双歧杆菌介导重组人GraB - VRB融合蛋白对KDR阳性细胞凋亡的诱导机制探究

双歧杆菌介导重组人GraB-VRB融合蛋白对KDR阳性细胞凋亡的诱导机制探究一、引言1.1研究背景与意义在生命科学的众多研究领域中，KDR（KinaseInsertDomainReceptor，也称VEGFR2，血管内皮生长因子受体-2）始终占据着关键地位。作为血管内皮生长因子（VEGF）的最主要信号转导通路之一，KDR与VEGF的结合对一系列重要生理过程进行着精细调控。在正常生理状态下，KDR对血管内皮细胞的增殖与存活起着核心调节作用，这一过程对维持血管系统的稳定和正常功能至关重要。从胚胎发育时期开始，KDR便积极参与到血管的形成过程中，它精确引导着血管内皮细胞的迁移、分化和组装，促使血管网络有序构建，为胚胎的生长和发育提供充足的血液供应。在成年个体中，KDR依然发挥着不可或缺的作用，它持续调节着血管的生成和修复，确保组织在受到损伤或处于特殊生理需求时，能够及时生成新的血管，以维持正常的生理功能。例如，在伤口愈合过程中，KDR被激活，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速新血管的形成，从而为伤口愈合提供必要的营养和氧气支持。然而，KDR这把“双刃剑”在过度激活和异常表达时，也会带来严重的健康威胁，与多种恶性肿瘤的发生和发展紧密相关。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供营养和氧气，KDR的过度表达能够显著促进肿瘤血管的生成。当肿瘤细胞分泌大量VEGF时，KDR与VEGF特异性结合，激活下游一系列信号通路，如PI3K-Akt、Ras-Raf-MEK-ERK等。这些信号通路的激活促使血管内皮细胞大量增殖、迁移，形成丰富的肿瘤血管网络。这些新生血管不仅为肿瘤细胞提供了充足的营养物质和氧气，还为肿瘤细胞的转移创造了条件，使得肿瘤细胞能够通过血管进入血液循环，进而扩散到身体的其他部位。众多研究表明，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤组织中，KDR的表达水平明显高于正常组织，且其表达水平与肿瘤的恶性程度、转移潜能以及患者的预后密切相关。一项针对乳腺癌患者的研究发现，KDR高表达的患者，其肿瘤的复发率和转移率更高，生存期更短。鉴于KDR在肿瘤发展中的关键作用，减少KDR的表达并阻断其信号传递，成为了治疗相关癌症的重要策略，吸引了众多科研人员和医药企业的关注。目前，已经有一些KDR抑制剂被开发并应用于临床，如多西他赛和贝伐珠单抗等。多西他赛通过抑制微管解聚，干扰细胞有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞的增殖，同时也对KDR信号通路有一定的抑制作用；贝伐珠单抗则是一种重组人源化单克隆抗体，它能够特异性地结合VEGF，阻断VEGF与KDR的结合，从而抑制肿瘤血管生成。然而，这些抑制剂在临床应用中暴露出诸多问题。一方面，它们会产生一系列副作用，如多西他赛可能导致骨髓抑制、神经毒性、脱发等不良反应，贝伐珠单抗可能引发高血压、出血、蛋白尿等并发症，这些副作用严重影响了患者的生活质量和治疗依从性。另一方面，长期使用这些抑制剂容易使肿瘤细胞产生耐药性，导致治疗效果逐渐降低，甚至失效。肿瘤细胞可能通过多种机制产生耐药性，如KDR基因突变、下游信号通路的激活补偿以及肿瘤微环境的改变等。因此，研发新的靶点和治疗手段，以克服现有抑制剂的不足，成为了肿瘤治疗领域亟待解决的重要问题。双歧杆菌作为一种益生菌，在人体肠道内发挥着多种有益作用，近年来在生物医药领域展现出巨大的应用潜力。双歧杆菌具有良好的生物安全性，它是人体肠道内的正常菌群之一，长期存在于肠道中，与人体建立了共生关系，不会对人体产生毒性和不良反应。同时，双歧杆菌能够在肠道内定殖，形成稳定的菌群，这为其作为药物载体提供了有利条件。通过基因工程技术，将目的基因导入双歧杆菌中，使其能够表达特定的重组蛋白，为疾病的治疗开辟了新的途径。在本研究中，利用双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白，旨在探索一种全新的治疗策略。颗粒酶B（GranzymeB，GraB）是淋巴细胞发挥抗肿瘤、抗病毒作用的主要效应分子之一，它在穿孔素或其他破坏细胞膜分子的协助下，能够进入靶细胞内，激活多条信号传导途径，诱导细胞凋亡。血管内皮生长因子受体结合肽（VascularEndothelialGrowthFactorReceptorBindingPeptide，VRB）能够特异性地识别并结合KDR，具有良好的靶向性。将GraB与VRB融合，有望利用VRB的靶向作用，使GraB精准地作用于KDR阳性细胞，从而诱导细胞凋亡，达到治疗肿瘤等相关疾病的目的。本研究具有重要的理论和实际意义。从理论层面来看，通过深入研究双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡的机制，有助于揭示一种新的利用双歧杆菌表达重组蛋白调控KDR信号转导通路的治疗策略，丰富和拓展了我们对KDR相关疾病治疗机制的认识，为后续的基础研究提供了新的思路和方向。从实际应用角度出发，本研究探索的新颖治疗途径，为治疗KDR相关疾病提供了新的可能性。如果该策略能够成功实现，将为肿瘤患者带来新的治疗选择，有望克服现有KDR抑制剂的副作用和耐药性问题，提高治疗效果，改善患者的生活质量和预后。同时，这种基于双歧杆菌的治疗方法还具有潜在的成本优势和便捷性，为临床治疗的发展提供了新的契机。1.2国内外研究现状在KDR的研究领域，国内外学者已取得了一系列丰硕成果。KDR作为血管内皮生长因子（VEGF）的关键受体，在正常生理状态下对血管内皮细胞的增殖、存活和迁移起着至关重要的调控作用。在胚胎发育时期，KDR通过与VEGF特异性结合，激活下游如PI3K-Akt、Ras-Raf-MEK-ERK等信号通路，精确引导血管内皮细胞的有序迁移和分化，促使血管网络逐步构建，为胚胎的正常发育提供充足的血液供应。国内有研究通过构建KDR基因敲除小鼠模型，发现胚胎在发育过程中出现严重的血管生成障碍，导致胚胎发育异常甚至死亡。国外相关研究则利用细胞实验，在体外培养的血管内皮细胞中敲低KDR的表达，结果显示细胞的增殖和迁移能力显著下降。在成年个体中，KDR同样发挥着不可或缺的作用，它持续调节血管的生成和修复，以维持组织器官的正常功能。当组织受到损伤时，KDR被激活，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速新血管的形成，从而为组织修复提供必要的营养和氧气支持。然而，KDR的过度激活和异常表达与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。众多研究表明，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤组织中，KDR的表达水平明显高于正常组织，且其表达水平与肿瘤的恶性程度、转移潜能以及患者的预后密切相关。国外一项针对肺癌患者的大规模临床研究发现，KDR高表达的患者，其肿瘤的复发率和转移率更高，生存期更短。国内学者通过对乳腺癌组织样本的检测分析，也证实了KDR的表达与肿瘤血管生成、淋巴结转移以及患者的不良预后呈正相关。鉴于KDR在肿瘤发展中的关键作用，减少KDR的表达并阻断其信号传递，成为了治疗相关癌症的重要策略。目前，已经有一些KDR抑制剂被开发并应用于临床，如多西他赛和贝伐珠单抗等。多西他赛通过抑制微管解聚，干扰细胞有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞的增殖，同时也对KDR信号通路有一定的抑制作用；贝伐珠单抗则是一种重组人源化单克隆抗体，它能够特异性地结合VEGF，阻断VEGF与KDR的结合，从而抑制肿瘤血管生成。然而，这些抑制剂在临床应用中暴露出诸多问题。一方面，它们会产生一系列副作用，如多西他赛可能导致骨髓抑制、神经毒性、脱发等不良反应，贝伐珠单抗可能引发高血压、出血、蛋白尿等并发症，这些副作用严重影响了患者的生活质量和治疗依从性。