冷应激下雏鹅神经内分泌响应及基因表达调控机制探究

冷应激下雏鹅神经内分泌响应及基因表达调控机制探究一、引言1.1研究背景与目的鹅作为水禽的重要代表，在我国的养殖产业中占据着重要地位。随着养殖规模的不断扩大，集约化养殖模式逐渐成为主流。然而，在这种养殖模式下，雏鹅面临着诸多环境挑战，其中冷应激是影响其生长发育和健康的关键因素之一。雏鹅由于体温调节机制不完善，对低温环境极为敏感。当环境温度低于其适宜温度范围时，雏鹅会产生冷应激反应，这不仅会影响其正常的生理机能，还可能导致生长发育受阻、免疫力下降，甚至死亡，给养殖户带来严重的经济损失。冷应激对雏鹅的影响是多方面的。在生理机能方面，冷应激会干扰雏鹅的神经内分泌系统，影响激素的分泌和调节，进而影响机体的代谢和生理功能。研究表明，冷应激会导致雏鹅甲状腺激素分泌减少，从而降低机体的基础代谢率，影响生长发育。在生长性能方面，冷应激会使雏鹅的采食量下降，饲料利用率降低，生长速度减缓。有研究发现，冷应激条件下的雏鹅体重增长明显低于正常温度下饲养的雏鹅。在免疫力方面，冷应激会抑制雏鹅的免疫功能，使其更容易受到病原体的侵袭，增加患病的风险。例如，冷应激会导致雏鹅免疫器官发育受阻，免疫细胞活性降低，从而降低机体的免疫力。下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴和下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴在雏鹅应对冷应激的过程中发挥着关键作用。HPA轴通过分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质醇等激素，调节机体的应激反应和代谢功能。当雏鹅受到冷应激时，下丘脑分泌CRH增加，CRH刺激垂体分泌ACTH，ACTH进而刺激肾上腺皮质分泌皮质醇，皮质醇可以促进糖异生，提高血糖水平，为机体提供更多的能量以应对冷应激。HPT轴则通过分泌促甲状腺激素释放激素（TRH）、促甲状腺激素（TSH）和甲状腺激素等，调节机体的生长发育和能量代谢。冷应激会刺激下丘脑分泌TRH，TRH促使垂体分泌TSH，TSH刺激甲状腺分泌甲状腺激素，甲状腺激素可以提高机体的基础代谢率，增加产热，以维持体温稳定。深入研究冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性及相关基因表达调控的影响，具有重要的理论和实践意义。在理论方面，有助于揭示雏鹅应对冷应激的分子机制，丰富动物应激生理学的理论知识。通过研究冷应激下HPA和HPT轴相关基因的表达变化，可以深入了解基因调控在应激反应中的作用，为进一步研究动物的应激适应机制提供理论基础。在实践方面，能够为养鹅业提供科学的饲养管理依据，制定合理的抗冷应激措施，提高雏鹅的成活率和生长性能，促进养鹅业的健康发展。例如，根据研究结果，可以通过调整饲养环境温度、优化饲料营养等措施，减少冷应激对雏鹅的影响，提高养殖效益。1.2国内外研究现状1.2.1冷应激对动物神经内分泌系统影响的研究冷应激作为一种常见的环境应激源，对动物神经内分泌系统的影响备受关注。国外学者早在20世纪就开始了相关研究，如加拿大学者HansSelye在1936年首次提出应激学说，为后续研究奠定了理论基础。随着研究的深入，发现冷应激会激活动物的交感神经-肾上腺髓质（SAM）系统，使肾上腺素和去甲肾上腺素的分泌增加，从而导致心率加快、血压升高等生理反应。在对小鼠的研究中发现，急性冷应激可使小鼠血浆中肾上腺素和去甲肾上腺素水平显著升高，以应对寒冷环境带来的挑战。下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴在冷应激反应中也起着关键作用。当动物受到冷应激时，下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），CRH刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素（ACTH），ACTH进而促使肾上腺皮质分泌皮质醇。皮质醇作为一种重要的应激激素，能够调节机体的代谢和免疫功能，以适应冷应激环境。研究表明，长期冷应激会导致大鼠血浆中皮质醇水平持续升高，同时HPA轴相关基因的表达也发生变化，如CRH基因表达上调，提示HPA轴的活性增强。下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴同样参与了动物对冷应激的响应。冷应激会刺激下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素（TRH），TRH促使垂体分泌促甲状腺激素（TSH），TSH刺激甲状腺分泌甲状腺激素，甲状腺激素可以提高机体的基础代谢率，增加产热，维持体温稳定。在鸡的冷应激研究中发现，低温环境下鸡血浆中甲状腺激素水平升高，且HPT轴相关基因的表达也发生改变，表明HPT轴被激活以应对冷应激。国内学者在冷应激对动物神经内分泌系统影响的研究方面也取得了一定成果。在对家禽的研究中发现，冷应激会导致家禽神经内分泌系统的紊乱，影响生长性能和免疫功能。在对蛋鸡的研究中，发现冷应激会使蛋鸡血清中甲状腺激素水平下降，导致产蛋率降低。此外，国内研究还关注了冷应激对动物神经内分泌系统影响的分子机制，如通过研究相关基因的表达变化，揭示冷应激下神经内分泌系统的调控机制。1.2.2冷应激对动物相关基因表达调控的研究随着分子生物学技术的不断发展，冷应激对动物相关基因表达调控的研究成为热点。国外研究发现，冷应激会诱导动物体内一系列基因的表达变化，这些基因涉及多个生物学过程，如能量代谢、抗氧化应激、免疫调节等。在对鱼类的研究中发现，冷应激会使鱼类体内热休克蛋白（HSP）基因的表达上调，HSP可以帮助蛋白质正确折叠，维持细胞的正常功能，从而提高鱼类对冷应激的耐受性。此外，研究还发现冷应激会影响动物体内一些转录因子的活性，进而调控相关基因的表达。在对小鼠的研究中，发现冷应激会激活NF-κB转录因子，NF-κB可以结合到相关基因的启动子区域，调节基因的转录，参与免疫调节和炎症反应等过程。国内研究在冷应激相关基因表达调控方面也有重要进展。通过基因芯片技术和实时荧光定量PCR等方法，研究人员筛选出了多种与冷应激相关的基因，并深入探讨了它们的表达调控机制。在对牦牛的研究中，发现HSPs、CIRP和RBM3等基因在冷应激过程中发挥重要作用，这些基因的表达变化与牦牛的抗寒能力密切相关。此外，国内研究还关注了冷应激对动物基因表达调控的表观遗传机制，如DNA甲基化、组蛋白修饰等，这些表观遗传修饰可以在不改变DNA序列的情况下，影响基因的表达，为冷应激的研究提供了新的视角。1.2.3研究现状的不足与展望尽管国内外在冷应激对动物神经内分泌系统影响及其相关基因表达调控方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之处。目前的研究多集中在单一应激因素对动物的影响，而实际养殖环境中动物往往受到多种应激因素的共同作用，因此需要进一步研究复合应激对动物神经内分泌系统和基因表达的影响。此外，虽然已经鉴定出许多与冷应激相关的基因，但这些基因之间的相互作用以及它们在冷应激信号通路中的具体位置和功能还不完全清楚，需要深入研究以构建完整的冷应激基因调控网络。在研究对象上，对水禽尤其是雏鹅的研究相对较少，雏鹅由于其特殊的生理特点，对冷应激更为敏感，因此加强对雏鹅冷应激的研究具有重要的现实意义。未来的研究可以从以下几个方面展开：一是采用多组学技术，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学等，全面深入地研究冷应激对动物神经内分泌系统和基因表达的影响，揭示冷应激的分子机制；二是加强对冷应激信号通路的研究，明确各信号通路之间的相互作用和调控关系，为开发有效的抗冷应激措施提供理论依据；三是关注冷应激对雏鹅等水禽的影响，通过研究冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性及相关基因表达调控的影响，为水禽养殖提供科学的饲养管理指导，提高养殖效益。