具有复杂结构的有机化合物时具有优势，如含有苯环和疏水性侧链的药物分子或天然产物。PFP(五氟苯基)五氟苯基(-C6F5)偶极相互作用和π-π电子相互作用等。极性较复杂，具有较强的偶极在分离含卤素、硝基等强极性官能团的化合物方面表现出色。硅胶基质色谱填料根据原料和生产工艺的不同又分为球形和无定型两种。本文件规定了关于反相球形硅胶基质色谱填料的外观、粒度、孔结构及碱性物质保留、耐碱测试等测定方法的内容。反相球形硅胶基质色谱填料广泛用于色谱分析柱、色谱制备柱的装填，在生命科学、药物化学、天然药化、化学合成等领域具有广泛应用。本文件的目的是规范基于反相机理的球形硅胶基质色谱填料的性能测定。2规范性引用文件下列标准包含的条文，通过在本标准中引用而形成为本标准的条文，在标准发布时，所示版本均为有效。所有标准都有可能更新，使用本标准的各方应探讨，使用下列标准最新版本的可能性。2T/CBPIA0012—2025ISO13319-2007粒度分布的测定-电感区法GB/T191包装储运图示标志GB/T32286-2015十八烷基键合相（C18）高效液相色谱柱性能测定方法GB/T19587-2017气体吸附BET法测定固态物质比表面积GB/T29022-2021粒度分析动态光散射法GB/T19077-2024粒度分析激光衍射法JY/T0580-2020元素分析仪分析方法通则JY/T0584-2020扫描电子显微镜分析方法通则2025年版《中国药典》四部通则0512高效液相色谱法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1粒度(μm)和粒度分布粒度是指填料颗粒的大小，粒度分布是指填料颗粒大小的分布情况。3.2孔径(A)、孔容(cm3/g)和比表面积(m2/g)孔径是指填料颗粒内部孔隙的大小；孔容是单位质量多孔固体所具有的细孔总容积；比表面积是指单位质量填料所具有的表面积。3.3柱效指色谱柱在不扩散化合物的情况下保留化合物的能力。柱效是色谱柱获得窄带、改进分离的相对能力，用理论板数（N）来衡量。3.4表面金属活性是指色谱填料表面金属离子与样品分子之间的相互作用能力，这种相互作用会影响色谱分离的效果。通过检测特定的色谱参数，可以评估表面金属活性。3.5保留因子K固定相中的溶质分子总量（s）除以流动相中的溶质分子总量（m）得到。当化合物在固定相中溶质分子越多，K值越大，保留时间越长。等度洗脱中，运用公式K=（tR-t0）/t0进行计算，其中t0约等于5x10-4Ldc2/F。式中L是色谱柱的长度，以mm为单位；dc是色谱柱的内径，也以mm为单位；F是流动相流速，以ml/min为单位；t0以分钟为单位。3T/CBPIA0012—2025本标准中测量填料柱效时采用尿嘧啶的保留时间作为t0。尿嘧啶是一种常用的不被吸附的小分子物质，在确认相应色谱条件下不被色谱柱吸附，可以使用其保留时间来代替t0。4试剂和材料4.1实验用水GB/T6682规定的一级水。4.2甲醇CH3OH，CAS号：67-56-1，色谱纯。4.3乙腈CH3CN，CAS号：75-05-8，色谱纯。4.4三氟乙酸C2HF3O2，CAS号：76-09-3，分析纯。4.5氢氧化钠NaOH，CAS号：1310-73-2，分析纯。4.61,4-二羟基蒽醌C14H8O4，CAS号：81-64-1，纯度≥99.0%。4.7尿嘧啶C4H4N2O2，CAS号：66-22-8，纯度≥99.0%。4.8萘C10H8，CAS号：91-20-3，纯度≥99.0%。4.9阿米替林C20H23N，CAS号：50-48-6，纯度≥99.0%。4.10针筒过滤器过滤器直径：13mm，滤膜材质：PTFE，滤膜孔径：0.22μm。5仪器和设备5.1显微镜光学显微镜，可放大到1000倍。5.2扫描电子显微镜4T/CBPIA0012—2025扫描电子显微镜，可放大到30万倍。5.3激光粒度分布仪最大量程不小于50μm。5.4库尔特计数仪可以对0.2-1600μm的颗粒进行测量；适合高浓度样品，一次分析高达500,000个微粒。