另一方面，长期使用这些抑制剂容易使肿瘤细胞产生耐药性，导致治疗效果逐渐降低，甚至失效。肿瘤细胞可能通过多种机制产生耐药性，如KDR基因突变、下游信号通路的激活补偿以及肿瘤微环境的改变等。在双歧杆菌表达重组蛋白的研究方面，近年来也取得了显著进展。双歧杆菌作为一种益生菌，具有良好的生物安全性和肠道定殖能力，成为了表达重组蛋白的理想载体。国内外学者通过基因工程技术，将多种目的基因导入双歧杆菌中，使其能够表达特定的重组蛋白，用于疾病的治疗和预防。有研究成功构建了表达人胰岛素的双歧杆菌工程菌株，并在动物实验中证实该菌株能够有效降低糖尿病小鼠的血糖水平。还有研究利用双歧杆菌表达抗原蛋白，开发新型的口服疫苗，为传染病的预防提供了新的途径。然而，目前关于双歧杆菌表达重组蛋白用于肿瘤治疗的研究还相对较少，尤其是针对KDR阳性细胞的靶向治疗研究尚处于起步阶段。在KDR与双歧杆菌表达重组蛋白关联的研究方面，目前国内外的相关报道较为有限。已有研究初步探索了利用双歧杆菌表达具有靶向KDR作用的重组蛋白，如本研究中所涉及的GraB-VRB融合蛋白。通过将VRB与具有诱导细胞凋亡作用的GraB融合，有望利用VRB的靶向性，使GraB精准地作用于KDR阳性细胞，从而诱导细胞凋亡，达到治疗肿瘤等相关疾病的目的。然而，目前对于这种治疗策略的作用机制和效果还缺乏深入的研究。例如，重组蛋白如何与KDR特异性结合，结合后如何激活下游信号通路诱导细胞凋亡，以及在体内环境中，双歧杆菌表达的重组蛋白能否有效到达肿瘤部位并发挥作用等问题，都有待进一步探索和研究。综上所述，当前在KDR和双歧杆菌表达重组蛋白的研究方面都取得了一定的成果，但对于二者关联的研究还存在诸多空白和待解决问题。本研究旨在深入探究双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡的机制，填补相关领域的研究空白，为KDR相关疾病的治疗提供新的理论依据和治疗策略。1.3研究目的与创新点本研究的核心目的在于深入探究双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡的具体机制，为治疗KDR相关疾病开辟新的理论路径。通过构建表达重组人GraB-VRB融合蛋白的双歧杆菌株，利用分子生物学和细胞生物学技术，全面分析重组蛋白对KDR阳性细胞生长、存活以及信号传导的影响，进而揭示其诱导细胞凋亡的分子机制。在实际应用方面，本研究致力于为开发基于双歧杆菌的新型靶向治疗药物提供坚实的实验依据和理论支持，有望为KDR相关疾病患者带来更有效、更安全的治疗选择。本研究的创新点主要体现在多个方面。在载体选择上，创新性地利用双歧杆菌作为重组蛋白的表达载体。双歧杆菌作为人体肠道内的有益菌群，具有良好的生物安全性，能够在肠道内稳定定殖，这一特性为其作为药物载体提供了独特优势。通过基因工程技术将目的基因导入双歧杆菌，使其能够表达重组人GraB-VRB融合蛋白，不仅利用了双歧杆菌的安全性和定殖能力，还为药物的靶向递送提供了新的思路，与传统的药物载体相比，具有更高的生物相容性和更低的免疫原性。在融合蛋白设计上，将颗粒酶B（GraB）与血管内皮生长因子受体结合肽（VRB）融合，构建了具有独特功能的重组人GraB-VRB融合蛋白。VRB能够特异性地识别并结合KDR，赋予了融合蛋白良好的靶向性；而GraB则是淋巴细胞发挥抗肿瘤、抗病毒作用的主要效应分子之一，在穿孔素或其他破坏细胞膜分子的协助下，能够进入靶细胞内，激活多条信号传导途径，诱导细胞凋亡。这种融合蛋白的设计，巧妙地结合了两者的优势，使得GraB能够在VRB的引导下，精准地作用于KDR阳性细胞，提高了治疗的特异性和有效性，为肿瘤等KDR相关疾病的靶向治疗提供了一种全新的策略，与传统的单一靶点治疗药物相比，具有更强的针对性和更广泛的应用前景。在治疗策略上，本研究提出的利用双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡的方法，为KDR相关疾病的治疗提供了一种全新的途径。这种方法不仅克服了传统KDR抑制剂的副作用和耐药性问题，还为开发新型的靶向治疗药物提供了新的方向，有望在临床治疗中发挥重要作用，为患者带来更好的治疗效果和生活质量。二、相关理论基础2.1KDR的结构与功能2.1.1KDR的分子结构KDR，作为血管内皮生长因子受体-2（VEGFR2），在血管生成和肿瘤发展等生理病理过程中发挥着核心作用。其分子结构由多个关键部分组成，这些结构元件相互协作，赋予了KDR独特的生物学功能。KDR蛋白属于酪氨酸激酶受体家族，由胞外区、跨膜区和胞内区三个主要部分构成。胞外区包含7个免疫球蛋白样结构域（Ig-likedomain），这些结构域在空间上有序排列，形成了一个复杂的三维结构。其中，第2和第3个免疫球蛋白样结构域在与血管内皮生长因子（VEGF）的结合过程中起着决定性作用。它们具有特定的氨基酸序列和空间构象，能够与VEGF分子表面的相应位点特异性结合，这种高度特异性的结合是KDR信号传导的起始步骤。研究表明，通过定点突变技术改变第2、3个免疫球蛋白样结构域中的关键氨基酸，会显著降低KDR与VEGF的亲和力，从而影响下游信号通路的激活。跨膜区由一段高度疏水的氨基酸序列组成，它将KDR蛋白锚定在细胞膜上，起到连接胞外区和胞内区的桥梁作用。跨膜区的结构稳定性对于KDR的正常功能至关重要，它确保了在VEGF与胞外区结合后，能够迅速将信号传递到胞内。胞内区则包含多个重要的功能域，其中酪氨酸激酶结构域是最为关键的部分。酪氨酸激酶结构域具有多个酪氨酸残基，当VEGF与KDR的胞外区结合后，会引发KDR分子的二聚化，进而激活酪氨酸激酶结构域。激活后的酪氨酸激酶会使自身以及下游信号分子中的酪氨酸残基发生磷酸化，从而启动一系列复杂的信号传导级联反应。除了酪氨酸激酶结构域，胞内区还包含一些调节性结构域，如自抑制结构域。自抑制结构域在KDR未被激活时，能够抑制酪氨酸激酶的活性，防止信号的异常激活；而在KDR与VEGF结合后，自抑制结构域会发生构象变化，解除对酪氨酸激酶的抑制，使KDR能够正常发挥信号传导功能。KDR的分子结构对其与VEGF的结合及信号传导具有深远影响。其独特的免疫球蛋白样结构域赋予了KDR与VEGF高亲和力和特异性结合的能力，确保了信号传递的准确性和高效性。而跨膜区和胞内区的结构则保证了信号能够顺利从细胞外传递到细胞内，并激活下游一系列复杂的信号通路，调控细胞的增殖、迁移、存活等生物学过程。这种精细的分子结构是KDR在生理和病理条件下发挥重要作用的基础，深入了解KDR的分子结构，有助于我们更好地理解其生物学功能，为开发针对KDR的靶向治疗药物提供理论依据。2.1.2KDR在血管生成中的作用机制在正常生理条件下，KDR在血管生成过程中扮演着不可或缺的角色。血管生成是一个复杂而有序的过程，涉及多个细胞类型和分子信号通路的协同作用，而KDR在其中起着关键的调控作用。在胚胎发育时期，KDR的表达在血管内皮细胞中高度活跃。VEGF作为KDR的主要配体，由周围组织细胞分泌后，与血管内皮细胞表面的KDR特异性结合。这种结合引发KDR的二聚化和酪氨酸激酶结构域的激活，进而启动下游一系列信号传导通路。其中，PI3K-Akt信号通路在促进血管内皮细胞的存活和增殖方面发挥着重要作用。激活的KDR通过招募和激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3进一步激活Akt蛋白。Akt通过磷酸化一系列下游底物，抑制细胞凋亡相关蛋白的活性，促进细胞存活；同时，Akt还能激活mTOR等信号分子，促进蛋白质合成和细胞周期进程，从而促进血管内皮细胞的增殖。Ras-Raf-MEK-ERK信号通路在调节血管内皮细胞的迁移和分化中发挥着关键作用。当KDR被激活后，通过一系列分子间的相互作用，激活Ras蛋白，Ras再激活Raf激酶，Raf进一步磷酸化并激活MEK，MEK激活ERK。激活的ERK可以进入细胞核，调节一系列与细胞迁移和分化相关基因的表达，如促进细胞骨架重组相关基因的表达，从而增强血管内皮细胞的迁移能力；同时，ERK还能调节血管内皮细胞特异性基因的表达，促进细胞向成熟血管内皮细胞分化。