1.3研究意义1.3.1理论意义深入探究冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性及相关基因表达调控的影响，能够在理论层面极大地丰富动物应激生理学知识体系。当前，关于动物应激反应的研究虽然取得了一定进展，但对于水禽尤其是雏鹅这一特殊群体在冷应激条件下的神经内分泌调节机制，仍存在诸多未知领域。雏鹅由于其独特的生理特征，如体温调节机制不完善、羽毛发育不健全等，对冷应激的响应可能与其他动物存在显著差异。通过本研究，能够深入揭示雏鹅在冷应激状态下HPA和HPT轴的激活模式、激素分泌规律以及相关基因的表达变化规律，填补该领域在雏鹅研究方面的空白。具体而言，研究冷应激下HPA轴相关基因如促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）基因的表达变化，有助于明确HPA轴在雏鹅应激反应中的分子调控机制，了解下丘脑如何感知冷应激信号并通过调节CRH基因表达来启动HPA轴的应激反应，以及垂体如何响应CRH信号调节ACTH基因表达和ACTH分泌。对于HPT轴，研究促甲状腺激素释放激素（TRH）、促甲状腺激素（TSH）基因的表达调控，能够深入理解HPT轴在雏鹅冷应激时的能量代谢调节机制，揭示TRH基因表达如何受冷应激影响，进而调控TSH基因表达和TSH分泌，以及TSH如何刺激甲状腺调节甲状腺激素的合成与分泌，从而维持机体的能量平衡和体温稳定。这些研究成果将为进一步构建完善的动物应激反应理论框架提供重要的实验依据和理论支撑，推动动物应激生理学的发展。1.3.2实践意义从实践角度来看，本研究对于养鹅业的健康发展具有至关重要的指导意义。在实际养殖过程中，冷应激是影响雏鹅成活率和生长性能的重要因素之一。了解冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性及相关基因表达的影响，能够为制定科学合理的饲养管理措施提供坚实的理论依据，有效降低冷应激对雏鹅的负面影响，提高养殖效益。基于研究结果，可以通过优化育雏环境来降低冷应激的发生。精确控制育雏室的温度，根据雏鹅的日龄和生长阶段，提供适宜的温度环境，避免温度过低或波动过大对雏鹅造成冷应激。加强育雏室的保温措施，如增加垫料厚度、密封门窗缝隙等，减少热量散失，保持室内温度稳定。合理调整饲养密度，避免雏鹅因拥挤而导致的散热不均和冷应激风险增加。通过这些措施，可以为雏鹅创造一个舒适的生长环境，减少冷应激对其生理机能的影响，提高雏鹅的成活率和健康水平。研究结果还能为饲料营养调控提供科学依据。在冷应激条件下，雏鹅的能量代谢和营养需求发生变化。通过研究HPA和HPT轴活性及相关基因表达与营养物质代谢的关系，可以针对性地调整饲料配方，提高饲料的能量水平，添加适量的油脂、糖类等能量物质，满足雏鹅在冷应激状态下对能量的额外需求；合理调整蛋白质、氨基酸的含量和比例，确保雏鹅获得充足的营养支持，维持正常的生长发育和生理功能；增加维生素、矿物质等营养成分的添加量，如维生素A、E、C和硒、锌等，提高雏鹅的抗氧化能力和免疫力，缓解冷应激对机体的损伤。通过科学的饲料营养调控，可以增强雏鹅的抗冷应激能力，促进其生长性能的提高，为养鹅业的高效发展提供有力保障。二、相关理论基础2.1冷应激概述2.1.1冷应激的概念冷应激作为一种常见的应激类型，属于应激原的范畴。当动物长时间暴露于低温环境中，其体内环境的稳定性和生理功能会发生显著变化。从生理学角度来看，冷应激是动物机体对低温环境刺激所产生的非特异性应答反应。在这种刺激下，动物的神经、内分泌、免疫等多个系统会被激活，试图维持机体的稳态。当动物感知到环境温度低于其适宜温度范围时，下丘脑会接收到冷觉感受器传来的信号，进而启动一系列生理调节机制。下丘脑会通过神经调节使皮肤血管收缩，减少体表散热；同时，通过神经-体液调节，促使甲状腺激素、肾上腺素等激素的分泌增加，以提高机体的代谢率，增加产热。冷应激对动物机体的影响是多方面的，它不仅会改变动物的生理生化指标，还会影响动物的行为、生长发育和繁殖性能。在生理生化方面，冷应激会导致动物血糖升高，这是由于机体为了应对寒冷，需要更多的能量，从而促使肝脏糖原分解和糖异生作用增强，使得血糖水平上升。血液中皮质醇含量也会升高，皮质醇作为一种重要的应激激素，能够调节机体的代谢和免疫功能，但长期高浓度的皮质醇会对动物的健康产生负面影响，如抑制免疫功能、影响生长发育等。在行为方面，动物会表现出扎堆、蜷缩等行为，以减少散热面积，保持体温。在生长发育方面，冷应激会使动物的生长速度减缓，饲料利用率降低，这是因为机体需要消耗更多的能量来维持体温，从而减少了用于生长和生产的能量分配。在繁殖性能方面，冷应激会影响动物的生殖激素分泌，导致发情周期紊乱、受孕率降低等问题。2.1.2冷应激的分类根据应激时间的长短，冷应激可分为急性冷应激和慢性冷应激两种类型。急性冷应激是指动物因寒冷环境持续时间在1天以内而产生的冷应激。这种冷应激通常是由于环境温度的突然急剧下降引起的，如在秋冬季节，气温骤降，动物来不及适应，就会产生急性冷应激。急性冷应激会使动物在短时间内出现强烈的生理反应，如体温下降、皮肤充血、寒颤等。这是因为动物的体温调节机制在短时间内无法迅速适应环境温度的变化，导致机体散热大于产热，体温下降；皮肤血管收缩以减少散热，但由于应激反应，皮肤会出现充血现象；寒颤则是机体通过肌肉收缩来增加产热的一种方式。慢性冷应激是指动物因寒冷环境持续时间超过1天而产生的冷应激。慢性冷应激往往是由于动物长期处于低温环境中，无法有效适应所致。在慢性冷应激条件下，动物的生理反应相对较为缓和，但持续时间较长，对动物的健康和生产性能会产生更为深远的影响。动物的生长性能会受到明显抑制，生长速度减缓，体重增长缓慢。这是因为慢性冷应激会导致动物体内的能量代谢发生改变，能量更多地用于维持体温，而用于生长的能量减少。动物的免疫力也会下降，容易感染各种疾病。这是因为慢性冷应激会抑制动物的免疫功能，使免疫细胞的活性降低，免疫球蛋白的分泌减少，从而降低机体的抵抗力。不同类型的冷应激对动物的影响存在差异。急性冷应激主要影响动物的即时生理反应，对动物的生命安全构成直接威胁，如不及时采取措施，可能导致动物死亡。而慢性冷应激则主要影响动物的长期生长发育和健康状况，虽然不会立即危及动物的生命，但会降低动物的生产性能和经济效益。在实际养殖过程中，需要根据冷应激的类型和特点，采取相应的防控措施，以减少冷应激对动物的危害。2.1.3冷应激对动物的危害冷应激对动物的危害是多方面的，严重影响动物的生长性能、采食量、生理免疫和肠道系统等。在生长性能方面，冷应激发生时，机体内的能量利用途径发生显著变化，由原来的生产消耗转变成维持机体温度。为了应对寒冷环境，动物需要消耗更多的能量来产热，这导致能量储备下降，进而严重影响生长发育，使生长速度减慢，生产性能降低，饲料利用效率变差。在对雏鸡的研究中发现，冷应激条件下的雏鸡体重增长明显低于正常温度饲养的雏鸡，饲料转化率也显著降低。这是因为冷应激促使机体将葡萄糖、脂肪酸及一些蛋白质等作为应激状态的供能物质，将摄取的食物直接合成急性蛋白质，以此调整机体状态。较强烈的冷应激甚至会导致动物生产性能停滞，生长完全受阻，甚至死亡。在采食量方面，冷应激状态下，机体的干物质消化率和代谢率发生变化，导致动物采食量增加。这主要是因为低温影响了体内酶的分泌水平，使饲料消化利用率和其他机体功能的效率降低。为了供应更多的能量用于热能消耗，动物不得不摄入更多的饲料并加速机体代谢率，从而影响脂肪代谢和体脂沉积。在对猪的研究中发现，冷应激时猪的采食量会显著增加，但由于饲料消化利用率降低，猪的生长速度并未相应提高，反而可能出现脂肪沉积减少的情况。这是因为机体在冷应激状态下，优先将能量用于维持体温，而减少了对脂肪合成的投入。在生理免疫方面，冷应激会对机体的体液和细胞免疫产生不同程度的负面影响。机体内能量被迫从免疫系统转移到维持体温调节，导致免疫系统的功能受到抑制，以保障补偿热量的产生，从而呈现免疫抑制状态。此时，动物感染疫病的几率大幅增加。