CN120204412A 工程化外来体的组合物和负载腔外来体有效负载物的方法（隆萨销售股份公司）

(10)申请公布号CN120204412A(21)申请号202510155021.9(22)申请日2018.11.16(30)优先权数据62/587,7672017.11.17US62/634,7502018.02.23US(62)分案原申请数据201880072250.22018.(71)申请人隆萨销售股份公司道格拉斯·E·威廉姆斯A61K47/42(2017.01)(54)发明名称工程化外来体的组合物和负载腔外来体有效负载物的方法(57)摘要本发明涉及使用新鉴定为在外来体腔中富集的蛋白质制备治疗性外来体的方法。具体地，本发明提供将治疗性肽或蛋白质定位在外来体中的方法。所述方法涉及产生腔工程化外来体，所述腔工程化外来体包含浓度较高的外来体蛋21.一种包含靶蛋白的外来体，其中所述靶蛋白的至少一部分由外源序列表达，并且所2.如权利要求1所述的外来体，其中所述靶蛋白以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述外来体中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。3.如权利要求2所述的外来体，其中所述常规外来体蛋白选自由以下组成的组：CD9、4.如权利要求1-3中任一项所述的外来体，其中所述外来体由被遗传修饰成包含所述外源序列的细胞产生。5.如权利要求4所述的外来体，其中所述细胞包含含所述外源序列的质粒。6.如权利要求4所述的外来体，其中所述细胞包含插入到所述细胞的基因组中的所述外源序列。7.如权利要求6所述的外来体，其中所述外源序列被插入到位于相对于编码MARCKS、BASP1或其片段和治疗性化合物的融合蛋白。10.如权利要求9所述的外来体，其中所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、11.如权利要求1-10中任一项所述的外来体，其进一步包含第二靶蛋白，其中所述第二12.如权利要求1-10中任一项所述的外来体，其进一步包含第二靶蛋白，其中所述第二13.如权利要求1-10中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白包含(M)(G)(G/A/S)(K/14.如权利要求13所述的外来体，其中所述靶蛋白包含SEQIDNO:4-110中的任一种的16.一种药物组合物，其包含如权利要求1-15中任一项所述的外来体和赋形剂。17.如权利要求16所述的药物组合物，其基本上不含大分子，其中所述大分子选自核18.一种细胞群，其用于产生如权利要求1-15中任一项所述的外来体。19.一种用于修饰外来体的多肽，其包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118);(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+),其中每个括号内位自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是3(+)也不是(Asp或Glu);或(ii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每个括号内位的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。20.如权利要求19所述的多肽，其包含SEQIDNO:4-110中的任一种的序列。NO:116)。22.如权利要求19-21中任一项所述的多肽，其中所述多肽与货物肽融合。23.一种多肽构建体，其包含编码如权利要求19-22中任一项所述的多肽的编码序列。24.如权利要求23所述的多肽构建体，其中所述编码序列是经密码子优化的。25.一种制备工程化外来体的方法，其包括以下步骤：a.向细胞中引入编码融合多肽的核酸构建体，所述融合多肽包含(i)编码MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物的第一序列，和(ii)编码货物肽的第二序列；b.将所述细胞维持在允许所述细胞表达所述融合多肽的条件下；以及c.从所述细胞获得包含所述融合多肽的所述工程化外来体。26.如权利要求25所述的方法，其中所述第一序列包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(ii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每个括号内位置表示氨何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述第一序列包含SEQIDNO:4-110中的任一种。429.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述工程化外来体的腔中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。30.如权利要求29所述的方法，其中所述融合多肽以比所述不同外来体中的所述不同靶蛋白高超过2倍的密度存在。5[0003]本申请要求2017年11月17日提交的美国临时专利申请62/587,767和2018年2月23[0005]本申请包括按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。2018年11月15日创建的所述ASC含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1短序列已显示足以将荧光蛋白货物分子的高效负载引导至与全长BASP1蛋白相同的程度。实施方案涉及通过使外来体蛋白或蛋白质片段与治疗相关蛋白质缀合来产生融合蛋白并6且在外来体腔中产生含有融合蛋白的外来体。治疗相关蛋白的天然全长蛋白或生物活性片段可以通过与富集外来体的蛋白质或蛋白质片段缀合而被运输到外来体腔中。[0010]本发明进一步涉及产生或使用腔工程化外来体，该腔工程化外来体被设计成用于在外来体腔中更有效地负载、或用于负载治疗相关蛋白。例如，外来体腔可以经修饰以在腔中含有更高浓度的天然全长外来体蛋白和/或天然外来体蛋白的片段或修饰物的蛋白质。[0011]本发明的一些实施方案涉及一种用于生产这种腔工程化外来体的生产细胞或一种产生所述生产细胞的方法。外源多核苷酸可以被暂时或稳定地引入生产细胞中，以由生产细胞产生表面工程化外来体。[0012]因此，在一个方面，本发明提供一种包含靶蛋白的外来体，其中所述靶蛋白的至少[0013]在一些实施方案中，所述靶蛋白以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述外来体中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。在一些实施方案中，[0014]在一些实施方案中，外来体由被遗传修饰以包含所述外源序列的细胞产生，任选地其中所述细胞是HEK293细胞。[0015]在一些实施方案中，所述细胞包含含有外源序列的质粒。BASP1的基因组序列的3'或5'的基因组位点中。在一些实施方案中，所述外源序列被插入到性肽的融合蛋白。[0018]在一些实施方案中，治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头。在一些实施方案中，所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷实施方案中，治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰物。