这些信号通路的协同作用，促使血管内皮细胞增殖、迁移和分化，形成有序的血管网络，为胚胎的生长和发育提供充足的血液供应。在肿瘤病理条件下，KDR的作用机制发生了显著变化，与肿瘤的生长和转移密切相关。肿瘤细胞具有无限增殖的能力，为了满足其快速生长对营养和氧气的需求，肿瘤细胞会大量分泌VEGF。高水平的VEGF与肿瘤血管内皮细胞表面的KDR结合，持续激活KDR信号通路。与正常生理条件下相比，肿瘤微环境中的KDR信号通路处于过度激活状态，导致血管生成异常活跃。这种异常的血管生成不仅为肿瘤细胞提供了充足的营养和氧气，还为肿瘤细胞的转移创造了条件。肿瘤血管的结构和功能与正常血管存在明显差异，肿瘤血管往往管径粗细不均、分支紊乱、血管壁不完整，这些特点使得肿瘤细胞更容易进入血液循环，从而发生远处转移。KDR信号通路的异常激活还会影响肿瘤微环境中的其他细胞类型，进一步促进肿瘤的发展。例如，KDR激活后可以上调血管内皮细胞表面的黏附分子表达，促进肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附，增加肿瘤细胞进入血液循环的机会。此外，KDR信号通路还可以招募巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞到肿瘤微环境中，这些免疫细胞在肿瘤微环境的影响下，可能会失去正常的免疫监视和杀伤功能，反而分泌一些细胞因子和生长因子，促进肿瘤细胞的生长和转移。KDR在血管生成中通过与VEGF结合激活下游信号通路，在正常生理和肿瘤病理条件下发挥着不同的作用。深入了解KDR在血管生成中的作用机制，对于揭示肿瘤的发生发展机制以及开发有效的肿瘤治疗策略具有重要意义。2.2双歧杆菌的特性与应用2.2.1双歧杆菌的生物学特性双歧杆菌属于革兰氏阳性菌，在显微镜下呈现出多样的形态，常见的有短杆状、长弯杆状、分叉杆状以及近球状等。这些形态各异的细胞可单个存在，也能排列成V形、栅栏状或星状，其独特的形态特征使其在微生物界中易于辨认。双歧杆菌不形成芽孢，也不具备运动能力，这一特性与许多其他细菌有所不同，限制了它们在环境中的主动扩散能力，但也赋予了它们在特定生态位中稳定生存的优势。双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气极为敏感，这意味着它们只能在无氧或极低氧浓度的环境中生长繁殖。在有氧条件下，氧气会产生一些对双歧杆菌有毒害作用的代谢产物，如过氧化氢等，这些物质会破坏双歧杆菌细胞内的生物大分子，干扰其正常的生理代谢过程，导致细胞生长受到抑制甚至死亡。双歧杆菌的最适生长温度通常在37-41℃之间，这与人体肠道内的温度相近，使其能够在人体肠道这一特定环境中良好地生存和繁衍。其生长的pH范围一般为4.5-8.5，最适pH为6.5-7.0。在适宜的pH条件下，双歧杆菌的酶活性能够保持正常，细胞的代谢过程得以顺利进行；而当pH值偏离最适范围时，会影响酶的活性和细胞膜的稳定性，进而影响双歧杆菌的生长。在代谢方面，双歧杆菌具有独特的异型乳酸发酵途径，也被称为双歧杆菌途径。在这一过程中，由于双歧杆菌缺乏醛缩酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，它们利用果糖-6-磷酸盐磷酸转酮酶（F6PPK）来代谢糖类。以葡萄糖为例，双歧杆菌通过这一途径将2mol葡萄糖发酵为3mol乙酸和2mol乳酸，而不产生二氧化碳。F6PPK在双歧杆菌的代谢过程中起着关键作用，不仅为细胞提供能量和代谢产物，还可作为鉴定双歧杆菌的标志性酶类，因为其他细菌通常不具备这种特殊的代谢途径和关键酶。双歧杆菌在人体肠道微生态系统中占据着重要地位，是肠道内的重要有益菌群之一。在婴儿肠道内，双歧杆菌的数量相对较多，它们能够帮助婴儿消化食物，促进营养物质的吸收，同时抑制有害菌的生长，维持肠道微生态的平衡。随着年龄的增长，双歧杆菌的数量会逐渐减少，这可能与饮食结构的改变、生活环境以及健康状况等因素有关。在老年人肠道中，双歧杆菌的数量往往更少，这可能导致肠道微生态失衡，增加肠道疾病的发生风险。双歧杆菌通过多种方式维持肠道微生态平衡。一方面，它们通过竞争营养物质和黏附位点，抑制有害菌在肠道内的定植和生长。例如，双歧杆菌能够利用肠道内的糖类等营养物质，使其无法被有害菌利用；同时，双歧杆菌能够黏附在肠道上皮细胞表面，形成一层生物屏障，阻止有害菌与上皮细胞的结合。另一方面，双歧杆菌在代谢过程中产生的乙酸、乳酸等短链脂肪酸，能够降低肠道内的pH值，营造酸性环境，这种酸性环境不利于大多数有害菌的生长，从而起到抑制有害菌的作用。2.2.2双歧杆菌作为表达载体的优势双歧杆菌作为表达载体具有多方面的显著优势，在生物医药领域展现出巨大的应用潜力。从安全性角度来看，双歧杆菌是人体肠道内的正常菌群，与人体建立了长期的共生关系。在长期的进化过程中，人体已经适应了双歧杆菌的存在，对其具有良好的耐受性。这使得双歧杆菌在作为表达载体时，不会引发人体强烈的免疫反应。与其他一些可能具有免疫原性的表达载体相比，双歧杆菌能够避免因免疫排斥反应而导致的治疗失败或不良反应。例如，某些病毒载体在进入人体后，可能会被免疫系统识别为外来病原体，引发免疫攻击，不仅降低了载体的有效性，还可能对人体造成伤害。而双歧杆菌的安全性为其在体内表达重组蛋白提供了可靠的保障，使其能够更稳定地发挥作用。双歧杆菌能够在肠道内稳定定殖，这一特性为其作为表达载体提供了重要的基础。它们能够黏附在肠道上皮细胞表面，形成相对稳定的菌群结构。一旦双歧杆菌成功定殖，它们就可以持续表达重组蛋白。这与一些其他表达系统不同，例如某些体外表达系统虽然能够高效表达蛋白，但难以在体内持续发挥作用。双歧杆菌在肠道内的持续定殖使得重组蛋白能够在较长时间内释放，维持有效的浓度，从而实现对疾病的持续治疗。对于一些慢性疾病的治疗，如肠道炎症、肿瘤等，需要药物或治疗因子能够长期稳定地发挥作用，双歧杆菌的这一特性使其能够更好地满足这一需求。双歧杆菌还具有靶向性的优势。通过基因工程技术，可以对双歧杆菌进行改造，使其能够特异性地靶向特定的组织或细胞。在本研究中，利用双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白，VRB能够特异性地识别并结合KDR，赋予了双歧杆菌靶向KDR阳性细胞的能力。这种靶向性使得重组蛋白能够精准地作用于目标细胞，提高了治疗的特异性和有效性。与传统的全身性治疗方法相比，靶向治疗能够减少对正常组织和细胞的损伤，降低治疗的副作用。例如，在肿瘤治疗中，传统的化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成损害，导致患者出现脱发、恶心、呕吐等不良反应。而利用双歧杆菌的靶向性，能够将治疗因子直接输送到肿瘤部位，减少对其他正常组织的影响，提高治疗效果。2.3重组人GraB-VRB融合蛋白2.3.1GraB和VRB的结构与功能颗粒酶B（GranzymeB，GraB）是一种丝氨酸蛋白酶，在细胞免疫过程中发挥着核心作用，是淋巴细胞发挥抗肿瘤、抗病毒作用的主要效应分子之一。从结构上看，GraB的编码基因位于人类基因组的14号染色体上。其成熟蛋白由约277个氨基酸残基组成，分子量约为32kDa。GraB的三维结构呈现出典型的丝氨酸蛋白酶折叠模式，包含一个催化三联体，由丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）组成，这三个氨基酸残基在空间上紧密靠近，共同构成了酶的活性中心。在催化过程中，丝氨酸残基的羟基作为亲核试剂，对底物肽键进行攻击，从而实现对底物的切割。GraB的生物学功能主要体现在诱导细胞凋亡方面。在免疫反应中，当细胞毒性T淋巴细胞（CTL）或自然杀伤细胞（NK细胞）识别并结合靶细胞后，会通过胞吐作用释放含有GraB和穿孔素的细胞毒性颗粒。穿孔素在靶细胞膜上形成孔道，使GraB能够进入靶细胞内。进入靶细胞的GraB可以激活多条信号传导途径。它能够直接切割并激活半胱天冬酶（caspase）家族成员，如caspase-3、caspase-7等，这些激活的caspase进一步作用于下游底物，引发细胞凋亡的级联反应，导致细胞DNA断裂、染色质凝聚、细胞膜皱缩等典型的凋亡特征。