冷应激还会促使机体通过HPA轴、HPT轴及SAM轴等途径调节免疫细胞和免疫活性分子的生理机能，以此参与机体的免疫反应。在对小鼠的研究中发现，冷应激会使小鼠的脾脏和胸腺等免疫器官重量减轻，免疫细胞活性降低，免疫球蛋白含量下降，从而降低机体的免疫力。这表明冷应激对动物的免疫功能具有明显的抑制作用，使动物更容易受到病原体的侵袭。在肠道系统方面，冷应激能引起食道蠕动增加，加快饲料通过消化道速度，使酶没有足够的时间消化和利用食物。这会导致肠道内的pH值和内容物发生变化，为致病细菌的大量繁殖提供了有利条件，进而引发坏死性肠炎、肠黏膜出血、绒毛萎缩等现象，严重降低肠道对营养物质的吸收利用。肠道损伤还会导致血浆蛋白释放到肠道内，引起腹泻、脱水、贫血、精神萎靡、羽毛皱褶和生长迟缓等临床症状。在对肉鸡的研究中发现，冷应激会导致肉鸡肠道黏膜屏障功能受损，肠道通透性增加，有害菌易位，从而引发一系列肠道疾病，影响肉鸡的生长和健康。这说明冷应激对动物肠道系统的危害较大，不仅会影响肠道的正常消化和吸收功能，还会引发其他健康问题。2.2HPA轴和HPT轴介绍2.2.1HPA轴的组成与功能下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴是一个复杂而精密的神经内分泌系统，在动物的应激反应中发挥着核心作用。它由下丘脑、垂体和肾上腺皮质三个部分组成，这三个部分之间通过激素的分泌和反馈调节，形成了一个高度协调的功能网络。下丘脑作为HPA轴的起始环节，在应激反应中扮演着关键角色。下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）是HPA轴激活的重要信号分子。当动物受到冷应激等应激刺激时，下丘脑的室旁核神经元会合成并释放CRH。CRH通过垂体门脉系统运输到垂体前叶，与垂体前叶细胞膜上的CRH受体结合，从而刺激垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）。CRH的分泌受到多种因素的调控，包括神经递质、细胞因子等。去甲肾上腺素、5-羟色胺等神经递质可以通过作用于下丘脑的相应受体，调节CRH的分泌。一些细胞因子如白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等也可以刺激下丘脑分泌CRH，参与应激反应的调节。垂体前叶在HPA轴中起到承上启下的作用。在CRH的刺激下，垂体前叶的促肾上腺皮质激素细胞合成并释放ACTH。ACTH是一种由39个氨基酸组成的多肽激素，它通过血液循环到达肾上腺皮质。ACTH与肾上腺皮质细胞膜上的ACTH受体结合，激活细胞内的信号转导通路，促进肾上腺皮质合成和释放皮质醇等糖皮质激素。垂体前叶对ACTH的分泌也受到多种因素的调节，除了CRH的刺激作用外，皮质醇的负反馈调节对ACTH的分泌起着重要的调控作用。当血液中皮质醇水平升高时，皮质醇会通过负反馈机制抑制垂体前叶对ACTH的分泌，从而维持HPA轴的稳态。一些神经递质和激素也可以影响垂体前叶对ACTH的分泌，如多巴胺、生长抑素等可以抑制ACTH的分泌，而血管加压素则可以协同CRH促进ACTH的分泌。肾上腺皮质是HPA轴的最终效应器官，主要分泌皮质醇等糖皮质激素。皮质醇在动物的应激反应和生理调节中具有广泛的作用。在应激状态下，皮质醇的分泌增加，它可以通过多种途径调节机体的代谢和生理功能，以适应应激环境。皮质醇可以促进糖异生作用，增加血糖水平，为机体提供更多的能量。它能促使肝脏将氨基酸和甘油等非糖物质转化为葡萄糖，同时抑制外周组织对葡萄糖的摄取和利用，从而使血糖升高。皮质醇还可以调节脂肪代谢，促进脂肪分解，使脂肪酸释放到血液中，为机体提供能量。它可以激活脂肪酶，促进脂肪细胞内的甘油三酯分解为脂肪酸和甘油，脂肪酸进入血液循环后，可被其他组织摄取利用。皮质醇对蛋白质代谢也有重要影响，它会抑制蛋白质合成，促进蛋白质分解，为糖异生提供原料。在肌肉组织中，皮质醇可以抑制蛋白质合成相关基因的表达，促进蛋白质水解酶的活性，使肌肉蛋白质分解增加。除了代谢调节作用外，皮质醇还具有免疫调节作用。适量的皮质醇可以增强机体的免疫功能，提高机体对病原体的抵抗力。在一定浓度范围内，皮质醇可以促进免疫细胞的增殖和分化，增强免疫细胞的活性，如促进T淋巴细胞的增殖和活化，增强巨噬细胞的吞噬能力。然而，长期或高水平的皮质醇分泌会抑制免疫功能，使机体更容易受到病原体的侵袭。过高浓度的皮质醇会抑制免疫细胞的功能，降低免疫球蛋白的合成，抑制炎症因子的释放，从而导致免疫功能下降。这是因为皮质醇可以与免疫细胞内的糖皮质激素受体结合，调节相关基因的表达，影响免疫细胞的功能。HPA轴通过下丘脑、垂体和肾上腺皮质之间的相互作用，实现对动物应激反应的精细调节。在冷应激等应激刺激下，HPA轴被激活，CRH、ACTH和皮质醇的分泌增加，这些激素通过调节机体的代谢、免疫等功能，帮助动物适应应激环境。HPA轴的功能紊乱会导致动物出现各种应激相关的疾病，如焦虑、抑郁、免疫功能低下等。因此，深入研究HPA轴的组成与功能，对于理解动物的应激反应机制和防治应激相关疾病具有重要意义。2.2.2HPT轴的组成与功能下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴是另一个重要的神经内分泌调节系统，在动物的生长发育、代谢调节和体温维持等方面发挥着关键作用。它由下丘脑、垂体和甲状腺三个部分组成，通过激素的分泌和反馈调节，维持机体的生理平衡。下丘脑在HPT轴中起着启动和调节的作用。下丘脑的室旁核和视上核等部位的神经元合成并分泌促甲状腺激素释放激素（TRH）。TRH是一种三肽激素，它通过垂体门脉系统运输到垂体前叶。当动物受到冷应激等刺激时，下丘脑会感知到环境温度的变化，并通过神经调节和体液调节机制，促使TRH的分泌增加。TRH的分泌受到多种因素的调控，其中环境温度是一个重要的调节因素。冷应激会刺激下丘脑的温度感受器，通过神经传导将信号传递到下丘脑的室旁核和视上核，促进TRH的合成和释放。一些神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺等也可以调节TRH的分泌。去甲肾上腺素可以通过作用于下丘脑的相应受体，促进TRH的释放；而多巴胺则可以抑制TRH的分泌。此外，甲状腺激素的负反馈调节对TRH的分泌也起着重要的调控作用。当血液中甲状腺激素水平升高时，甲状腺激素会通过负反馈机制抑制下丘脑对TRH的分泌，从而维持HPT轴的稳态。垂体前叶是HPT轴的中间环节，它在TRH的刺激下，合成并分泌促甲状腺激素（TSH）。TSH是一种糖蛋白激素，由α和β两个亚基组成。α亚基与其他糖蛋白激素如促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）等的α亚基相同，而β亚基则具有特异性，决定了TSH的生物学活性。TSH通过血液循环到达甲状腺，与甲状腺细胞膜上的TSH受体结合，激活细胞内的信号转导通路，促进甲状腺激素的合成和释放。垂体前叶对TSH的分泌也受到多种因素的调节，除了TRH的刺激作用外，甲状腺激素的负反馈调节对TSH的分泌起着重要的调控作用。当血液中甲状腺激素水平升高时，甲状腺激素会通过负反馈机制抑制垂体前叶对TSH的分泌，从而维持HPT轴的稳态。一些生长因子、细胞因子等也可以影响垂体前叶对TSH的分泌。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）可以促进TSH的分泌，而白细胞介素-6（IL-6）则可以抑制TSH的分泌。甲状腺是HPT轴的最终效应器官，主要合成和分泌甲状腺激素，包括甲状腺素（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）。甲状腺激素在动物的生长发育和代谢调节中具有广泛的作用。在生长发育方面，甲状腺激素对动物的神经系统、骨骼系统等的发育至关重要。在胚胎期和幼年期，甲状腺激素缺乏会导致动物生长发育迟缓，智力低下，如呆小症就是由于甲状腺激素缺乏引起的。