[0019]在一些实施方案中，外来体进一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。在一些实施方案中，外来体进一步包含第二靶蛋白，其白或其片段。[0020]在一些实施方案中，所述靶蛋白包含(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118)的肽。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含(M)7的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。[0021]在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQIDNO:4-110中的任一种的肽。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含MGXKLSKKK的肽，其中X是任何氨基酸(SEQIDNO:116)。在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQIDNO:110的肽。在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQIDNO:13的[0022]在一些实施方案中，靶蛋白进一步包含货物肽。[0023]在另一个方面，本发明提供一种包含外来体和赋形剂的药物组合物。[0024]在一些实施方案中，药物组合物基本上不含大分子，其中所述大分子选自核酸、外源蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物及其组合。[0025]在又一个方面，本发明提供一种产生本文提供的外来体的细胞群。[0026]在一些实施方案中，细胞群包含编码靶蛋白的外源序列，所述靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。在一些实施方案中，细胞群进一步包含编码第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。在一些实施方案中，细胞群进一步包含编码第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶序列中，其中所述外源序列和所述基因组序列编码所述靶蛋白。在一些实施方案中，外源序列是在质粒中。[0028]在一些实施方式中，外源序列编码治疗性肽。在一些实施方案中，治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头。在一些实施方案中，所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。在一些实施方案中，治疗性肽是抗体或其片段或修饰物。在一些实施方案中，治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰物。在一些实施方案中，治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰物。[0029]在一些实施方案中，外源序列编码靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分对器官、组织或细胞具有特异性。[0030]在一些实施方案中，第二靶蛋白进一步包含靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分对器官、组织或细胞具有特异性。[0031]在一个方面，本发明提供一种用于修饰外来体的多肽，其包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118);(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+),其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，①是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的基酸，①是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选8自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是[0032]在一些实施方案中，多肽包含SEQIDNO:4-110中的任一种的序列。在一些实施方[0033]在一些实施方案中，多肽与货物肽融合。在一些实施方案中，多肽与所述货物肽的N末端融合。[0034]在一个方面，本发明提供一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体包含编码本文提供的多肽的编码序列。在一些实施方案中，编码序列经密码子优化。[0035]在另一个方面中，本发明提供一种制备工程化外来体的方法，其包括以下步骤：a.BASP1或其片段或修饰物的第一序列，和(ii)编码货物肽的第二序列；b.将所述细胞维持在允许所述细胞表达所述融合多肽的条件下；和c.从所述细胞获得包含所述融合多肽的工程化外来体。[0036]在一些实施方案中，第一序列包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQIDNO:118);(ii)M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+),其中每个括号内位自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu);或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+),其中每个括号内位的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。[0037]在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO:4-110中的任一种的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO:13的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQID[0038]在一些实施方案中，融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述工程化外来体的腔中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。在一些实施方案中，融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白高超过2倍的密度存在。在一些实施方案中，融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白高超过4倍、16倍、100倍、或10,000倍的密度存在。附图说明[0039]附图仅出于说明的目的描绘了本发明的各种实施方案。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到，在不脱离本文所述的本发明的原理的情况下，可以采用本文示出的结构和方法的可替代实施方案。[0040]图1提供了超速离心后含样品的Optiprep密度梯度的图像。标有括号的是含有外9[0041]图2是示出从Optiprep超速离心的顶部级分鉴定的蛋白质(Y轴)和从底部级分鉴定的蛋白质(X轴)的点图。