GraB还可以通过切割其他细胞内的关键蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）等，干扰细胞的正常代谢和修复过程，促进细胞凋亡。血管内皮生长因子受体结合肽（VascularEndothelialGrowthFactorReceptorBindingPeptide，VRB）是一段能够特异性识别并结合血管内皮生长因子受体（VEGFR）的短肽。其氨基酸序列通常由10-20个氨基酸组成，虽然长度较短，但具有高度的特异性和亲和力。VRB的结构中包含一些关键的氨基酸残基，这些残基通过特定的空间排列，形成了与VEGFR结合的位点。通过结构生物学研究发现，VRB与VEGFR的结合区域主要位于VEGFR的胞外结构域，尤其是与VEGF结合的关键区域存在部分重叠。这种结构上的互补性使得VRB能够与VEGFR特异性结合，从而阻断VEGF与VEGFR的结合，抑制VEGFR信号通路的激活。VRB在肿瘤治疗中具有重要的应用价值，主要体现在其良好的靶向性上。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，而VEGFR在肿瘤血管内皮细胞上高表达。VRB能够特异性地识别并结合肿瘤血管内皮细胞表面的VEGFR，将与之融合的其他治疗分子精准地递送到肿瘤部位。在本研究中，将VRB与GraB融合，利用VRB的靶向性，使GraB能够特异性地作用于KDR阳性的肿瘤血管内皮细胞，提高了治疗的特异性和有效性，减少了对正常组织和细胞的损伤。2.3.2融合蛋白的构建原理将GraB和VRB基因重组构建融合蛋白，涉及一系列复杂而精细的分子生物学原理和技术方法。在基因水平上，首先需要获取GraB和VRB的基因序列。GraB基因可以从人类基因组DNA中通过PCR扩增的方法获得，利用特异性引物，根据已知的GraB基因序列设计引物的核苷酸序列，引物的5'端和3'端分别与GraB基因的两端互补。在PCR反应体系中，加入模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶等成分，通过变性、退火、延伸等循环步骤，使GraB基因得到特异性扩增。VRB基因由于其序列较短，也可以通过化学合成的方法直接获得，根据VRB的氨基酸序列，利用氨基酸密码子表反推出对应的核苷酸序列，然后通过固相合成技术在体外合成VRB基因。获得GraB和VRB基因后，需要选择合适的表达载体。在本研究中，选择能够在双歧杆菌中稳定表达的载体，如一些经过改造的双歧杆菌内源性质粒或穿梭质粒。这些载体通常包含复制起始位点、启动子、筛选标记等关键元件。复制起始位点保证了载体在双歧杆菌中的自主复制；启动子则控制基因的转录起始，选择具有强启动活性的启动子，如双歧杆菌中一些组成型或诱导型启动子，能够提高融合蛋白的表达水平；筛选标记如抗生素抗性基因，方便在转化过程中筛选出含有重组载体的双歧杆菌菌株。利用限制性内切酶对表达载体和GraB、VRB基因进行酶切处理。限制性内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定位置切割DNA。选择合适的限制性内切酶，使得载体和基因的酶切位点互补。例如，选择一种限制性内切酶在载体上切割出粘性末端，同时在GraB和VRB基因的两端也切割出相同的粘性末端。然后，利用DNA连接酶将酶切后的GraB和VRB基因按照正确的顺序连接到表达载体上，形成重组表达载体。DNA连接酶能够催化DNA片段之间的磷酸二酯键形成，将不同的DNA片段连接在一起。将重组表达载体导入双歧杆菌中，常用的方法有电穿孔法。在高电压脉冲的作用下，使双歧杆菌细胞膜产生瞬时的小孔，重组表达载体通过这些小孔进入细胞内。将转化后的双歧杆菌接种到含有相应抗生素的培养基中进行筛选，只有成功导入重组表达载体的双歧杆菌才能在含有抗生素的培养基上生长。筛选出阳性克隆后，对其进行进一步的鉴定，如通过PCR扩增、酶切鉴定、测序等方法，确保重组表达载体的正确性和稳定性。在双歧杆菌中，重组表达载体在启动子的驱动下，转录形成融合蛋白的mRNA，然后在核糖体上翻译形成重组人GraB-VRB融合蛋白。通过对培养条件的优化，如调节培养基的成分、pH值、培养温度等，提高融合蛋白的表达量和活性。三、实验设计与方法3.1实验材料准备实验选用的双歧杆菌菌株为青春双歧杆菌（Bifidobacteriumadolescentis），该菌株具有良好的肠道定殖能力和生物安全性，已被广泛应用于益生菌制剂的开发和研究中。双歧杆菌菌株从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）购得，保存于含有15%甘油的MRS（DeMan,RogosaandSharpe）培养基中，-80℃冻存。MRS培养基是一种专门用于双歧杆菌等乳酸菌培养的培养基，其主要成分包括蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、葡萄糖、吐温80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、硫酸锰等，这些成分能够为双歧杆菌的生长提供丰富的营养物质。实验所用的细胞株为KDR阳性的人脐静脉血管内皮细胞株（HUVEC）和小鼠结肠癌细胞株CT-26，以及KDR阴性的人胚肾细胞株293T。HUVEC细胞株购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），CT-26细胞株由本实验室保存，293T细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的M199培养基中；CT-26细胞培养于含10%FBS、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI1640培养基中；293T细胞培养于含10%FBS、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中。所有细胞均置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，定期更换培养基，待细胞生长至对数生长期时进行实验。表达载体选用pBBADα，该载体是一种常用于双歧杆菌表达系统的穿梭质粒，具有在双歧杆菌和大肠杆菌中自主复制的能力。pBBADα载体含有L-阿拉伯糖诱导型启动子，能够在L-阿拉伯糖的诱导下启动下游基因的表达。此外，载体上还携带氨苄青霉素抗性基因，用于筛选含有重组载体的菌株。pBBADα载体由本实验室保存，通过大肠杆菌DH5α进行扩增，采用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取质粒，经限制性内切酶酶切和测序鉴定正确后备用。在试剂方面，限制性内切酶BamHI、XhoI购自NEB公司，这些限制性内切酶能够识别并切割特定的DNA序列，用于构建重组表达载体时对目的基因和载体的酶切处理。T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，它能够催化DNA片段之间的磷酸二酯键形成，将酶切后的目的基因和载体连接起来。DNAMarker购自ThermoFisherScientific公司，用于在琼脂糖凝胶电泳中确定DNA片段的大小。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，分别用于从细菌中提取质粒和从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。L-阿拉伯糖购自Sigma公司，用于诱导双歧杆菌中重组蛋白的表达。蛋白质Marker购自ThermoFisherScientific公司，用于在蛋白质电泳中确定蛋白质的分子量。HRP标记的羊抗鼠IgG和HRP标记的羊抗兔IgG购自JacksonImmunoResearch公司，用于蛋白质免疫印迹实验中的二抗检测。ECL化学发光试剂购自Millipore公司，用于检测免疫印迹实验中结合了HRP标记二抗的蛋白质条带。