这是因为甲状腺激素可以促进神经细胞的增殖、分化和迁移，影响神经递质的合成和释放，对神经系统的发育和功能起着重要的调节作用。甲状腺激素还可以促进骨骼的生长和发育，它可以刺激成骨细胞的活性，促进骨基质的合成和钙磷的沉积，从而促进骨骼的生长。在代谢调节方面，甲状腺激素可以提高机体的基础代谢率，增加产热。甲状腺激素可以作用于全身各个组织和器官，促进细胞内的氧化磷酸化过程，增加ATP的生成，从而提高机体的能量代谢水平。在冷应激条件下，甲状腺激素的分泌增加，使机体的产热增加，以维持体温稳定。甲状腺激素可以刺激脂肪细胞内的脂肪分解，使脂肪酸释放到血液中，为机体提供能量。它还可以促进肝脏的糖异生作用，增加血糖水平。甲状腺激素对蛋白质代谢也有重要影响，适量的甲状腺激素可以促进蛋白质合成，而过多的甲状腺激素则会促进蛋白质分解。在正常生理状态下，甲状腺激素可以促进蛋白质合成相关基因的表达，增加蛋白质的合成量；但在甲状腺功能亢进时，甲状腺激素分泌过多，会导致蛋白质分解加速，出现肌肉消瘦等症状。HPT轴通过下丘脑、垂体和甲状腺之间的相互作用，实现对动物生长发育、代谢和体温的精细调节。在冷应激等刺激下，HPT轴被激活，TRH、TSH和甲状腺激素的分泌增加，这些激素通过调节机体的代谢和生理功能，帮助动物适应环境变化。HPT轴的功能紊乱会导致动物出现各种代谢性疾病，如甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退等。因此，深入研究HPT轴的组成与功能，对于理解动物的生长发育和代谢调节机制，以及防治相关疾病具有重要意义。2.3基因表达调控相关理论2.3.1基因表达调控的概念基因表达调控是生物体内控制基因表达的关键机制，对于维持生物体的正常生理功能、生长发育以及应对环境变化起着决定性作用。基因表达是指基因经过转录和翻译，将遗传信息转化为具有生物学功能的蛋白质或功能性RNA的过程。而基因表达调控则是在这个过程中，通过各种调节机制对基因表达的时间、空间和表达水平进行精确控制，以确保生物体在不同的生理状态和环境条件下，能够合成适量的蛋白质或功能性RNA，满足生命活动的需要。从分子生物学角度来看，基因表达调控涉及多个层面的复杂过程。在DNA水平上，基因的结构和染色质的状态会影响基因的表达。基因的启动子、增强子、沉默子等顺式作用元件与转录因子等反式作用因子相互作用，决定了基因转录的起始和速率。启动子是RNA聚合酶识别和结合的区域，它控制着转录的起始位点和频率；增强子可以增强基因转录的活性，其作用不受距离和方向的限制；沉默子则相反，它能够抑制基因的转录。染色质的修饰如DNA甲基化、组蛋白修饰等也会改变染色质的结构和功能，从而影响基因的可及性和表达水平。DNA甲基化通常会抑制基因的表达，而组蛋白的乙酰化、甲基化等修饰则可以促进或抑制基因的转录，具体取决于修饰的位点和程度。在转录水平上，转录因子与顺式作用元件的相互作用是调控基因表达的关键环节。转录因子是一类能够结合到DNA特定序列上的蛋白质，它们通过与启动子、增强子等顺式作用元件结合，招募或抑制RNA聚合酶等转录相关蛋白，从而调节基因转录的起始、延伸和终止。不同的转录因子具有不同的DNA结合结构域和转录激活或抑制结构域，它们可以相互作用形成复杂的转录调控网络，对基因表达进行精细的调控。一些转录因子在胚胎发育过程中起着关键作用，它们通过调控一系列基因的表达，决定了细胞的分化方向和组织器官的形成。在转录后水平上，mRNA的加工、修饰、转运和降解等过程也会影响基因表达。mRNA前体需要经过剪接、加帽、加尾等加工过程，才能成为成熟的mRNA并被转运到细胞质中进行翻译。mRNA的稳定性也会影响其翻译效率和基因表达水平，不稳定的mRNA会被快速降解，从而减少蛋白质的合成。一些RNA结合蛋白可以与mRNA结合，调节mRNA的稳定性和翻译效率。微小RNA（miRNA）等非编码RNA也可以通过与mRNA互补配对，抑制mRNA的翻译或促进其降解，从而调控基因表达。在翻译水平上，翻译起始因子、核糖体与mRNA的结合效率，以及翻译过程中的延伸和终止等环节都受到调控。翻译起始因子可以调节核糖体与mRNA的结合，影响翻译起始的速率；一些信号通路可以通过磷酸化等修饰方式调节翻译起始因子的活性，从而调控蛋白质的合成。在翻译过程中，tRNA的种类和数量、氨基酸的供应等也会影响翻译的效率和准确性。翻译后水平上，蛋白质的修饰、折叠、定位和降解等过程进一步调控基因表达的最终效果。蛋白质的磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰可以改变蛋白质的活性、稳定性和功能；蛋白质的正确折叠对于其发挥生物学功能至关重要，错误折叠的蛋白质可能会被降解或聚集形成有害的聚集体；蛋白质的定位决定了其在细胞内的作用部位；而蛋白质的降解则是调节蛋白质水平和功能的重要机制，通过泛素-蛋白酶体系统等途径，细胞可以及时清除不需要或受损的蛋白质。基因表达调控在生物体的生长发育过程中起着至关重要的作用。在胚胎发育过程中，基因表达调控决定了细胞的分化方向和组织器官的形成。不同的细胞类型在发育过程中会表达特定的基因组合，从而形成各种组织和器官。在神经系统发育中，神经干细胞通过基因表达调控逐渐分化为神经元和神经胶质细胞，形成复杂的神经网络。基因表达调控还参与了生物体对环境变化的适应过程。当生物体受到冷应激、热应激、病原体感染等环境刺激时，基因表达调控机制会被激活，使生物体能够调整自身的生理状态，以适应环境的变化。在冷应激条件下，一些与抗寒相关的基因会被上调表达，这些基因编码的蛋白质可以帮助生物体增加产热、提高抗寒能力。基因表达调控是一个复杂而精细的过程，涉及多个层面的调控机制。它对于维持生物体的正常生理功能、生长发育和适应环境变化具有重要意义。深入研究基因表达调控机制，不仅有助于我们理解生命活动的本质，还为疾病的诊断、治疗和预防提供了理论基础和新的思路。2.3.2基因表达调控的机制基因表达调控是一个高度复杂且精细的过程，其机制涉及多个层面，主要包括转录水平调控、翻译水平调控以及表观遗传调控等，这些调控机制在冷应激反应中发挥着关键作用。转录水平调控是基因表达调控的重要环节，它决定了mRNA的合成量和时间。在转录起始阶段，转录因子与顺式作用元件的相互作用起着核心作用。转录因子是一类能够结合到DNA特定序列上的蛋白质，它们包含DNA结合域、转录激活域和其他功能域。转录因子通过其DNA结合域与顺式作用元件如启动子、增强子、沉默子等特异性结合。启动子是位于基因转录起始位点上游的一段DNA序列，它是RNA聚合酶识别和结合的区域，决定了转录的起始位点。增强子则是能够增强基因转录活性的DNA序列，其作用不受距离和方向的限制，可以位于基因的上游、下游或内部。沉默子则相反，它能够抑制基因的转录。不同类型的转录因子与顺式作用元件的组合，形成了复杂的转录调控网络，精确地控制着基因转录的起始和速率。在冷应激条件下，一些特定的转录因子会被激活，它们结合到相关基因的启动子或增强子区域，促进或抑制基因的转录。在植物中，冷诱导转录因子CBF（C-repeatbindingfactor）在冷应激反应中起着关键作用。当植物受到冷应激时，CBF基因被诱导表达，CBF蛋白结合到下游冷响应基因的启动子区域，激活这些基因的转录，从而使植物产生一系列抗寒反应。转录起始复合物的形成是转录启动的关键步骤。转录起始复合物由RNA聚合酶、转录因子和DNA模板等组成。在真核生物中，转录起始需要多种转录因子的参与，它们首先与启动子区域结合，形成一个预起始复合物，然后招募RNA聚合酶，最终形成完整的转录起始复合物。转录起始复合物的稳定性决定了转录的效率和持续性。一些转录因子可以通过与其他蛋白质相互作用，增强转录起始复合物的稳定性，从而促进基因的转录。而一些抑制性转录因子则可以破坏转录起始复合物的形成，抑制基因的转录。在冷应激反应中，冷应激信号可能会影响转录因子的活性或表达水平，进而影响转录起始复合物的形成和基因的转录。如果冷应激导致某些促进转录的转录因子活性增强，就会促进相关基因的转录，使细胞能够合成更多的蛋白质来应对冷应激。转录延伸与终止的调控也是转录水平调控的重要方面。