5.5比表面积分析仪可测量比表面积量值不小于0.0005(m2/g）。5.6元素分析仪能开展C、H、N元素的检测。5.7高效液相色谱仪配二极管阵列检测器或紫外检测器。5.8色谱柱装柱机耐压范围0-80MPa，最大流速0.5L/min，材料：主体304，部分316钢。6溶液及样品制备6.1柱效测试样品储备液分别称取尿嘧啶和萘100mg（精确至0.1mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。6.2柱效测试液精密量取柱效测试样品储备液1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。6.3表面金属活性测试溶液称取1,4-二羟基蒽醌9mg（精确至0.1mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。6.4阿米替林测试液称取阿米替林100mg（精确至0.1mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。6.5碱冲洗液（适用于pH耐受上限为12.0的色谱填料）甲醇：三乙胺溶液（用三乙胺调节纯水的pH到色谱填料标示的pH使用上限值）=40:60。5T/CBPIA0012—20256.6酸冲洗液甲醇：0.50%TFA（用三氟乙酸调节纯水的pH至色谱填料标示的pH使用下限）=70:30。7性能测定方法7.1性状目视，白色粉末；1000倍显微镜下为球形颗粒且表面无裂缝。7.2粒度和粒度分布1.光学分析法，微米级填料按GB/T19077激光衍射法的要求执行；纳米级或亚微米级填料按GB/T29022动态光散射法的要求执行。以D50和D90/D10的结果分别代表粒度大小和粒度分布情况，判定是否满足要求。或2.库尔特计数法，按照ISO13319国际标准的要求执行。以D50和D90/D10的结果分别代表粒度大小和粒度分布情况，判定是否满足要求。7.3碳含量使用元素分析仪，具体按JY/T0580-2020元素分析仪分析方法通则对填料表面的C、H、N含量进行测定。7.4柱效7.4.1色谱柱准备精密称取待测填料3g(±0.1g）将填料装入I.D.：4.6mm×250mm色谱柱管中，用四氢呋喃:吡咯烷酮=70:30作为匀浆液，甲醇作为顶替液，压力350bar，将填料装入色谱柱管中。7.4.2测试条件流动相：乙腈-水（根据不同柱子的特点调整混合比例，使得保留因子K=1.5-2.5）流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：25-30℃;样品：柱效测试液（6.2项进样量：2μl。6T/CBPIA0012—20257.4.3试验步骤和结果计算柱效测试包含理论板数和拖尾因子，结果计算参照2025年版《中国药典》四部通则0512高效液相色谱法。7.4.4结果判定根据萘的理论板数N和拖尾因子T判定填料柱效是否合格。7.4.5示例说明以8um，120Å的C18填料为例，装填成一支4.6x250mm的色谱柱进行柱效测试，得到的色谱图如通过液相色谱软件计算，得到N=12781，T=1.02，通常8um填料要求理论板数≥40000/米，拖尾因子T=0.95-1.05。即对于一支250mm的柱子来说，N要求≥10000，T=0.95-1.05。则，判定填料柱效合格。常用的反相色谱填料理论板数及拖尾因子参考要求见下表：填料粒度理论板数n拖尾因子T≥30000/米分析柱（柱内径≤10mm），T=0.95-1.05半制备柱（10mm＜柱内径＜50mm），T=0.95-1.20制备柱（柱内径≥50mm），T=0.90-1.508μm≥40000/米5μm≥80000/米3μm≥120000/米7.5表面金属活性7.5.1测试条件7T/CBPIA0012—2025流动相：80%甲醇：20mmol/L中性磷酸钾缓冲液=80:20波长：UV254nm；流速：0.8ml/min；样品：表面金属活性测试溶液（6.3项进样量：1μl；柱温：25-30℃。