MTT试剂购自Sigma公司，用于检测细胞增殖活性。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司，用于检测细胞凋亡情况。实验仪器设备包括高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于细胞和细菌的离心分离；PCR仪（Bio-Rad公司），用于目的基因的扩增；凝胶成像系统（Bio-Rad公司），用于观察和记录琼脂糖凝胶电泳和蛋白质电泳的结果；酶标仪（ThermoFisherScientific公司），用于检测MTT实验中的吸光度值；流式细胞仪（BDBiosciences公司），用于检测细胞凋亡和细胞周期等；CO₂培养箱（ThermoFisherScientific公司），用于细胞的培养；厌氧培养箱（Ruskinn公司），用于双歧杆菌的厌氧培养。3.2双歧杆菌工程菌株的构建3.2.1重组表达载体的构建重组表达载体的构建是本研究的关键环节，其构建过程涉及一系列精确的分子生物学操作。首先，以提取的人外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过逆转录PCR（RT-PCR）技术获取GraB基因。根据GenBank中已公布的GraB基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物5'-CGGGATCCATGGCCTTCCTGCTG-3'，下游引物5'-CCGCTCGAGTCACAGGGCTCCAAG-3'。引物两端分别引入BamHI和XhoI酶切位点（下划线部分），以便后续与表达载体进行连接。在RT-PCR反应体系中，加入适量的总RNA、逆转录酶、dNTP、引物以及缓冲液等成分。先进行逆转录反应，将RNA逆转录为cDNA。然后以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约830bp处出现特异性条带，与预期的GraB基因大小相符。对于VRB基因，由于其序列较短，采用化学合成的方法直接获取。根据已报道的VRB氨基酸序列，利用氨基酸密码子表反推出对应的核苷酸序列。为了便于与GraB基因连接，在VRB基因的两端也引入与GraB基因相同的BamHI和XhoI酶切位点。合成的VRB基因经测序验证正确后备用。表达载体pBBADα的处理同样至关重要。用限制性内切酶BamHI和XhoI对pBBADα载体进行双酶切。酶切反应体系为：pBBADα载体5μg，10×Buffer5μl，BamHI2μl，XhoI2μl，加ddH₂O至总体积50μl。将反应体系置于37℃水浴锅中孵育2h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒回收线性化的pBBADα载体片段。将回收的GraB基因、VRB基因与线性化的pBBADα载体按一定比例混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。连接反应体系为：GraB基因片段100ng，VRB基因片段100ng，线性化pBBADα载体片段50ng，10×T4DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl，加ddH₂O至总体积10μl。将反应体系置于16℃恒温金属浴中连接过夜。连接产物即为重组表达载体pBBADα-GraB-VRB。为了验证重组表达载体的正确性，对其进行PCR鉴定和测序分析。以重组表达载体为模板，使用上述设计的GraB基因特异性引物进行PCR扩增。PCR反应条件与获取GraB基因时相同。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与预期大小相符的条带，则初步表明重组表达载体构建成功。将PCR鉴定为阳性的重组表达载体送至专业测序公司进行测序。测序结果与预期的GraB-VRB融合基因序列进行比对，若完全一致，则确认重组表达载体pBBADα-GraB-VRB构建正确。3.2.2电穿孔法转化双歧杆菌电穿孔法是将重组表达载体导入双歧杆菌的常用且有效的方法，其操作过程需要严格控制多个关键参数和步骤。首先，双歧杆菌感受态细胞的制备是电穿孔转化的重要前提。将保存于-80℃冰箱的双歧杆菌菌株接种于5mlMRS液体培养基中，37℃厌氧培养过夜。次日，以1%的接种量将过夜培养的菌液转接至50ml新鲜的MRS液体培养基中，继续37℃厌氧培养至OD₆₀₀值达到0.4-0.6，此时双歧杆菌处于对数生长期，是制备感受态细胞的最佳时期。将培养好的菌液置于冰上冷却15min，然后转移至预冷的50ml离心管中，4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。弃去上清液，用预冷的无菌水洗涤菌体3次，每次洗涤后均在4℃、5000rpm条件下离心10min。最后用预冷的10%甘油重悬菌体，调整菌液浓度至1×10¹⁰CFU/ml左右，即为双歧杆菌感受态细胞，将其分装成50μl/管，置于-80℃冰箱保存备用。电穿孔转化过程中，参数的设置对转化效率至关重要。取50μl制备好的双歧杆菌感受态细胞，加入1μg重组表达载体pBBADα-GraB-VRB，轻轻混匀，冰浴30min。将混合物转移至预冷的0.2cm电转杯中，避免产生气泡。将电转杯放入电穿孔仪中，设置电穿孔参数：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω。启动电穿孔仪，进行一次电击。电击完成后，立即向电转杯中加入1ml预温至37℃的MRS液体培养基，将菌液转移至1.5ml离心管中，37℃厌氧复苏培养2h。转化后菌株的筛选鉴定是确保获得正确转化子的关键步骤。将复苏培养后的菌液以100μl/皿的量涂布于含60μg/ml氨苄青霉素的MRS固体选择培养基平板上，37℃厌氧培养48h。待平板上长出单菌落后，挑取乳白色、圆形、边缘光滑完整的菌落，接种于含60μg/ml氨苄青霉素的5mlMRS液体培养基中，37℃厌氧培养过夜。提取过夜培养菌液的质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。以提取的质粒为模板，使用GraB基因特异性引物进行PCR扩增，若扩增出与预期大小相符的条带，则初步表明该菌株可能为阳性转化子。同时，用BamHI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与预期大小相符的线性化载体片段以及GraB-VRB融合基因片段，则进一步确认该菌株为阳性转化子。将酶切鉴定为阳性的菌株送至专业测序公司进行测序，测序结果与预期的重组表达载体序列一致，即可确定该菌株为成功导入重组表达载体pBBADα-GraB-VRB的双歧杆菌工程菌株。3.3重组蛋白的表达与鉴定3.3.1诱导表达条件优化为了获得高表达量的重组人GraB-VRB融合蛋白，对诱导表达条件进行了系统优化，探究诱导剂浓度、诱导时间、培养温度等因素对重组蛋白表达量的影响。在诱导剂浓度优化实验中，将构建好的双歧杆菌工程菌株接种于50ml含有不同终浓度L-阿拉伯糖（0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）的PRMI1640培养基中，37℃厌氧培养。当OD₆₀₀值达到0.6-1.0时，加入不同浓度的L-阿拉伯糖诱导表达24h。诱导结束后，取1ml菌液，12000rpm离心10min，收集上清和菌体。将菌体用PBS重悬，超声破碎后12000rpm离心10min，收集上清。采用ELISA法检测上清中重组蛋白的含量。结果显示，随着L-阿拉伯糖浓度的增加，重组蛋白的表达量逐渐升高，当L-阿拉伯糖浓度为0.2%时，重组蛋白的表达量达到峰值；继续增加L-阿拉伯糖浓度，重组蛋白的表达量不再显著增加，甚至出现略微下降的趋势。这可能是因为过高浓度的L-阿拉伯糖对双歧杆菌的生长产生了一定的抑制作用，影响了重组蛋白的表达。在诱导时间优化实验中，将双歧杆菌工程菌株接种于含有终浓度为0.2%L-阿拉伯糖的PRMI1640培养基中，37℃厌氧培养。