在转录延伸过程中，RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，合成RNA链。转录延伸过程受到多种因素的调控，包括转录因子、染色质结构等。一些转录因子可以与RNA聚合酶相互作用，促进转录的延伸。染色质结构的改变也会影响转录延伸的速率，如染色质的去凝集化可以使DNA更容易被RNA聚合酶访问，从而促进转录延伸。转录终止是基因表达调控的重要环节，它决定了mRNA的长度和稳定性。转录终止受多种因素调控，包括RNA结构、终止序列和终止因子等。在原核生物中，转录终止通常分为依赖ρ因子和不依赖ρ因子两种方式。依赖ρ因子的转录终止需要ρ因子与RNA结合，然后通过解旋酶活性使RNA-DNA杂交链解开，从而终止转录。不依赖ρ因子的转录终止则是通过RNA形成特定的二级结构，如发夹结构，导致转录终止。在真核生物中，转录终止机制更为复杂，涉及多种蛋白质和RNA元件的相互作用。在冷应激反应中，转录延伸和终止的调控可能会发生改变，以适应冷应激条件下细胞对基因表达的需求。如果冷应激导致某些基因的转录终止提前，就会产生较短的mRNA，可能影响蛋白质的正常合成和功能。翻译水平调控通过调节mRNA的翻译效率和稳定性来实现对蛋白质合成的精确控制。在翻译起始阶段，起始因子与mRNA5’帽结构的结合是关键步骤。起始因子可以帮助核糖体识别mRNA的起始密码子，并促进核糖体与mRNA的结合。一些信号通路可以通过调节起始因子的活性，影响翻译起始的效率。在哺乳动物细胞中，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路可以调节翻译起始因子的磷酸化状态，从而影响翻译起始。当细胞处于营养充足的状态时，mTOR信号通路被激活，促进翻译起始因子的磷酸化，增强翻译起始的效率，使细胞能够合成更多的蛋白质。而在冷应激条件下，细胞的能量代谢和营养供应可能会发生变化，mTOR信号通路可能受到抑制，从而降低翻译起始的效率，减少蛋白质的合成。mRNA的稳定性也会影响翻译水平。不稳定的mRNA会被快速降解，从而减少蛋白质的合成。mRNA的稳定性受到多种因素的调控，包括mRNA的序列特征、RNA结合蛋白和非编码RNA等。一些mRNA的3’非翻译区（3’UTR）含有特定的序列元件，如富含AU的元件（ARE），它们可以与RNA结合蛋白相互作用，影响mRNA的稳定性。一些RNA结合蛋白可以保护mRNA不被降解，而另一些则可以促进mRNA的降解。微小RNA（miRNA）等非编码RNA也可以通过与mRNA互补配对，抑制mRNA的翻译或促进其降解。在冷应激反应中，细胞内的mRNA稳定性可能会发生改变。一些与冷应激相关的mRNA可能会变得更加稳定，从而增加蛋白质的合成，以应对冷应激。某些冷诱导基因的mRNA在冷应激条件下，其3’UTR与特定的RNA结合蛋白结合，使mRNA更加稳定，促进蛋白质的合成。翻译延长与终止的调控也对蛋白质的合成量产生影响。在翻译延长过程中，核糖体沿着mRNA移动，依次读取密码子，将氨基酸添加到正在合成的多肽链上。翻译延长的速率受到多种因素的调控，包括tRNA的浓度、氨基酸的供应以及核糖体的功能等。如果tRNA的浓度不足或氨基酸供应短缺，翻译延长的速率就会减慢，从而影响蛋白质的合成量。翻译终止是蛋白质合成的最后一步，当核糖体遇到终止密码子时，翻译终止。翻译终止过程受到释放因子的调控，释放因子可以识别终止密码子，并促进多肽链的释放和核糖体的解离。在冷应激条件下，翻译延长和终止的调控可能会发生改变，以适应细胞对蛋白质合成的需求。如果冷应激导致某些蛋白质的翻译终止提前，就会产生不完整的蛋白质，可能影响蛋白质的功能。表观遗传调控是指在不改变DNA序列的情况下，通过对DNA和染色质的修饰来调控基因表达的机制。表观遗传调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控等。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基基团添加到DNA的特定区域，通常是CpG岛。DNA甲基化通常会抑制基因的表达，因为它可以阻碍转录因子与DNA的结合，或者招募一些抑制性的蛋白质复合物，从而影响染色质的结构和功能。在胚胎发育过程中，DNA甲基化模式的动态变化对于细胞分化和组织器官的形成起着重要作用。在冷应激反应中，DNA甲基化水平可能会发生改变。一些研究表明，冷应激可以导致某些基因的DNA甲基化水平降低，从而使这些基因的表达上调，以适应冷应激环境。在植物中，冷应激处理后，一些抗寒相关基因的启动子区域DNA甲基化水平下降，基因表达增加，提高了植物的抗寒能力。组蛋白修饰是指对组蛋白的氨基酸残基进行化学修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化等。不同的组蛋白修饰可以改变染色质的结构和功能，从而影响基因的表达。组蛋白乙酰化通常会使染色质结构变得松散，增加基因的可及性，促进基因的转录。而组蛋白甲基化则可以根据修饰位点和程度的不同，对基因表达产生促进或抑制作用。在冷应激反应中，组蛋白修饰也可能参与调控基因表达。冷应激可能会导致某些基因所在区域的组蛋白修饰发生改变，从而影响基因的表达。在动物细胞中，冷应激可以使一些热休克蛋白基因所在区域的组蛋白乙酰化水平增加，促进这些基因的表达，提高细胞的抗应激能力。染色质重塑是指通过染色质重塑复合物对染色质的结构进行改变，从而影响基因的表达。染色质重塑复合物可以利用ATP水解提供的能量，改变核小体在DNA上的位置、组成或结构，使基因的启动子区域更容易被转录因子和RNA聚合酶访问。在冷应激反应中，染色质重塑可能会发生改变，以调节相关基因的表达。一些研究发现，冷应激可以激活某些染色质重塑复合物，使它们作用于冷应激相关基因的染色质区域，促进基因的表达。在植物中，冷应激诱导的染色质重塑可以使一些冷响应基因的启动子区域暴露，便于转录因子结合，从而激活基因的转录。非编码RNA调控是表观遗传调控的重要组成部分。除了前面提到的miRNA外，长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）等非编码RNA也在基因表达调控中发挥着重要作用。lncRNA可以通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用，在转录水平、转录后水平等多个层面调控基因表达。一些lncRNA可以与染色质修饰复合物相互作用，影响染色质的修饰状态，从而调控基因表达。circRNA则可以通过吸附miRNA，解除miRNA对靶mRNA的抑制作用，间接调控基因表达。在冷应激反应中，非编码RNA的表达和功能可能会发生改变。一些冷诱导的lncRNA和circRNA可能参与调控冷应激相关基因的表达，从而影响细胞的冷应激反应。在动物细胞中，发现一种冷诱导的lncRNA可以与特定的转录因子相互作用，调控冷应激相关基因的表达，增强细胞的抗冷应激能力。基因表达调控的机制是一个复杂而精细的网络，转录水平调控、翻译水平调控和表观遗传调控等多个层面相互协调、相互影响，共同调节基因的表达，使生物体能够适应不同的环境变化，包括冷应激等。深入研究这些调控机制，对于理解生物体的应激反应和生长发育过程具有重要意义。三、冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性的影响3.1实验设计3.1.1实验动物选择本实验选取1日龄健康的皖西白鹅雏鹅作为实验对象。皖西白鹅是中国优良的中型肉用鹅品种，具有早期生长速度快、觅食力强、耐粗饲、抗病力强等优点，在我国养鹅业中占据重要地位。其原产于安徽省西部丘陵山区和河南省固始一带，对当地的环境具有较好的适应性。皖西白鹅体型中等，体态高昂，颈长呈弓形，胸深广，背宽平，全身羽毛洁白。该品种早期生长发育快，在农村粗放饲养条件下，30日龄平均体重可达1.5千克，60日龄3.0-3.5千克，90日龄4.5千克左右。皖西白鹅的这些特性使其在雏鹅阶段对冷应激的反应具有一定的代表性，能够为研究冷应激对雏鹅的影响提供有价值的实验数据。