7.5.2试验步骤和结果计算选取7.5柱效测试合格的色谱柱，按上述测试条件进行测试，记录1,4-二羟基蒽醌的拖尾因子。7.5.3结果分析通过1,4-二羟基蒽醌的拖尾因子，可以评估色谱填料表面的金属活性。拖尾因子T≥1.05，表明存在拖尾现象，通常与表面金属杂质有关。对拖尾因子的要求根据客户需求确定。7.6碱性化合物峰对称性7.6.1测试条件流动相：根据填料不同的化学特性进行配制。化学特性为无封尾，单官能团试剂键合的色谱填料，流动相为甲醇：20mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH=5.8（称量2.2822g磷酸氢二钾，加水溶解，用磷酸调pH=5.8，并定容至刻度）=80:20；其它化学特性的色谱填料，流动相为甲醇：20mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH=7.0（称量2.2822g磷酸氢二钾，加水溶解，用磷酸调pH=7，并定容至刻度）=80:20。流速：1.0ml/min；样品：阿米替林测试液（6.4项检测波长：254nm；柱温：30℃;进样体积：2μl。7.6.2试验步骤和结果计算选取7.5柱效测试合格的色谱柱，按上述测试条件进行测试，对阿米替林进行积分，记录其保留时间，按2025年版《中国药典》四部通则0512计算拖尾因子T：7.6.3结果分析如果拖尾因子T≥2.0，表明存在较多的残余硅羟基。对拖尾因子的要求根据客户需求确定。8T/CBPIA0012—20257.7填料耐碱7.7.1碱性条件老化过程将柱效测试合格的色谱柱安装到液相色谱仪上，用6.5项下的碱冲洗液作为碱老化流动相，以流速1ml/min连续冲洗色谱柱。每隔24小时，对柱效进行测试，具体按7.5项下的要求执行，测完柱效后将色谱继续老化，并考察萘的保留时间（R碱洗）、理论板数（N碱洗）、拖尾因子（T碱洗）在填料冲洗前后的变化。7.7.2结果计算每隔24小时，对萘的保留时间、理论板数、拖尾因子碱洗前后的变化进行计算，得到保留时间变化率R碱变，理论板数变化率（N碱变拖尾因子变化率（T碱变如下：保留时间变化率（R碱变）R碱变—萘的保留时间变化率，%R—碱洗前萘的保留时间，minR碱洗—碱洗后萘的保留时间，min理论板数变化率（N碱变）N碱变N碱变—萘的理论板数变化率，%N—碱洗前萘的理论板数，minN碱洗—碱洗后萘的理论板数，min拖尾因子变化率（T碱变）T碱变—萘的理论板数变化率，%T—碱洗前萘的拖尾因子，minT碱洗—碱洗后萘的拖尾因子，min7.7.3结果分析每个碱洗周期结束后，如果保留时间变化率（R碱变）、理论板数变化率（N碱变）和拖尾因子变化率（T碱变）任意一项超过10%，则终止耐碱实验。材料的耐碱总时间数据提供给客户参考。9T/CBPIA0012—20257.8填料耐酸7.8.1酸性条件老化过程及测试将柱效测试合格的色谱柱安装到液相色谱仪上，用6.6项下的酸冲洗液作为老化流动相，以流速1ml/min连续冲洗色谱柱。每隔24小时，对柱效进行测试，具体7.5项下的要求执行，测完柱效后将色谱继续老化，并考察萘的保留时间（R酸洗）、理论板数（N酸洗）、拖尾因子（T酸洗）三个结果在填料冲洗前后的变化。7.8.2结果计算每隔24小时，对萘的保留时间、理论板数、拖尾因子酸洗前后的变化进行计算，得到保留时间变化率R酸变，理论板数变化率（N酸变拖尾因子变化率（T酸变如下：保留时间变化率（R酸变）R酸变—萘的保留时间变化率，%R—酸洗前萘的保留时间，minR酸洗—酸洗后萘的保留时间，min理论板数变化率（N酸变）N酸变N酸变—萘的理论板数变化率，%N—酸洗前萘的理论板数，minN酸洗—酸洗后萘的理论板数，min拖尾因子变化率（T酸变）T酸变—萘的理论板数变化率，%T—酸洗前萘的拖尾因子，minT酸洗—酸洗后萘的拖尾因子，min7.8.3结果分析T/CBPIA0012—2025每个酸洗周期结束后，如果保留时间变化