虚线上方绘制的蛋白质代表外来体富集的蛋白质(包括MARCKS、MARCHSL1和BASP1),而虚线下方的蛋白质代表非特异于外来体的蛋白质。[0045]图6A示出了从HEK293细胞收集的总细胞裂解物(左侧)和纯化外来体群体(右侧)的蛋白质印迹图片。图6A中提供的凝胶的蛋白质印迹显示，MARCK和BASP1(图6D)位于纯化外来体中，并且在总细胞裂解物中未检测到，或者与外来体相比以显著较低的水平在细胞裂解物中检测到。[0046]图7示出了纯化外来体的荧光强度，所述纯化外来体含有与含有氨基酸1-30、CD81或pDisplay的MARCKS片段融合的GFP。[0048]图9示出了纯化外来体的荧光强度，所述纯化外来体含有与全长BASP1、含有氨基酸1-30、CD81或pDisplay的BASP1片段融合的GFP。[0049]图10示出了用于确定足以负载外来体的最小BASP1N末端序列的融合蛋白的示意[0050]图11示出了来自纳米流式细胞术的图，该纳米流式细胞术测量经工程化以表达与GFP融合的BASP1片段的外来体的荧光信号。x轴根据分配给如图10中提供的各种融合蛋白的数字编号。[0051]图12示出了经染色蛋白凝胶的图片，其指示负载有与GFP融合的BASP1片段的外来体的相等负载。虚线箭头指示BASP1融合蛋白的迁移位置。泳道根据分配给如图10中提供的各种融合蛋白的数字编号。[0052]图13示出了用考马斯蓝染色以标记总蛋白的蛋白凝胶的图片。虚线箭头指示BASP1融合蛋白的迁移位置。泳道用分配给如图10中提供的各种融合蛋白的数字标记。[0053]图14示出了来自纯化外来体的抗FLAG蛋白印迹的图片，所述纯化外来体含有与[0054]图15示出了来自纯化外来体的抗Alix蛋白印迹的图片，所述纯化外来体含有与FLAG和GFP融合的BASP1片段，从而证实相等的蛋白质负载。泳道根据图10中所示的蛋白质序列编号。[0055]图16A示出了包含与FLAG标签和GFP融合的BASP1片段的融合蛋白的序列(按出现顺序分别为SEQIDNO135-142)。图16B示出了从稳定表达图16A中的融合蛋白之一的细胞[0056]图17A示出了来自与FLAG标签和GFP融修饰物(1-30-S6D、1-30-S6A和1-30-L5Q)的序列(按出现顺序分别为SEQIDNO143-145)。图17B示出了从稳定表达图17A中的融合蛋白之一的细胞中纯化外来体的抗FLAG蛋白质印迹结果。[0057]图18示出了考马斯染色的蛋白凝胶的图像，其中外来体样品从稳定表达均与中纯化。图像上的黑色箭头指示对应于融合蛋白的带。[0058]图19示出了BASP1的前28个氨基酸(保守区1)、MARCKS的氨基酸1-7和152-173(保守区2)以及MARCKSL1的氨基酸1-7和87-110(保守区3)之间的蛋白质序列比对。[0059]图20A示出了BASP1的氨基酸1-30(“BASP1-30”)(SEQIDNO或其修饰物的PSD结构域融合的MARCKS或其修饰物的氨基酸1-3的融合蛋白("MARCKS-MG-稳定表达包含图20A的氨基酸序列和FLAG的融合蛋白的细胞的纯化外来体的抗FLAG蛋白质印迹结果。用于将货物负载到外来体腔中的每个序列的氨基酸需求(SEQIDNO:118)。[0061]图22A示出了天然外来体或从稳定表达与BASP1的氨基酸1-10或1-30融合的Cas9的细胞中纯化外来体的总蛋白(顶部)和抗Cas9蛋白质印迹(底部),以及减少量的重组Cas9。图22B(顶部)示出了源自图22A的蛋白质印迹结果的Cas9光密度测定法的标准曲线。图22B(底部)进一步提供了基于标准曲线估算的，每个纯化外来体负载的作为与BASP1的1-30氨基酸或1-10氨基酸片段缀合的融合蛋白的Cas9量。[0062]图23A示出了从用表达BASP1N末端(氨基酸1-10)与卵清蛋白的融合体("“BASP1(1-10)-OVA”)的构建体稳定转染的细胞或用两种构建体稳定转染的细胞中纯化外来体的蛋白凝胶图像，所述两种构建体一种表达BASP1N末端(氨基酸1-10)与卵清蛋白的融合体，并且另一种表达与跨膜蛋白PTGFRN融合的CD40L(“BASP1(1-10)-0VA;3XCD40L-PTGFRN”)。图23A进一步示出了负载减少量的重组0VA的蛋白凝胶的图像。图23B示出了来自图23A的样品的抗卵清蛋白蛋白质印迹结果。[0063]图24A示出了针对与BASP1的氨基酸1-10和FLAG标签融合的GFP的骆驼纳米抗体的序列(SEQIDNO:150)。图24B示出了来自稳定表达图24A的融合蛋白("BASP1(1-10)-纳米蛋白质印迹结果。[0064]图25示出了外来体mRNA负载体系的示意图，该负载体系包含(i)与FLAG和单体或NO:112)、2XMCP(V29I)(“819”;SEQIDNO:113)或2XMCP(V29I/N55K))(“821”;SEQIDNO:[0065]图26A示出了外来体的蛋白凝胶，所述外来体含有图25中所述的mRNA负载构建体、[0066]图27A示出了含有图25中所示的mRNA负载构建体的细胞(顶部)或外来体(底部)中萤光素酶mRNA的量的RT-qPCR结果。图27B示出了定量来自图27A中的样品的纯化外来体中11中的跨膜蛋白的外表面展示的CD40L三聚体的示意图。[0068]图29A示出了在与CD40L表面表达外来体一起孵育的培养物中小鼠B细胞活化的结表达外来体一起孵育的培养物中人B细胞活化的结果，所述外来体与MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N末端片段融合。图29C示出了当与MARCKS、MARCKSL1、BASP1或全长PTGFRN的N末端序列融合时，不同CD40L表面展示外来体的相对效力的图表。231,乳腺；Raji,淋巴母细胞；间充质干细胞(MSC),骨髓)的各种细胞系纯化外来体中的腔[0070]图31示出了单独的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来源的外来体，或来自过表达与FLAG-GFP融合的BASP1或BASP1N末端片段(1-30或1-8)的细胞的外来体的蛋白凝胶(左侧)和抗FLAG蛋白质印迹(右侧)。具体实施方式[0072]除非另外定义，否则本文所使用的所有技术性和科学性术语具有本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予其的含义。间的膜。细胞外囊泡包括所有膜结合囊泡，其直径小于其来源细胞的直径。通常，细胞外囊泡的直径范围为20nm至1000nm,并且可以包含在内部空间内、显示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨越膜的各种大分子有效负载物。所述有效负载物可以包括核酸、蛋白质、碳水化过直接或间接操作(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)从细胞衍生的囊泡、囊泡细胞器和活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可以源自活的或死的生物体、移植的组织或器官和/或培养的细胞。[0074]如本文所用，术语“外来体”是指细胞衍生的小(直径在40-200nm之间)囊泡，其包括封闭内部空间的膜，并且由所述细胞通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜融合而产生。外来体是细胞外囊泡的一种。