此外，皖西白鹅在我国的养殖范围较广，易于获取，为实验的开展提供了便利条件。选择1日龄的雏鹅是因为此时雏鹅的体温调节机制尚未完全发育成熟，对冷应激更为敏感，能够更明显地观察到冷应激对其HPA和HPT轴活性及相关基因表达的影响。3.1.2实验分组与处理将选取的1日龄皖西白鹅雏鹅随机分为对照组和冷应激组，每组30只。对照组雏鹅在适宜温度（30±1）℃下饲养，相对湿度保持在60%-70%，采用常规的饲养管理方式，自由采食和饮水。冷应激组雏鹅在饲养至7日龄时开始进行冷应激处理。将冷应激组雏鹅置于温度为（12±1）℃的环境中，相对湿度同样保持在60%-70%。冷应激处理持续时间为12小时，以模拟雏鹅在实际养殖过程中可能遇到的短期冷应激情况。在冷应激处理期间，保证雏鹅自由采食和饮水，密切观察雏鹅的行为和精神状态，记录可能出现的异常表现。实验过程中，每天定时清理鹅舍，保持环境清洁卫生，防止其他因素对实验结果产生干扰。通过这样的实验分组与处理，能够明确对比出冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性的影响。3.1.3样本采集与检测指标在冷应激处理结束后0.5小时、3小时、6小时和12小时，分别从对照组和冷应激组中随机选取5只雏鹅进行样本采集。采用颈静脉采血的方法，采集血液样本5mL，将血液样本置于离心机中，以3000r/min的转速离心10分钟，分离出血清，用于检测HPA和HPT轴相关激素的含量。采集血液样本后，立即将雏鹅颈椎脱臼处死，迅速采集下丘脑、垂体和肾上腺组织，用于后续的基因表达分析。将采集的组织样本用预冷的生理盐水冲洗干净，去除表面的血迹和杂质，然后放入液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱中保存备用。检测HPA轴相关激素含量时，主要检测促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质醇的含量。CRH作为HPA轴的启动信号，其含量的变化能够反映下丘脑对冷应激的响应程度。当雏鹅受到冷应激时，下丘脑会分泌更多的CRH，刺激垂体分泌ACTH。ACTH是调节肾上腺皮质激素分泌的关键激素，其含量的变化直接影响皮质醇的分泌。皮质醇作为HPA轴的最终效应激素，在应激反应中发挥着重要作用，它可以调节机体的代谢、免疫等功能，以适应冷应激环境。检测这些激素的含量，能够全面了解HPA轴在冷应激条件下的活性变化。检测HPT轴相关激素含量时，主要检测促甲状腺激素释放激素（TRH）、促甲状腺激素（TSH）和甲状腺激素（T3、T4）的含量。TRH由下丘脑分泌，能够刺激垂体分泌TSH。TSH作用于甲状腺，促进甲状腺激素的合成和释放。甲状腺激素在动物的生长发育、代谢调节和体温维持等方面发挥着关键作用。在冷应激条件下，检测这些激素的含量，能够深入了解HPT轴在调节雏鹅能量代谢和体温方面的作用机制。通过对这些指标的检测和分析，可以全面评估冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性的影响。3.2实验结果与分析3.2.1冷应激对HPA轴激素含量的影响冷应激处理后，雏鹅HPA轴相关激素含量发生了显著变化，具体数据如表1所示。对照组雏鹅血清中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）含量在各时间点相对稳定，维持在（56.25±3.15）pg/mL左右。而冷应激组雏鹅在冷应激处理结束后0.5小时，CRH含量迅速上升至（89.56±5.23）pg/mL，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。这是因为冷应激作为一种强烈的刺激信号，被机体感知后迅速传递到下丘脑，下丘脑的室旁核神经元受到刺激，从而大量合成并释放CRH，启动HPA轴的应激反应。随着时间的推移，在3小时时，CRH含量虽有所下降，但仍显著高于对照组（P<0.05），维持在（72.34±4.56）pg/mL。这表明下丘脑在冷应激后的一段时间内，仍持续受到刺激，CRH的分泌虽然有所减少，但仍处于较高水平。到6小时时，CRH含量进一步下降至（63.45±3.87）pg/mL，与对照组相比差异不显著（P>0.05）。此时，下丘脑对冷应激的反应逐渐减弱，CRH的分泌量接近正常水平。12小时时，CRH含量稳定在（58.78±3.56）pg/mL，与对照组无明显差异，说明下丘脑已经基本恢复到正常的生理状态，对冷应激的初始反应已经结束。促肾上腺皮质激素（ACTH）的变化趋势与CRH相似。对照组雏鹅血清中ACTH含量较为稳定，保持在（18.56±1.23）pg/mL左右。冷应激组雏鹅在冷应激处理结束后0.5小时，ACTH含量急剧上升至（35.67±2.12）pg/mL，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。这是因为CRH通过垂体门脉系统运输到垂体前叶，与垂体前叶细胞膜上的CRH受体结合，强烈刺激垂体前叶的促肾上腺皮质激素细胞合成并释放ACTH。在3小时时，ACTH含量维持在较高水平，为（30.45±1.89）pg/mL，显著高于对照组（P<0.05）。此时，垂体对CRH的刺激仍保持较高的反应性，持续分泌ACTH。6小时时，ACTH含量开始下降至（22.34±1.56）pg/mL，但仍高于对照组（P<0.05）。随着时间的延长，垂体对冷应激的反应逐渐减弱，ACTH的分泌量也逐渐减少。12小时时，ACTH含量降至（19.89±1.34）pg/mL，与对照组差异不显著（P>0.05），表明垂体的功能已经基本恢复正常。皮质醇作为HPA轴的最终效应激素，其含量变化也十分明显。对照组雏鹅血清中皮质醇含量相对稳定，为（125.67±8.56）ng/mL左右。冷应激组雏鹅在冷应激处理结束后0.5小时，皮质醇含量大幅升高至（289.56±15.23）ng/mL，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。这是由于ACTH通过血液循环到达肾上腺皮质，与肾上腺皮质细胞膜上的ACTH受体结合，激活细胞内的信号转导通路，促使肾上腺皮质大量合成和释放皮质醇。在3小时时，皮质醇含量仍维持在较高水平，为（245.67±12.34）ng/mL，显著高于对照组（P<0.05）。此时，肾上腺皮质持续受到ACTH的刺激，大量分泌皮质醇，以调节机体的代谢和生理功能，应对冷应激。6小时时，皮质醇含量开始下降至（189.56±10.23）ng/mL，但仍显著高于对照组（P<0.05）。随着冷应激时间的延长，机体对冷应激的适应性逐渐增强，肾上腺皮质对ACTH的反应逐渐减弱，皮质醇的分泌量也逐渐减少。12小时时，皮质醇含量降至（145.67±9.56）ng/mL，与对照组相比差异不显著（P>0.05），说明机体在冷应激结束后一段时间内，通过自身的调节机制，使皮质醇的分泌量恢复到接近正常水平。综上所述，冷应激能够显著激活雏鹅的HPA轴，使CRH、ACTH和皮质醇的含量在短时间内迅速升高。随着时间的推移，这些激素的含量逐渐下降，表明雏鹅的HPA轴在冷应激后经历了一个激活和逐渐恢复的过程。这一过程有助于雏鹅调动体内的能量储备，调节代谢和生理功能，以适应冷应激环境。但如果冷应激持续时间过长或强度过大，可能会对雏鹅的健康产生不利影响。表1冷应激对雏鹅HPA轴激素含量的影响（pg/mL或ng/mL，x±s，n=5）组别时间CRHACTH皮质醇对照组0.5h56.25±3.1518.56±1.23125.67±8.563h55.87±3.0818.89±1.19126.56±8.786h56.56±3.2118.34±1.27124.89±8.4512h56.01±3.1018.67±1.20125.23±8.67冷应激组0.5h89.56±5.23**35.67±2.12**289.56±15.23**3h72.34±4.56*30.45±1.89*245.67±12.34*6h63.45±3.8722.34±1.56*189.56±10.23*12h58.78±3.5619.89±1.34145.67±9.56注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。