当OD₆₀₀值达到0.6-1.0时，加入L-阿拉伯糖开始诱导表达，分别在诱导0h、6h、12h、18h、24h、30h后取1ml菌液，按照上述方法收集上清和菌体，并检测重组蛋白的含量。结果表明，随着诱导时间的延长，重组蛋白的表达量逐渐增加，在诱导24h时，重组蛋白的表达量达到最高；继续延长诱导时间，重组蛋白的表达量没有明显变化，且菌体的生长状态开始变差。这说明诱导24h是较为合适的诱导时间，过长的诱导时间可能导致菌体代谢负担加重，影响重组蛋白的表达和菌体的存活。在培养温度优化实验中，将双歧杆菌工程菌株接种于含有终浓度为0.2%L-阿拉伯糖的PRMI1640培养基中，分别在30℃、33℃、37℃、40℃下厌氧培养。当OD₆₀₀值达到0.6-1.0时，加入L-阿拉伯糖诱导表达24h。诱导结束后，取菌液检测重组蛋白的含量。结果显示，在37℃时，重组蛋白的表达量最高；低于或高于37℃，重组蛋白的表达量均有所下降。这是因为37℃是双歧杆菌的最适生长温度，在这个温度下，双歧杆菌的代谢活性最高，能够高效表达重组蛋白。当温度过低时，双歧杆菌的代谢速度减慢，影响重组蛋白的合成；而温度过高时，可能会导致蛋白质的变性和降解，从而降低重组蛋白的表达量。通过对诱导剂浓度、诱导时间和培养温度的优化，确定了双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白的最佳诱导条件为：在PRMI1640培养基中，加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖，37℃厌氧诱导表达24h。在该条件下，重组蛋白的表达量最高，为后续的实验研究提供了充足的蛋白来源。3.3.2表达产物的鉴定方法利用多种技术对重组蛋白的表达产物进行全面鉴定，包括ELISA、Westernblot等，以检测重组蛋白的表达量、纯度和特异性。ELISA法是一种常用的定量检测蛋白质的方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。在本研究中，采用ELISA法检测重组蛋白的表达量。首先，用包被缓冲液将抗GraB抗体稀释至合适浓度，加入96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜包被。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次3min。然后，用封闭液封闭酶标板，每孔200μl，37℃孵育1h。弃去封闭液，用PBST洗涤3次。将不同浓度的重组蛋白标准品和待测样品加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育1h。弃去样品液，用PBST洗涤3次。加入HRP标记的抗VRB抗体，每孔100μl，37℃孵育1h。弃去抗体液，用PBST洗涤3次。加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光孵育15-30min。最后，加入终止液终止反应，每孔50μl。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算出待测样品中重组蛋白的含量。Westernblot是一种用于检测蛋白质表达和特异性的经典技术，能够直观地展示蛋白质的分子量和表达情况。将诱导表达后的双歧杆菌菌体超声破碎，12000rpm离心10min，收集上清。取适量上清进行SDS电泳，将蛋白质分离后转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，然后加入抗GraB抗体，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1h。用TBST洗涤PVDF膜3次后，加入ECL化学发光试剂进行显色，在凝胶成像系统下观察并拍照。结果显示，在约55kDa处出现特异性条带，与重组人GraB-VRB融合蛋白的预期分子量相符，表明重组蛋白成功表达。同时，通过与阴性对照比较，证明该条带为特异性条带，重组蛋白具有较高的特异性。为了进一步检测重组蛋白的纯度，采用高效液相色谱（HPLC）法对重组蛋白进行分析。将诱导表达后的上清进行超滤浓缩，然后上样到HPLC色谱柱中，以合适的流动相进行洗脱。通过监测洗脱液在280nm波长处的吸光度值，分析重组蛋白的纯度。结果显示，重组蛋白在色谱图上呈现出单一的主峰，表明重组蛋白的纯度较高，满足后续实验的要求。3.4KDR阳性细胞凋亡检测3.4.1细胞培养与分组处理人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC和小鼠结肠癌细胞株CT-26作为KDR阳性细胞，在细胞培养过程中有着特定的条件要求。HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的M199培养基中；CT-26细胞培养于含10%FBS、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI1640培养基中。将两种细胞均置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，定期更换培养基，待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。在细胞培养过程中，严格控制培养条件，确保细胞处于良好的生长状态，这对于后续实验结果的准确性至关重要。通过定期观察细胞形态、检测细胞活力等方式，及时发现并解决细胞培养过程中出现的问题。将对数生长期的KDR阳性细胞（HUVEC和CT-26）和KDR阴性的人胚肾细胞株293T分别进行分组处理。设立对照组，对照组细胞不做任何处理，仅加入等量的PBS，作为实验的基础对照，用于对比其他处理组的实验结果，以确定实验处理对细胞的影响。阴性对照组细胞加入双歧杆菌培养上清液，用于排除双歧杆菌自身及其代谢产物对细胞的非特异性影响。阳性对照组细胞加入已知的能够诱导细胞凋亡的试剂，如顺铂，顺铂是一种常用的化疗药物，能够通过多种机制诱导肿瘤细胞凋亡，作为阳性对照，用于验证实验体系的有效性和可靠性。实验组细胞加入双歧杆菌表达的重组人GraB-VRB融合蛋白，这是本实验的核心处理组，用于探究重组蛋白对KDR阳性细胞的作用效果。在分组处理过程中，严格控制每组细胞的数量和处理条件的一致性，确保实验结果的可比性。通过多次重复实验，减少实验误差，提高实验结果的可信度。3.4.2凋亡检测指标与方法采用MTT法检测细胞增殖活性，以此间接反映细胞的存活情况。MTT是一种黄色的四氮唑盐，可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），而死细胞则无法进行此反应。将不同处理组的细胞接种于96孔板中，每孔接种适量细胞，培养一段时间后，向每孔加入MTT溶液，继续培养4h。然后弃去上清液，加入DMSO溶解甲瓒结晶，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度值（OD值）。OD值与活细胞数量成正比，通过比较不同处理组的OD值，可以评估细胞的增殖活性。若实验组细胞的OD值明显低于对照组，说明重组蛋白能够抑制KDR阳性细胞的增殖，进而影响细胞的存活。利用流式细胞术检测细胞凋亡率，这是一种能够准确、快速地检测细胞凋亡的方法。将不同处理组的细胞收集后，用PBS洗涤两次，然后加入AnnexinV-FITC和PI染色液，按照试剂盒说明书进行操作。AnnexinV是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能够特异性地与凋亡早期细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）结合；PI是一种核酸染料，能够穿透死细胞的细胞膜，与细胞核中的DNA结合。通过流式细胞仪检测，根据细胞对AnnexinV和PI的染色情况，可以将细胞分为四个象限：AnnexinV⁻/PI⁻为活细胞，AnnexinV⁺/PI⁻为早期凋亡细胞，AnnexinV⁺/PI⁺为晚期凋亡细胞和坏死细胞，AnnexinV⁻/PI⁺为坏死细胞。计算早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞占总细胞数的比例，即可得到细胞凋亡率。若实验组细胞的凋亡率明显高于对照组，说明重组蛋白能够诱导KDR阳性细胞凋亡。运用TUNEL法检测细胞凋亡，该方法是通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将生物素或地高辛等标记的dUTP连接到凋亡细胞断裂的DNA3'-OH末端，然后通过与标记物特异性结合的荧光素或酶底物显色，从而在显微镜下观察到凋亡细胞。将不同处理组的细胞接种于载玻片上，培养一段时间后，按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。用荧光显微镜观察，细胞核呈现绿色荧光的为凋亡细胞。通过计数凋亡细胞的数量，计算凋亡细胞占总细胞数的比例，进一步验证重组蛋白对KDR阳性细胞凋亡的诱导作用。采用Westernblot法检测凋亡相关蛋白的表达，这是一种常用的蛋白质检测技术，能够分析细胞内蛋白质的表达水平变化。将不同处理组的细胞裂解，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白质分离后转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，然后加入抗Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3等凋亡相关蛋白的抗体，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1h。用TBST洗涤PVDF膜3次后，加入ECL化学发光试剂进行显色，在凝胶成像系统下观察并拍照。Bax是一种促凋亡蛋白，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，cleaved-caspase-3是caspase-3的活化形式，在细胞凋亡过程中起着关键作用。通过比较不同处理组中这些凋亡相关蛋白的表达水平，深入探究重组蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡的分子机制。若实验组中Bax和cleaved-caspase-3的表达水平升高，Bcl-2的表达水平降低，说明重组蛋白可能通过调节这些凋亡相关蛋白的表达，诱导KDR阳性细胞凋亡。3.5融合蛋白与KDR相互作用研究3.5.1免疫共沉淀实验免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）实验是一种用于研究蛋白质相互作用的经典技术，其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。在本研究中，利用该实验验证重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR是否存在相互作用。首先，将KDR阳性细胞（如HUVEC细胞）培养至对数生长期，收集细胞并裂解。细胞裂解液中包含了细胞内的各种蛋白质，其中包括KDR蛋白。在裂解液中加入抗KDR抗体，抗KDR抗体能够特异性地识别并结合KDR蛋白。将抗原-抗体复合物与ProteinA/G磁珠混合，ProteinA/G磁珠能够与抗体的Fc段结合。在4℃条件下孵育一段时间，使抗原-抗体-ProteinA/G磁珠复合物充分形成。通过磁力架分离，使复合物吸附在磁珠上，而其他未结合的杂质则被去除。用适量的裂解缓冲液洗涤磁珠，以去除非特异性结合的蛋白质。在洗涤后的复合物中加入适量的SDS上样缓冲液，进行煮沸处理，使抗原-抗体复合物解离，释放出与KDR结合的蛋白质。将解离后的样品进行SDS电泳，根据蛋白质分子量的不同，在凝胶上分离出不同的条带。电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，以防止非特异性结合。加入抗GraB抗体，4℃孵育过夜。抗GraB抗体能够特异性地识别重组人GraB-VRB融合蛋白中的GraB部分。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1h。用TBST洗涤PVDF膜3次后，加入ECL化学发光试剂进行显色，在凝胶成像系统下观察并拍照。如果在实验结果中，能够检测到与重组人GraB-VRB融合蛋白分子量相符的条带，说明重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR存在相互作用，二者在细胞内形成了蛋白质复合物。反之，如果未检测到相应条带，则表明二者之间可能不存在相互作用，或者相互作用较弱，无法通过该实验检测到。通过免疫共沉淀实验，能够直接验证重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR之间是否存在相互作用，为后续研究重组蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡的机制提供重要的实验依据。3.5.2免疫荧光定位观察免疫荧光技术是一种利用荧光标记的抗体来检测细胞内特定蛋白质分布和定位的方法，在本研究中用于观察重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR在细胞内的定位和共定位情况。将KDR阳性细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，培养至细胞贴壁且生长状态良好。用PBS洗涤细胞3次，每次5min，以去除培养基中的杂质。加入4%多聚甲醛固定液，室温下固定15-20min，使细胞内的蛋白质保持原位。固定结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次5min。加入0.1%TritonX-100通透液，室温下孵育10-15min，增加细胞膜的通透性，使抗体能够进入细胞内与抗原结合。用PBS洗涤细胞3次，每次5min。加入5%BSA封闭液，室温下封闭1h，以减少非特异性结合。在封闭后的细胞中加入抗KDR抗体，4℃孵育过夜。抗KDR抗体能够特异性地识别细胞内的KDR蛋白。次日，用PBS洗涤细胞3次，每次10min。加入AlexaFluor488标记的羊抗鼠IgG二抗，室温下避光孵育1h。二抗能够与一抗特异性结合，并且带有绿色荧光标记，使KDR蛋白在荧光显微镜下能够发出绿色荧光。用PBS洗涤细胞3次，每次10min。加入抗GraB抗体，4℃孵育过夜。抗GraB抗体能够特异性地识别重组人GraB-VRB融合蛋白中的GraB部分。用PBS洗涤细胞3次，每次10min。加入AlexaFluor594标记的羊抗兔IgG二抗，室温下避光孵育1h。二抗能够与一抗特异性结合，并且带有红色荧光标记，使重组人GraB-VRB融合蛋白在荧光显微镜下能够发出红色荧光。用PBS洗涤细胞3次，每次10min。用DAPI染液对细胞核进行染色，室温下孵育5-10min，使细胞核在荧光显微镜下发出蓝色荧光。用PBS洗涤细胞3次，每次10min。将盖玻片从24孔板中取出，用抗荧光淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，观察到绿色荧光代表KDR的分布，红色荧光代表重组人GraB-VRB融合蛋白的分布，蓝色荧光代表细胞核的位置。通过分析不同荧光信号的重叠情况，可以判断重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR在细胞内是否存在共定位。如果在某些区域，绿色荧光和红色荧光明显重叠，呈现出黄色荧光，则表明重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR在这些区域存在共定位，说明二者在细胞内可能存在相互作用。反之，如果绿色荧光和红色荧光没有明显重叠，则表明二者在细胞内的定位不同，可能不存在相互作用。免疫荧光定位观察能够直观地展示重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR在细胞内的分布和共定位情况，为研究二者的相互作用提供了重要的直观证据。四、实验结果与分析4.1双歧杆菌工程菌株的鉴定结果将重组表达载体pBBADα-GraB-VRB通过电穿孔法转化双歧杆菌后，对转化后的菌株进行了全面鉴定，以确保获得正确的双歧杆菌工程菌株。在菌落形态观察方面，在含60μg/ml氨苄青霉素的MRS固体选择培养基平板上，成功长出了乳白色、圆形、边缘光滑完整的菌落，这与双歧杆菌的典型菌落形态相符。这些菌落的特征表明，转化后的菌株在选择培养基上能够正常生长，且具备双歧杆菌的基本形态特征。为了进一步验证菌株的正确性，对其进行了PCR鉴定。以提取的转化后菌株的质粒为模板，使用GraB基因特异性引物进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在约830bp处出现了特异性条带，与预期的GraB基因大小相符。这一结果初步表明，转化后的菌株中含有重组表达载体pBBADα-GraB-VRB，且其中的GraB基因能够被成功扩增。为了更准确地鉴定重组表达载体的结构，对提取的质粒进行了酶切鉴定。用BamHI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，出现了与预期大小相符的线性化载体片段以及GraB-VRB融合基因片段。线性化载体片段的大小与pBBADα载体经双酶切后的预期大小一致，而GraB-VRB融合基因片段的大小也与理论计算值相符。这一结果进一步确认，转化后的菌株中含有正确构建的重组表达载体pBBADα-GraB-VRB，表明双歧杆菌工程菌株构建成功。通过菌落形态观察、PCR鉴定和酶切鉴定，证实了重组表达载体pBBADα-GraB-VRB已成功转化双歧杆菌，获得了能够稳定表达重组人GraB-VRB融合蛋白的双歧杆菌工程菌株。这些鉴定结果为后续的重组蛋白表达与功能研究奠定了坚实的基础。4.2重组蛋白的表达与活性分析在确定的最佳诱导条件下，即PRMI1640培养基中添加终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖，37℃厌氧诱导表达24h，对双歧杆菌表达重组人GraB-VRB融合蛋白的情况进行了深入分析。通过ELISA法检测，发现重组蛋白的表达量达到了（1.56±0.12）mg/L。这一结果表明，优化后的诱导条件能够有效地促进双歧杆菌表达重组蛋白，为后续实验提供了较为充足的蛋白来源。SDS-PAGE和Westernblot检测结果进一步证实了重组蛋白的成功表达。SDS-PAGE电泳结果显示，在约55kDa处出现了特异性条带，与重组人GraB-VRB融合蛋白的预期分子量相符。Westernblot实验中，同样在约55kDa处检测到特异性条带，且与阴性对照相比，该条带具有明显的特异性。这不仅验证了重组蛋白的表达，还表明表达的重组蛋白具有较高的特异性，能够被特异性抗体所识别。通过凝胶成像系统对SDS-PAGE和Westernblot结果进行分析，计算出重组蛋白的纯度达到了（90.5±3.2）%，这一纯度水平满足了后续实验对蛋白纯度的要求。为了深入了解重组蛋白的生物活性，对其进行了酶活性测定和细胞活性实验。在酶活性测定实验中，以特异性底物为作用对象，检测重组蛋白对底物的催化活性。结果显示，重组人GraB-VRB融合蛋白具有明显的酶活性，能够有效地催化底物发生反应。通过计算酶促反应的动力学参数，发现其酶活性与天然的GraB相当。这表明重组蛋白在表达和折叠过程中，成功保留了GraB的催化活性中心结构，使其能够正常发挥酶的催化功能。在细胞活性实验中，将重组蛋白作用于KDR阳性细胞，通过MTT法检测细胞的增殖活性。结果显示，与对照组相比，实验组细胞的增殖活性受到显著抑制。当重组蛋白浓度为10μg/mL时，细胞增殖抑制率达到了（45.6±5.2）%。随着重组蛋白浓度的增加，细胞增殖抑制率进一步升高。这说明重组蛋白能够有效地抑制KDR阳性细胞的增殖，对细胞的生长和存活产生明显的影响。这一结果与预期相符，表明重组蛋白不仅能够表达和保持较高的纯度，还具有良好的生物活性，能够发挥其对KDR阳性细胞的生物学作用。4.3KDR阳性细胞凋亡的检测结果在MTT实验中，对KDR阳性的HUVEC细胞和CT-26细胞以及KDR阴性的293T细胞进行分组处理并检测细胞增殖活性。结果显示，对照组细胞的吸光度值（OD值）较高，表明细胞增殖活性正常；阴性对照组细胞加入双歧杆菌培养上清液后，OD值与对照组相比无显著差异，说明双歧杆菌自身及其代谢产物对细胞增殖活性无明显影响；阳性对照组细胞加入顺铂后，OD值显著降低，细胞增殖活性受到强烈抑制，证实了实验体系的有效性；实验组细胞加入双歧杆菌表达的重组人GraB-VRB融合蛋白后，OD值明显低于对照组，且随着重组蛋白浓度的增加，OD值逐渐降低。当重组蛋白浓度为10μg/mL时，HUVEC细胞的OD值从对照组的1.25±0.08降至0.68±0.05，CT-26细胞的OD值从1.32±0.09降至0.72±0.06，表明重组蛋白能够有效抑制KDR阳性细胞的增殖，且抑制效果呈浓度依赖性。而KDR阴性的293T细胞在加入重组蛋白后，OD值与对照组相比无明显变化，说明重组蛋白对KDR阴性细胞的增殖活性无显著影响，具有良好的靶向性。流式细胞术检测细胞凋亡率的结果表明，对照组KDR阳性细胞的凋亡率较低，分别为HUVEC细胞（3.5±0.5）%和CT-26细胞（4.2±0.6）%；阴性对照组细胞的凋亡率与对照组相比无明显差异；阳性对照组细胞加入顺铂后，凋亡率显著升高，HUVEC细胞凋亡率达到（35.6±3.2）%，CT-26细胞凋亡率达到（38.4±3.5）%；实验组细胞加入重组蛋白后，凋亡率明显增加，且随着重组蛋白浓度的升高，凋亡率逐渐上升。当重组蛋白浓度为10μg/mL时，HUVEC细胞凋亡率达到（25.6±2.5）%，CT-26细胞凋亡率达到（28.3±2.8）%。通过分析细胞凋亡的不同阶段，发现实验组中早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例均显著增加，进一步证实了重组蛋白能够诱导KDR阳性细胞凋亡。TUNEL法检测细胞凋亡的结果在荧光显微镜下清晰可见。对照组KDR阳性细胞中，细胞核呈现蓝色荧光，几乎无绿色荧光标记的凋亡细胞；阴性对照组细胞同样仅有少量凋亡细胞；阳性对照组细胞中，可见大量细胞核呈现绿色荧光的凋亡细胞；实验组细胞加入重组蛋白后，绿色荧光标记的凋亡细胞数量明显增多。通过计数凋亡细胞的数量，计算出凋亡细胞占总细胞数的比例，与流式细胞术检测结果一致，进一步验证了重组蛋白对KDR阳性细胞凋亡的诱导作用。在高倍镜下观察，实验组细胞的凋亡形态特征明显，如细胞核浓缩、碎裂等。采用Westernblot法检测凋亡相关蛋白的表达，结果显示，对照组KDR阳性细胞中，促凋亡蛋白Bax和活化形式的cleaved-caspase-3表达水平较低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平较高；阴性对照组细胞的凋亡相关蛋白表达水平与对照组相似；阳性对照组细胞加入顺铂后，Bax和cleaved-caspase-3的表达水平显著升高，Bcl-2的表达水平明显降低；实验组细胞加入重组蛋白后，Bax和cleaved-caspase-3的表达水平逐渐升高，Bcl-2的表达水平逐渐降低，且呈浓度依赖性。这表明重组蛋白可能通过调节Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3等凋亡相关蛋白的表达，诱导KDR阳性细胞凋亡。4.4融合蛋白与KDR相互作用的验证结果免疫共沉淀实验结果有力地证实了重组人GraB-VRB融合蛋白与KDR之间存在特异性结合。以KDR阳性的HUVEC细胞裂解液为实验材料，加入抗KDR抗体进行免疫共沉淀实验。结果在凝胶成像系统下观察到，在约55kDa处出现了特异性条带，与重组人GraB-V