外来体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载物(例如治疗剂)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸(例如基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。[0075]如本文所用，术语“纳米囊泡”是指细胞衍生的小(直径在20-250nm径在30-150nm之间)囊泡，其包括封闭内部空间的膜，并且通过直接或间接操作由所述细胞产生，使得在没有所述操作的情况下所述生产细胞将不产生所述纳米囊泡。所述生产细胞的适当操作包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声波处理或其组合。在一些情况下，纳米囊泡的产生可能导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡的群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合从生产细胞衍生的囊泡。纳米囊泡包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载物(例如治疗剂)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸细胞衍生出纳米囊泡，就可以基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离出纳米囊泡。[0076]如本文所用，术语“腔工程化外来体”是指内部腔空间的组成被修饰的外来体。例生物方法改变，或者通过由先前通过化学、物理或生物方法修饰的细胞产生来改变。具体地，所述组成可以通过基因工程改变，或者通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生来改[0077]如本文所用，术语蛋白质的“修饰物”是指对蛋白质的非突变氨基酸序列具有至少15%同一性的蛋白质。蛋白质的修饰物包括蛋白质的片段或变体。蛋白质的修饰进一步可以包括对蛋白质的片段或变体的化学或物理修饰。[0078]如本文所用，术语蛋白质的“片段”是指与天然存在的蛋白质相比在N和/或C末端缺失的蛋白质。优选地，MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段保留特异性靶向外来体腔的能力。这种片段也被称为“功能片段”。片段是否是所述意义上的功能片段可以通过任何本领域已知的方法来评估，以确定外来体的蛋白质含量，所述方法包括蛋白质印迹、FACS分析和片段与自体荧光蛋白质例如像GFP的融合。在一个特定的实施方案中，MARCKS、MARCKSL1、或BASP1的片段保留了天然存在的MARCKS、MARCKSL1、或BASP1特异性地靶向外来体的能力的至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一个特定的实施方案中，MARCKS、MARCKSL1、特异性地靶向外来体腔的能力的至少70%、80%、85%、90%、95%或99%。这种能力可以例如通过荧光标记的变体，在实验部分中所述的测定中评估。[0079]如本文所用，术语蛋白质的“变体”是指通过本领域已知的方法比对后与另一蛋白质共享特定氨基酸序列同一性的蛋白质。蛋白质的变体可以包括另一种蛋白质中的取代、MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段具有至少70%同一性的变体。在一些实施方案中，MARCKS的变体或片段变体与根据SEQIDNO:1的MARCKS或与其功能片段共享至少70%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。在一些实施方案中，MARCKSL1的变体或片段变体与根据SEQIDNO:2的MARCKSL1或与其功能片段共享至少70%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。在一些实施方案中，BASP1的变体或片段变体与根据SEQIDNO:3的BASP1或与其功能片段共享至少70%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。在上述每种情况下，优选变体或片段变体保留特异性地靶向外来体腔的能力。[0080]用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981);Needleman和Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970);Meth.Mol.Biol.24:307-31人，J.Mol.Biol.215:403-10(1990)J可来自若干来源，包括国家生物信息中心(NBC1,Bethesda,Md.)和在因特网上获得以与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx关联使用。BLAST和如何使用所述程序确定序列同一性的描述可以在NIH(国家卫生研究院)下属的NCBI(国家生物技术信息中心)官方网站上访问。[0081]本文提供的任何蛋白质的叙述涵盖蛋白质的功能变体。术语蛋白质的“功能变体”是指蛋白质的变体，其保留了特异性地靶向外来体腔的能力。在一个特定的实施方案中，特异性地靶向外来体腔的能力的至少70%、80%、85%、90%、95%或99%。[0082]如本文所用，术语“生产细胞”是指用于产生外来体的细胞。生产细胞可以是体外培养的细胞，或者体内的细胞。生产细胞包括但不限于已知能有效产生外来体的细胞，例如HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和间充质干细胞(MSC)。白或肽可以是天然地靶向外来体腔的非突变蛋白，或者所述非突变蛋白的片段或修饰物。靶蛋白可以是融合蛋白，其含有flag标签、治疗性肽、靶向部分、或附着到所述非突变蛋白的其他肽，或所述非突变蛋白的修饰物或片段。靶蛋白可以包含修饰，如肉豆蔻酰化、异戊二烯化或棕榈酰化，或通过接头附着到膜内部小叶的可溶性蛋白。体中的任何蛋白质或肽，或其片段或修饰物。货物蛋白或肽可以包括作用于与外来体接触的靶标(例如靶细胞)的治疗性肽或蛋白。货物蛋白可以是融合蛋白，其包含如上所述的靶蛋白或肽或其片段或修饰物，使得货物融合蛋白可以靶向外来体腔。括未被封闭在外来体中且未附着或结合到外来体膜中的蛋白质。取(extracting)”可互换使用，并且是指已经经历一个或多个纯化过程(例如选择或富集期望的外来体制剂)的期望EV的制剂状态(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)。在一些实施方案中，如本文所用的分离或纯化是从含有生产细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)外来体的过程。在一些实施方案中，分离的外来体组合物没有可检测的不期望活性，或者可替代地，不期望活性的水平或量等于或低于可接受的水平或量。在其他实施方案中，分离的外来体组合物具有的所期望外来体的量和/或浓度等于或高于可接受的量和/或浓度。在其他实施方案中，与获得所述组合物的起始材料(例如，生产细胞制剂)相比，分离的外来体组合物富集。与起始材料相比，这种富集可以是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、99.999%、或大于99.9999%。在一些实施方案中，分离的外来体制剂基本上不含残留的生物产品。在一些实施方案中，分离的外来体制剂100%不含、99%不含、98%不含、97%不含、96%不含、95%不含、94%不含、93%不含、92%不含、91%不含或90%不含任何污染性生物物质。残留的生物产品可能包括非生物物质(包括化学物质)或不需要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。基本上不含残留生物产物还意指外来体组合物不含可检测的生产细胞，并且仅外来体是可检测[0087]术语“赋形剂”或“载体”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物施用的惰构批准的或美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何药剂，以及不会对受试者造成显著刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和特性的任何载体或稀释剂。包括赋形剂和载[0088]如本文所用，术语“有效负载物”是指作用于与EV接触的靶标(例如靶细胞)的治疗剂。可以被引入外来体和/或生产细胞中的有效负载物包括治疗剂，如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽如酶的DNA或mRNA分子，或具有调节功能的RNA分子如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA)、氨基酸(例如，包含可检测部分或相关病毒和病毒颗粒、逆转录病毒、腺病毒等)和小分子(例如，小分子药物和毒素，包括小等)。治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，具体是人。本文所述的方法适用于人疗法和兽医学应[0091]如本文所用，术语“基本上不含”意指包含外来体的样品包含质量/体积(m/v)百分比浓度小于10%的大分子。一些级分可能含有小于0.001%、小于0.01%、小于0.05%、小于于9%或小于10%(m/v)的大分子。合。[0093]如本文所用，术语“常规外来体蛋白”意指先前已知在外来体中富集的蛋白质，包白或其片段或变体不是常规的外来体蛋白。[0094]其他解释惯例[0095]本文列举的范围应理解为所述范围内的所有值(包括所列举的端点值)的速记法。[0096]除非另外指明，否则提及具有一个或多个立构中心的化合物是指每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。[0097]外来体蛋白[0098]本发明的一些实施方案涉及外来体蛋白的鉴定、使用和修饰，所述外来体蛋白在外来体腔中高度富集。此类外来体蛋白可以通过用质谱或本领域已知的其他方法分析高度纯化外来体来鉴定。[0099]所述蛋白质包括富集在外来体膜上的各种腔蛋白或膜蛋白，如跨膜蛋白、整合蛋白和外周蛋白。具体地，所述蛋白质包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1);和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。[0100]根据生产细胞、生产条件、纯化方法或外来体的预期应用，可以选择性地使用本文鉴定的一种或多种外来体蛋白。可以鉴定富集在具有特定大小范围、靶向部分、电荷密度、有效负载物等的某些外来体腔中的外来体蛋白，并且将其用于本发明的一些实施方案中。在一些实施方案中，可以同时或随后使用多于一种的外来体蛋白来产生和分离治疗性外来[0101]腔工程化外来体[0102]本发明的另一方面涉及腔工程化外来体的产生和使用。腔工程化外来体具有其组成被修饰的内部空间。例如，可以通过改变腔的蛋白质、脂质或聚糖含量来修饰腔的组成。[0103]在一些实施方案中，腔工程化外来体通过化学和/或物理方法(如PEG诱导的融合和/或超声波融合)产生。[0104]在其他实施方案中，腔工程化外来体由基因工程产生。由遗传修饰的生产细胞或遗传修饰细胞的后代产生的外来体可以含有修饰的腔组合物。在一些实施方案中，腔工程化外来体具有较高或较低密度的外来体蛋白，或者包括外来体蛋白的修饰物或片段。[0105]例如，腔工程化外来体可以由用编码外来体蛋白或外来体蛋白修饰物或片段的外源序列转化的细胞产生。包括由外源序列表达的蛋白质的外来体可以包括修饰的腔蛋白组[0106]外来体蛋白的各种修饰物或片段可以用于本发明的实施方案。例如，可以使用被修饰以更有效地靶向外来体腔的蛋白质。还可以使用被修饰以包含特异性且有效靶向外来体腔所需的最小片段的蛋白质。[0107]还可以使用具有治疗活性的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其修饰物，特别是其片段或变体，以及治疗性肽或货物蛋白或肽。在一些[0108]治疗性肽选自由天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头组成的组。治疗微生物肽、转录因子或其片段或修饰物。融合蛋白可以在外来体腔中呈现，并为外来体提供治疗活性。[0109]在一些实施方案中，治疗性肽是基因组编辑复合物的组分。在一些实施方案中，所述基因组编辑复合物是转录激活子样效应因子核酸酶(TAL-效应子核酸酶或TALEN);锌指复合物、CRISPR/CasY或CasX复合物、或本领域已知的任领域已知的任何其他适当的基因组编辑复合物或其任何组合。[0110]在一些实施方案中，治疗性肽是跨膜肽。本文所述的跨膜肽可以表达为与本文所述的任何序列或其任何片段或变体的融合蛋白。在一些实施方案中，跨膜蛋白具有与外来体腔中的腔序列融合的第一末端，和在外来体表面上表达的第二末端。在一些实施方案中，段或变体。[0111]在一些实施方案中，治疗性肽是核酸结合蛋白。在一些实施方案中，核酸结合蛋白白另外地包含一种或多种RNA或DNA分子。在一些实施方案中，所述一种或多种RNA是miRNA、[0112]在一些实施方案中，治疗性肽是蛋白质-蛋白质相互作用系统的一部分。在一些实施方案中，蛋白质-蛋白质相互作用系统包括FRB-FKBP相互作用系统，例如，如Banaszynski等人，JAmChemSoc.2005年4月6日；127(13):4715-21中所述的FRB-FKBP相互作用系统。[0113]融合蛋白可以靶向外来体腔，并且为外来体提供治疗活性。[0114]在一些实施方案中，使用了具有靶向部分的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、或其片段或修饰物、以及靶向部分。靶向部分可以用于将外来体靶向特定器官、组织或细胞，以使用外来体进行治疗。在一些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。抗体及其抗原结合片段包括全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、其片段，并且进一步包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、鼠-人抗体、鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，例如像scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'和F(ab’)₂、F(ab1)₂、Fv、dAb和Fd片段、双抗体和抗体相关多肽。抗体及其抗原结合片段也包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所期望的生物活性或功能。[0115]在一些实施方案中，使用了包含病毒蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含病毒衣壳或包膜蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白允许组装保留在外来体腔中的完整病毒。种、或其修饰物，特别是其片段或变体的融合蛋白相比，或与包含常规外来体蛋白的融合蛋片段或变体的融合蛋白，导致融合蛋白在外来体中富集。在一些实施方案中，包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQIDNO:4-109中的任一种或其片段或修饰物的融合蛋白包含具有序列MGXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其他氨基酸(SEQIDNO:117);或具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，①是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，常规外来体蛋白选自由CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、IDNO:4-109中的任一种或其片段或修饰物的融合蛋白在外来体中的富集比缺少MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQIDNO:4-109中的任一种或其片段或修饰物的融合蛋白，或比包含常规外来体蛋白的融合蛋白高>2倍、>4倍、>8倍、>16倍、>25倍、>50倍、>100倍、>200倍、>500倍、>750倍、>1,000倍、>2,000倍、>5,000倍、>7,500倍、>10,000倍。在一些实施方IDNO:1-109中任一种的蛋白质序列足以用融合蛋白负载外来体。[0117]在一些实施方案中，包含含有外源序列和本文新鉴定的外来体腔蛋白的融合蛋白的腔工程化外来体比包含与本领域已知的常规外来体蛋白(例如CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、其片段或与其结合的肽)缀合的外源序列的相似工程化外来体具有更高的融合蛋白密度。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白类似修饰的其他外来体腔中的融合蛋白相比，所述含有本文新鉴定的外来体蛋白的融合蛋白在外来中，与使用常规外来体蛋白类似修饰的其他外来体腔中的融合蛋白相比，所述含有本文新鉴定的外来体蛋白的融合蛋白在外来体腔中以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。[0118]在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体相比，包含800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2类似修饰的外64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规蛋白类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的外来体相比，包含800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、LAMP2B类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋与使用常规蛋白类似修饰的外来体相比，包含M方案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片的密度存在。[0120]在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、度存在。在一些实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相比，包含800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2类似修饰的外来体相比，400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2B类似修饰的外来体200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规蛋白类似修饰的100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白[0121]在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一种、其变更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰施方案中，与使用LAMP2类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一种、其变更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2B类似修饰的外来体相比，包含SEQID100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规蛋白类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含SEQIDNO:1-109中的任1,000倍或更高的密度存在。[0122]在一些实施方案中，与本领域已知的腔工程化外来体相比，本文所述的腔工程化外来体展现出优异的特征。例如，通过使用本文提供的新鉴定的外来体蛋白产生的腔工程化外来体与现有技术中的外来体(例如使用常规外来体蛋白产生的那些外来体)相比，在其腔中含有更高度富集的修饰蛋白质。此外，与本领域已知的腔工程化外来体相比，本发明的腔工程化外来体可以具有更大、更特异或更可控的生物活性。例如，包含与本文所述外来体蛋白或其片段(例如BASP1或其片段)融合的治疗性或生物学相关外源序列的腔工程化外来体可以比与本领域已知的支架融合具有更多期望的工程化特征。本领域已知的支架蛋白包板衍生生长因子受体(PDGFR)、GPI锚蛋白、乳凝集素及其片段，以及对这些蛋白质或其片段ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体不是常规的外来体蛋白。先前，外源蛋白的过表达依赖于外源蛋白在外来体中的随机或随意分布来产生腔工程化外来体。这导致外来体中外源蛋白的低水平、不可预测的密度。因此，本文所述的外来体蛋白及其片段在新的外来体组合物及其制备方法方面提供了重要的进展。肽。附加肽可以附着到外来体蛋白或其片段或变体的N末端或C末端。或变体以及两个附加肽。这两个附加肽可以附着到外来体蛋白或其片段或变体的N末端或C末端。在一些实施方案中，两个附加肽中的一个附着到外来体蛋白或其片段或变体的N末端，并且两个附加肽中的另一个附着到C末端。[0125]在一些实施方案中，本文所述的产生腔工程化细胞外囊泡的组合物和方法包含纳米囊泡。[0126]用于生产腔工程化外来体的生产细胞[0127]本发明的外来体可以由体外生长的细胞或受试者的体液产生。当外来体由体外细的腔工程化外来体的其他细胞类型包括但不限于间充质干细胞、T细胞、B细胞、树突状细[0128]可以对生产细胞进行遗传修饰，使其包含一个或多个外源序列，以产生腔工程化外来体。遗传修饰的生产细胞可以含有通过瞬时或稳定转化的外源序列。外源序列可以作为质粒转化。外源序列可以在靶位点或随机位点处，稳定地整合到生产细胞的基因组序列中。在一些实施方案中，产生稳定的细胞系用于生产腔工程化外来体。[0129]外源序列可以插入到生产细胞的基因组序列中，位于编码外来体蛋白的内源序列的上游(5'末端)或下游(3'末端)。本领域已知的各种方法可以用于将外源序列引入生产细CRISPR/Cas9或TALEN的方法)修饰的细胞在本发明的范围内。[0130]外源序列可以包括编码外来体蛋白或所述外来体蛋白的修饰物或片段的序列。可以引入编码外来体蛋白的序列的额外拷贝，以产生具有更高密度外来体蛋白的腔工程化外来体。可以引入编码外来体蛋白的修饰物或片段的外源序列，以产生含有外来体蛋白的修饰物或片段的腔工程化外来体。可以引入编码亲和标签的外源序列，以产生含有融合蛋白的腔工程化外来体，所述融合蛋白包含附着到外来体蛋白的亲和标签。[0131]在一些实施方案中，与从相同或相似生产细胞类型分离的天然外来体相比，腔工程化外来体具有更高的外来体蛋白密度。在一些实施方案中，与所述天然外来体相比，所述高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体相比，所述外来体蛋白在所述腔工程至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰外来体蛋白相比，包含外来体蛋白的融合蛋白在所述腔工程化外来体上以800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰外来体蛋白相比，外来体蛋白的片段或变体在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、000倍或更高的密度存在。的片段或变体或其修饰物在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰MARCKSL1相比，MARCKSL1、MARCKSL1的片段或变体或其修饰物在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、的片段或变体或其修饰物在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。[0133]在一些实施方案中，生产细胞被进一步修饰以包含额外的外源序列。例如，可以包括额外的外源序列来调节内源基因表达，或者产生包含特定多肽作为有效负载物的外来体。在一些实施方案中，生产细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码外来体蛋白或所述外来体蛋白的修饰物或片段，并且另一个编码有效负载物。[0134]更具体地，腔工程化外来体可以由用编码一种或多种外来体腔蛋白的序列转化的细胞产生，所述外来体腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1);和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。本文所述的一种或多种外来体腔蛋白中的任一种都可以从质粒、插入到基因组中的外源序列或其他外源核酸如合成信使RNA(mRNA)表达。[0135]在一些实施方案中，所述一种或多种外来体腔蛋白在用编码其全长内源形式的外[0136]腔工程化外来体可以由用编码一种或多种外来体腔蛋白片段的序列转化的细胞产生，所述外来体腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1);和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。在一些实施方案中，所述序列编码从天然蛋白质的N末端缺失至少5、10、50、100、200、或300个氨基酸的外来体腔蛋白片段。在一些氨基酸的外来体腔蛋白片段。在一些实施方案中，所述序列编码缺少天然蛋白质的一个或多个功能或结构结构域的外来体腔蛋白片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQIDNO:4-109的肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含S融合蛋白包含具有序列MGXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其他氨基酸(SEQIDNO:117)。在一些实施方案中，融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)相同或相似的序列的多肽的序列转化的细胞产生，所述天然外来体腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS);(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白天然外来体腔蛋白的全长或片段50%相同，例如与SEQIDNO:1-350%相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段60%相同，例如与SEQIDNO:1-3一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段99%相同，例如与SEQID与BASP1的全长或片段80%相同，例如与SEQIDNO:4-10999.9%相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的片段100%相同，例如与SEQID案中，外来体是分离的，并且通过包括但不限于大小、形状、形态或分子组成如核酸、蛋白[0142]外来体含量的测量取。然后，可以在回收含有小RNA的总RNA的条件下，或者在将长度小于200个核苷酸的小RNA[0144]外显子组合物可以通过本领域已知的方法进行评估，所述方法包括但不限于转录[0145]可以使用本领域技术人员熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR、Northern个特定的实施方案中，通过以下测量至少一种RNA的水平：逆转录来自外来体组合物的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种RNA特异性探针寡核苷酸(例如，包含RNA特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交以提供外来体组合物的杂交谱，并将外来体组合物杂交谱与对照样品产生的杂交谱进行比较。测试样品中至少一种RNA的信号[0146]另外，可以由已知RNA序列产生的基因特异性寡核苷酸探针制备微阵列。所述阵列可以为每种RNA含有两种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，并且另一种对人直系同源物仅相差几个碱基的小鼠序列，其可以用作杂交严格性条件的对照。来自两种部的、相对稳定的阳性对照。微芯片上还可以包括一种或多种用于非特异性杂交的适当对[0147]微阵列可以使用本领域已知的技术制造。例如，适当长度(例如40个核苷酸)的探针寡核苷酸在C6位置处被5'-胺修饰，并使用可商购获得的微阵列系统(例如GeneMachineOmniGrid.TM·100微阵列和AmershamCodeLink.TM)印刷在活化的载玻片上。通过用标记引物芯片杂交。SSPE/30%甲酰胺在25℃下持续18小时，随后以0.75.倍洗涤。TNT在37℃下持续标记阵列上发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出由一系列杂交事件组成，一个实施方案，标记的cDNA寡聚体是生物素标记的cDNA,由生物素标记的引物制备。然后通过使用例如链霉亲和素-Alexa647缀合物直接检测含有生物素的转录物来处理微阵列，并利用常规扫描方法扫描。阵列上每个点的图像强度与外来体中对应RNA的丰度成正比。计处理和数据比较以及路径分析。因此，微阵列可以以高通量性能同时分析成百上千个多核苷酸。mRNA表达的微阵列谱分析成功地为基础研究中的基因表达研究提供了有价值的数据。并且所述技术已在制药工业和临床诊断中得到进一步应用。随着越来越多的miRNA数据[0150]在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量纯化级分中包含的外来体和/或外[0152]可以使用动态光散射(DLS)和/或多角度光散射(MALS)测量外来体大小。使用DLS和/或MALS测量外来体大小的方法是本领域技术人员已知的，并且包括纳米粒子跟踪测定所述的外来体群体包括群体，其中90%的所述外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern群体包括群体，其中95%的所述外来体具有如由NTA(例如，使用MalvernNanosight的外来体群体包括群体，其中99%的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZONqNano体，其中90%的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZONqNanoGold)测量的约40-由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2SpiritBioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中体包括群体，其中90%的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTG2Spirit文所述的外来体群体包括群体，其中99%的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，[0155]个体外来体大小可以通过纳米流式细胞术基于逐个颗粒确定。在一些实施方案本文所述的外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有如由纳米流式细胞术(例括群体，其中95%的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测99%的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约20-外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约40-1000nm的最长施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99%的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约40-1000nm的最长尺寸。[0156]外来体电荷密度的测量[0157]在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量纯化级分中包含的外来体和/或外来体群体的电荷密度。在一些实施方案中，电荷密度通过电位滴定、阴离子交换、阳离子交[0158]外来体蛋白密度的测量[0159]在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量外来体表面上的外来体蛋白密度。表面密度可以计算或表示为每单位面积的质量、每单位面积的蛋白质数量、每个外来体的分子数量或分子信号强度、蛋白质的摩尔量等。表面密度可以通过本领域已知的方法进行融合蛋白)检测法、纳米流式细胞术、ELISA、aLISA和/或通过测量蛋白凝胶上的带进行测密术。[0161]提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和说明，并且不意图限制本发明人看待其发明的范围，也不意图表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已尽力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏[0162]除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域技术内常规的蛋白质化学、生物Proteins:StructuresaAL.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers,Inc.,当前版本);Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，1989);MethodsInEnzymologySciences,第21版(Easton,Pennsylvania:MackPublishingCompany,2005);CareyandSundbergAdvancedOrganicChemistry第3版(PlenumPress)第A[0163]实施例1:新外来体蛋白的鉴定[0164]外来体的集合[0165]在9天后，从HEK293SF细胞的高密度悬浮培养物的上清液中收集外来体。过滤上清液，并用阴离子交换色谱进行分级分离，并且在氯化钠的步长梯度中洗脱。蛋白质浓度最高的峰级分含有外来体和污染细胞组分。分离峰级分，并且在Optiprep密度梯度上通过超速离心进一步分级分离。[0166]对于Optiprep梯度，在SW41Ti转子的12mLUltra-Clear(344059)管中，用4mL45%OptiprepT、3mL30%OptiprepT1mLPBS制备4层无菌梯度。将外来体级分添加到Optiprep梯度中并且在4℃下以200,000xg超速离心16小时，以分离外来体级分。超速离心产生已知含有外来体的顶部级分、含有中等密度细胞碎片的中间级分以及含有高密度聚集体和细胞碎片的底部级分(图1)。然后从管顶部约3mL处轻轻收集外来体层。[0167]将外来体级分在38.5mLUltra-Clear(344058)管中的约32mLPBS内稀释，并且在4℃下以133,900xg超速离心3小时，以沉淀经纯化的外来体。然后将沉淀的外来体重新悬[0169]为了测定对外来体具有特异性的蛋白质，通过液相色谱-串联质谱分析OptiprepT梯度的顶部级分和底部级分。在分析之前，通过二辛可宁酸(BCA)测定法测定两个样品的总品添加到含有等体积外来体裂解缓冲液(60mMTris、400mMGdmC1、100mMEDTA、20mM100溶液。然后将所有样品在55℃下孵育60分钟。[0170]通过在-20℃下添加1250μL乙醇进行蛋白质沉淀并且然后在水浴中超声处理5分钟。通过在室温下以15,000g离心5分钟来沉淀沉淀的物质。倾析上清液，并使用氮气彻底干燥沉淀的物质。将沉淀重悬于30.0μL消化缓冲液(30mM烷基化溶液(375mM碘乙酰胺，50mMTris,pH8.5)并且在室温下在黑暗中孵育所得溶液至少30分钟来烷基化游离半胱氨酸残基。蛋白酶开始蛋白水解消化。将所有样品混合，并且然后在37℃下孵育过夜。在孵育后，通过加入5.0μL10%甲酸停止胰蛋白酶活性。在通柱对每个样品进行脱盐。在该过程结束时，将每个样品干燥并且在75.0μL的95:5水：乙腈中用0.1%甲酸复原，并且转移到HPLC小瓶进行分析。[0173]将样品注入UltiMate3000RSCLnano(ThermoFisherScientific)低流量色谱系统中，并且将胰蛋白酶肽以2.500μL/min的流速使用负载流动相(MPL:95%水，5%乙腈，0.1%甲酸)装载到AcclaimPepMap100C18捕集柱(75μ