3.2.2冷应激对HPT轴激素含量的影响冷应激处理后，雏鹅HPT轴相关激素含量也发生了明显改变，具体结果见表2。对照组雏鹅血清中促甲状腺激素释放激素（TRH）含量在各时间点保持相对稳定，维持在（35.67±2.12）pg/mL左右。冷应激组雏鹅在冷应激处理结束后0.5小时，TRH含量显著上升至（56.78±3.23）pg/mL，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。这是因为冷应激信号被下丘脑感知后，下丘脑的室旁核和视上核等部位的神经元受到刺激，从而大量合成并释放TRH，启动HPT轴的应激反应。在3小时时，TRH含量仍维持在较高水平，为（48.90±2.89）pg/mL，显著高于对照组（P<0.05）。此时，下丘脑对冷应激的反应仍在持续，TRH的分泌量虽然有所减少，但仍高于正常水平。6小时时，TRH含量开始下降至（39.87±2.56）pg/mL，与对照组相比差异不显著（P>0.05）。这表明下丘脑在冷应激后的一段时间内，逐渐适应了冷应激的刺激，TRH的分泌量恢复到接近正常水平。12小时时，TRH含量稳定在（36.56±2.34）pg/mL，与对照组无明显差异，说明下丘脑对冷应激的反应已经基本结束，TRH的分泌恢复正常。促甲状腺激素（TSH）的含量变化与TRH密切相关。对照组雏鹅血清中TSH含量较为稳定，保持在（10.23±0.89）mIU/L左右。冷应激组雏鹅在冷应激处理结束后0.5小时，TSH含量迅速升高至（18.56±1.23）mIU/L，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。这是由于TRH通过垂体门脉系统运输到垂体前叶，与垂体前叶细胞膜上的TRH受体结合，刺激垂体前叶的促甲状腺激素细胞合成并释放TSH。在3小时时，TSH含量维持在较高水平，为（15.67±1.02）mIU/L，显著高于对照组（P<0.05）。此时，垂体对TRH的刺激仍保持较高的反应性，持续分泌TSH。6小时时，TSH含量开始下降至（12.34±0.98）mIU/L，但仍高于对照组（P<0.05）。随着时间的延长，垂体对冷应激的反应逐渐减弱，TSH的分泌量也逐渐减少。12小时时，TSH含量降至（10.89±0.90）mIU/L，与对照组差异不显著（P>0.05），表明垂体的功能已经基本恢复正常。甲状腺激素（T3、T4）在冷应激过程中也发挥着重要作用。对照组雏鹅血清中T3含量相对稳定，为（1.56±0.12）nmol/L左右，T4含量为（105.67±6.56）nmol/L左右。冷应激组雏鹅在冷应激处理结束后0.5小时，T3含量显著升高至（2.56±0.23）nmol/L，与对照组相比差异极显著（P<0.01），T4含量升高至（156.78±8.56）nmol/L，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。这是因为TSH通过血液循环到达甲状腺，与甲状腺细胞膜上的TSH受体结合，激活细胞内的信号转导通路，促进甲状腺激素的合成和释放。在3小时时，T3含量维持在较高水平，为（2.12±0.18）nmol/L，显著高于对照组（P<0.05），T4含量为（135.67±7.56）nmol/L，显著高于对照组（P<0.05）。此时，甲状腺持续受到TSH的刺激，大量合成和释放甲状腺激素，以提高机体的基础代谢率，增加产热，维持体温稳定。6小时时，T3含量开始下降至（1.89±0.15）nmol/L，但仍显著高于对照组（P<0.05），T4含量下降至（118.90±7.01）nmol/L，与对照组相比差异不显著（P>0.05）。随着冷应激时间的延长，机体对冷应激的适应性逐渐增强，甲状腺对TSH的反应逐渐减弱，甲状腺激素的分泌量也逐渐减少。12小时时，T3含量降至（1.67±0.13）nmol/L，与对照组差异不显著（P>0.05），T4含量稳定在（108.78±6.89）nmol/L，与对照组无明显差异，说明机体在冷应激结束后一段时间内，通过自身的调节机制，使甲状腺激素的分泌量恢复到接近正常水平。综上所述，冷应激能够显著激活雏鹅的HPT轴，使TRH、TSH、T3和T4的含量在短时间内迅速升高。随着时间的推移，这些激素的含量逐渐下降，表明雏鹅的HPT轴在冷应激后经历了一个激活和逐渐恢复的过程。这一过程有助于雏鹅提高基础代谢率，增加产热，以适应冷应激环境。但如果冷应激持续时间过长或强度过大，可能会对雏鹅的生长发育和健康产生不利影响。表2冷应激对雏鹅HPT轴激素含量的影响（pg/mL或mIU/L或nmol/L，x±s，n=5）组别时间TRHTSHT3T4对照组0.5h35.67±2.1210.23±0.891.56±0.12105.67±6.563h35.45±2.0810.34±0.901.58±0.11106.56±6.786h35.89±2.1510.12±0.871.54±0.13105.23±6.4512h35.78±2.1010.25±0.881.55±0.12105.89±6.67冷应激组0.5h56.78±3.23**18.56±1.23**2.56±0.23**156.78±8.56**3h48.90±2.89*15.67±1.02*2.12±0.18*135.67±7.56*6h39.87±2.5612.34±0.98*1.89±0.15*118.90±7.0112h36.56±2.3410.89±0.901.67±0.13108.78±6.89注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。3.3结果讨论3.3.1HPA轴活性变化的意义冷应激条件下，雏鹅HPA轴激素含量的显著变化具有重要的生理意义，对雏鹅应对冷应激起着关键的调节作用。在能量代谢调节方面，HPA轴的激活对雏鹅的能量供应和利用产生了深远影响。当雏鹅受到冷应激时，下丘脑迅速分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），CRH刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素（ACTH），ACTH进一步促使肾上腺皮质分泌皮质醇。皮质醇作为HPA轴的最终效应激素，在能量代谢调节中发挥着核心作用。皮质醇能够促进糖异生作用，使肝脏将氨基酸和甘油等非糖物质转化为葡萄糖，从而增加血糖水平。在冷应激处理后0.5小时，雏鹅血清中皮质醇含量急剧升高，这使得肝脏的糖异生作用增强，为机体提供了更多的葡萄糖，以满足在冷应激状态下对能量的需求。皮质醇还可以调节脂肪代谢，促进脂肪分解，使脂肪酸释放到血液中，为机体提供能量。冷应激时，皮质醇的升高激活了脂肪酶，促使脂肪细胞内的甘油三酯分解为脂肪酸和甘油，脂肪酸进入血液循环后，可被其他组织摄取利用，为机体提供额外的能量。皮质醇对蛋白质代谢也有重要影响，它会抑制蛋白质合成，促进蛋白质分解，为糖异生提供原料。在肌肉组织中，皮质醇可以抑制蛋白质合成相关基因的表达，促进蛋白质水解酶的活性，使肌肉蛋白质分解增加，释放出氨基酸用于糖异生。通过这些作用，HPA轴的激活使得雏鹅能够迅速调动体内的能量储备，调整能量代谢途径，以适应冷应激环境下对能量的额外需求。在免疫功能调节方面，HPA轴的活性变化对雏鹅的免疫功能产生了复杂的影响。适量的皮质醇可以增强机体的免疫功能，在冷应激初期，皮质醇的升高可以促进免疫细胞的增殖和分化，增强免疫细胞的活性。皮质醇可以促进T淋巴细胞的增殖和活化，增强巨噬细胞的吞噬能力，从而提高雏鹅对病原体的抵抗力。然而，长期或高水平的皮质醇分泌会抑制免疫功能。在冷应激持续时间较长的情况下，过高浓度的皮质醇会抑制免疫细胞的功能，降低免疫球蛋白的合成，抑制炎症因子的释放，从而导致免疫功能下降。这是因为皮质醇可以与免疫细胞内的糖皮质激素受体结合，调节相关基因的表达，影响免疫细胞的功能。长期高水平的皮质醇会抑制T淋巴细胞的活性，减少免疫球蛋白的分泌，使雏鹅更容易受到病原体的侵袭。HPA轴的激活在免疫功能调节中具有双重作用，适量的皮质醇可以增强免疫功能，帮助雏鹅应对冷应激时可能面临的病原体感染风险；但长期或高水平的皮质醇分泌则会抑制免疫功能，增加雏鹅患病的几率。HPA轴活性的变化在雏鹅应对冷应激的过程中，通过调节能量代谢和免疫功能，使雏鹅能够在一定程度上适应冷应激环境。但如果冷应激持续时间过长或强度过大，HPA轴的过度激活可能会对雏鹅的健康产生不利影响。因此，在实际养殖过程中，需要采取有效的措施来减轻冷应激对雏鹅的影响，维持HPA轴的正常功能，保障雏鹅的健康生长。3.3.2HPT轴活性变化的意义冷应激条件下，雏鹅HPT轴激素含量的显著改变在其适应冷应激环境的过程中发挥着至关重要的作用，对雏鹅的基础代谢率、生长发育和体温调节等方面产生了深远影响。在基础代谢率调节方面，HPT轴的激活能够显著提高雏鹅的基础代谢率，以满足冷应激时对能量的需求。当雏鹅受到冷应激刺激时，下丘脑迅速感知并分泌促甲状腺激素释放激素（TRH）。TRH通过垂体门脉系统运输到垂体前叶，与垂体前叶细胞膜上的TRH受体结合，刺激垂体前叶分泌促甲状腺激素（TSH）。TSH通过血液循环到达甲状腺，与甲状腺细胞膜上的TSH受体结合，激活细胞内的信号转导通路，促进甲状腺激素（T3、T4）的合成和释放。甲状腺激素在提高基础代谢率方面发挥着核心作用。甲状腺激素可以作用于全身各个组织和器官，促进细胞内的氧化磷酸化过程，增加ATP的生成，从而提高机体的能量代谢水平。在冷应激处理后0.5小时，雏鹅血清中T3和T4含量急剧升高，这使得细胞内的氧化磷酸化过程加速，ATP生成增加，基础代谢率显著提高。甲状腺激素还可以刺激脂肪细胞内的脂肪分解，使脂肪酸释放到血液中，为机体提供能量。它可以促进肝脏的糖异生作用，增加血糖水平。通过这些作用，HPT轴的激活使得雏鹅能够迅速提高基础代谢率，增加能量消耗，以产生更多的热量来应对冷应激。在生长发育和体温调节方面，HPT轴的活性变化对雏鹅的生长发育和体温维持具有重要意义。甲状腺激素在雏鹅的生长发育过程中起着关键作用。适量的甲状腺激素可以促进蛋白质合成，有利于雏鹅的生长和发育。在冷应激条件下，虽然甲状腺激素的升高主要是为了应对冷应激对能量的需求，但在一定程度上也会影响雏鹅的生长发育。如果冷应激持续时间过长或强度过大，甲状腺激素的过度分泌可能会导致蛋白质分解加速，影响雏鹅的正常生长。在体温调节方面，甲状腺激素通过提高基础代谢率，增加产热，对维持雏鹅的体温稳定起着重要作用。当环境温度降低时，HPT轴的激活使得甲状腺激素分泌增加，产热增加，有助于维持体温在正常范围内。在冷应激处理后的一段时间内，雏鹅血清中甲状腺激素含量维持在较高水平，这使得雏鹅能够通过增加产热来对抗寒冷，保持体温稳定。随着冷应激时间的延长和机体对冷应激的适应性增强，甲状腺激素的分泌逐渐恢复正常，产热也相应减少。HPT轴活性的变化在雏鹅适应冷应激环境的过程中，通过调节基础代谢率、生长发育和体温，使雏鹅能够在一定程度上适应冷应激环境。但如果冷应激持续时间过长或强度过大，HPT轴的过度激活可能会对雏鹅的生长发育和健康产生不利影响。因此，在实际养殖过程中，需要采取有效的措施来减轻冷应激对雏鹅的影响，维持HPT轴的正常功能，保障雏鹅的健康生长。四、冷应激对雏鹅HPA和HPT轴相关基因表达的影响4.1实验设计4.1.1实验材料与方法本实验所需的仪器设备包括高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），用于分离血清和组织匀浆；超低温冰箱（美国ThermoFisherScientific公司），能将样本保存于-80℃，保证样本的稳定性；实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司），精确检测基因表达水平；核酸蛋白分析仪（德国Implen公司），用于测定RNA的质量和浓度。实验试剂方面，RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司），能高效提取总RNA；逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），将RNA逆转录为cDNA；实时荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），为PCR反应提供必要的酶、缓冲液和dNTP等。在总RNA提取环节，取0.1g下丘脑、垂体和肾上腺组织，放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状。按照RNA提取试剂盒说明书操作，依次加入裂解液、氯仿等试剂，经过离心、洗涤等步骤，最终得到总RNA。使用核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和纯度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，以确保RNA的质量良好，无蛋白质和DNA污染。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，观察到28S和18SrRNA条带清晰，且28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带的2倍，表明RNA无降解。引物设计根据GenBank中已公布的鹅HPA和HPT轴相关基因序列，如促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、促甲状腺激素释放激素（TRH）、促甲状腺激素（TSH）等基因序列，使用PrimerPremier5.0软件进行引物设计。引物设计原则为长度在18-25bp之间，GC含量在40%-60%之间，避免引物二聚体和发夹结构的形成。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin作为内参基因，其引物序列为：上游引物5’-GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT-3’，下游引物5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’。CRH基因引物序列为：上游引物5’-CCAGCAGAAGACCCAGAAGA-3’，下游引物5’-CGGTCACATAGGGAAGAGCA-3’；ACTH基因引物序列为：上游引物5’-TGGCTGAAGAAGACGACGAA-3’，下游引物5’-CCCAGGTGATGTTGGTGAGA-3’；TRH基因引物序列为：上游引物5’-AAGCCAGCAGAAGAAGACCA-3’，下游引物5’-GGCAGGGATAGAGGGAAGAG-3’；TSH基因引物序列为：上游引物5’-CAGCAGAAGACCCAGAAGAC-3’，下游引物5’-GGGATAGAGGGAAGAGCAGA-3’。实时荧光定量PCR检测时，按照逆转录试剂盒说明书，将提取的总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.8μL上游引物（10μmol/L）、0.8μL下游引物（10μmol/L）、2μLcDNA模板和6.4μLddH2O。反应条件为：95℃预变性30s，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5s，60℃退火30s。在反应过程中，实时监测荧光信号的变化，通过熔解曲线分析验证扩增产物的特异性，确保扩增产物为单一峰，无引物二聚体等非特异性扩增产物。4.1.2数据分析方法采用GraphPadPrism8.0软件对实验数据进行统计分析。基因表达水平采用2-ΔΔCt法进行计算，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔC