CN120210127A 使用基因修饰细胞的培养肉产品（塔夫茨大学信托人）

(19)国家知识产权局(30)优先权数据(62)分案原申请数据(71)申请人塔夫茨大学信托人地址美国马萨诸塞州(74)专利代理机构北京市君合律师事务所专利代理师吴瑜顾云峰A23L13/00(2016.01)(54)发明名称使用基因修饰细胞的培养肉产品本文提供基因工程改造的哺乳动物细胞，其内源性表达一种或多种植物化学物、维生素或治疗剂且适用于培养肉产品。还提供制造和使用所述基因工程改造的哺乳动物细胞和所述培养肉产品的方法。T图21.一种工程改造细胞，其内源性合成一种或多种抗氧化因子，其中，所述工程改造细胞包含编码所述一种或多种抗氧化因子的异源多核苷酸。2.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中，所述一种或多种抗氧化因子包含抗氧化类胡萝卜素。3.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中，所述一种或多种抗氧化因子包含抗氧化植物营养素。4.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中，所述一种或多种抗氧化因子包含抗氧化植物代谢物。5.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中，所述一种或多种抗氧化因子包含非动物细胞天然产生的抗氧化代谢物。6.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中，所述一种或多种抗氧化因子包含八氢番茄红素且所述细胞包含编码八氢番茄红素合成酶的异源多核苷酸。7.根据权利要求6所述的工程改造细胞，其中所述八氢番茄红素合成酶具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10至少90%相同的序列。8.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中所述细胞内源性合成番茄红素且包含编码八氢番茄红素去饱和酶的异源多核苷酸。9.根据权利要求8所述的工程改造细胞，其中所述八氢番茄红素去饱和酶具有与SEQIDNO:3至少90%相同的序列。10.根据权利要求8所述的工程改造细胞，其中所述细胞内源性合成β-胡萝卜素且包含编码番茄红素环化酶的异源多核苷酸。11.根据权利要求10所述的工程改造细胞，其中所述番茄红素环化酶具有与SEQIDNO:5或SEQIDNO:11至少90%相同的序列。12.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。13.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中细胞是Pax7哺乳动物肌肉前体细胞。14.根据权利要求1所述的工程改造细胞，其中所述细胞是肌动蛋白肌球蛋白重链(MHC)哺乳动物多核肌管。15.根据权利要求10所述的细胞，其中所述工程改造细胞中的总类胡萝卜素产量比没有编码八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和番茄红素环化酶的所述异源多核苷酸的所述细胞中的总类胡萝卜素产量高至少5倍。16.一种制造根据权利要求1所述的细胞的方法，其包括向天然合成香叶基香叶基焦磷酸的细胞中引入编码一种或多种抗氧化因子的异源多核苷酸。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是Pax7+哺乳动物肌肉前体细胞。18.一种培养肉产品，其包含汇合的无血清培养物，所述培养物包含在食品安全基质上接种的根据权利要求1所述的细胞。19.根据权利要求18所述的培养肉产品，其中所述基质是膜。20.根据权利要求18所述的培养肉产品，其中所述基质是海绵或三维基质。21.根据权利要求18所述的培养肉产品，其中所述基质是壳聚糖基质。22.根据权利要求18所述的培养肉产品，其中所述细胞培养物包含衍生自Pax7+哺乳动物卫星细胞的多核肌管。323.根据权利要求22所述的培养肉产品，其中所述多核肌管表达肌球蛋白重链(MHC)和肌动蛋白。4时申请和2019年6月14日提交的第62/861,606号美国临时申请的优先权，所述临时申请中[0004]本发明是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesof[0005]对通过EFS-WEB提交的序列表的引用[0006]创建于2020年6月1日并在此与本申请一起通过EFS-Web以电子方治疗性蛋白生产(例如单克隆抗体)或疾病的研究和治疗(例如代谢重编程)的应用(Davy等的代谢工程改造工作已经采用了多种分类的转基因以用于从医药和化妆品到能源和农业[0008]一种所述应用为通过细胞培养生产肉类(以各种术语已知，此文将使用“培养具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:_至少90%相同的序列。在一些实施方式中，所述细胞内源性合成番茄红素且包含编码八氢番茄红素去饱和酶的异源多核苷酸。在一些实施方式5中，所述细胞内源性合成β-胡萝卜素且包含编码番茄红素环化酶的异源多核苷酸。在一些实施方式中，所述番茄红素环化酶具有与SEQIDNO:5或SEQIDNO:_至少90%相同的序列。在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，物肌肉前体细胞。在一些实施方式中，所述细胞是肌动蛋白肌球蛋白重链(MHC)哺乳动物多核肌管。在一些实施方式中，所述工程改造细胞中的总类胡萝卜素产量比没有编码八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和番茄红素环化酶的所述异源多核苷酸的所述细胞中的总类胡萝卜素产量高至少5倍。[0010]在第二方面中，本文提供一种制造如本文所描述的工程改造细胞的方法，其包括向天然合成香叶基香叶基焦磷酸的细胞中引入(i)编码八氢番茄红素合成酶的异源多核苷酸；(ii)编码八氢番茄红素去饱和酶的异源多核苷酸；(iii)编码番茄红素环化酶的异源多核苷酸；或(iv)其组合。在一些实施方式中，所述细胞是Pax7+哺乳动物肌肉前体[0011]在第三方面中，本文提供一种工程改造细胞，其内源性合成维生素C且包含一种或[0012]在第四方面中，本文提供一种工程改造细胞，其内源性合成姜黄素且包含一种或多种编码酪氨酸氨裂解酶(PTAL)、4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)、苯基丙酰基-二酮-CoA合成酶(DCS)和姜黄素合成酶(CURS3)的异源多核苷酸。[0013]在第五方面中，本文提供一种工程改造细胞，其内源性合成大麻二酚(CBD)且包含一种或多种编码3,5,7-三氧代十二酰基-CoA合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、大麻萜酚酸合成酶(CBGAS)和大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的异源多核苷酸。[0014]在第六方面中，本文提供一种工程改造细胞，其包含编码具有与SEQIDNO:7至少95%相同的序列的纳米抗体V565的异源多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码通过可裂解多肽连接子与肿瘤坏死因子α(TNFa)共价连接的所述V565纳米抗体。在一些实施方式中，所述可裂解多肽连接子包含SEQIDNO:9。[0015]在第七方面中，本文提供一种工程改造细胞，其包含编码具有与SEQIDNO:8至少95%相同的序列的抗微生物肽16(AMP16)的异源多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷个AMP16的重复序列，每个重复序列由包含Asn-Pro-Val重复序列的连接子多肽间隔开。[0016]在第八方面中，本文提供一种培养肉产品，其包含汇合的无血清培养物，所述培养物包含在食品安全基质上接种的如本文所描述的工程改造细胞。在一些实施方式中，所述基质是膜。在一些实施方式中，所述基质是海绵或三维基质。在一些实施方式中，所述基质是壳聚糖基质。在一些实施方式中，所述细胞培养物包含衍生自Pax7+哺乳动物卫星细胞的[0017]本申请还包含以下的实施方式：[0018]1.一种工程改造细胞，其内源性合成八氢番茄红素且包含编码八氢番茄红素合成酶的异源多核苷酸。[0019]2.根据实施方式1所述的工程改造细胞，其中所述八氢番茄红素合成酶具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10至少90%相同的序列。[0020]3.根据实施方式1或2所述的工程改造细胞，其中所述细胞内源性合成番茄红素且6包含编码八氢番茄红素去饱和酶的异源多核苷酸。[0021]4.根据实施方式3所述的工程改造细胞，其中所述八氢番茄红素去饱和酶具有与SEQIDNO:3至少90%相同的序列。[0022]5.根据实施方式3或4所述的工程改造细胞，其中所述细胞内源性合成β-胡萝卜素且包含编码番茄红素环化酶的异源多核苷酸。[0023]6.根据实施方式5所述的工程改造细胞，其中所述番茄红素环化酶具有与SEQIDNO:5或SEQIDNO:11至少90%相同的序列。[0024]7.根据实施方式1-6中任一项所述的工程改造细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。[0025]8.根据实施方式1-7中任一项所述的工程改造细胞，其中细胞是Pax7哺乳动物肌肉前体细胞。[0026]9.根据实施方式1-7中任一项所述的工程改造细胞，其中所述细胞是肌动蛋白肌球蛋白重链(MHC)哺乳动物多核肌管。[0027]10.根据实施方式5或6所述的细胞，其中所述工程改造细胞中的总类胡萝卜素产量比没有编码八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和番茄红素环化酶的所述异源多核苷酸的所述细胞中的总类胡萝卜素产量高至少5倍。[0028]11.一种制造根据实施方式1-10中任一项所述的细胞的方法，其包括向天然合成香叶基香叶基焦磷酸的细胞中引入(i)编码八氢番茄红素合成酶的异源多核苷酸；(ii)编码八氢番茄红素去饱和酶的异源多核苷酸；(iii)编码番茄红素环化酶的异源多核苷酸；或(iv)其组合。[0029]12.根据实施方式11所述的方法，其中所述细胞是Pax7+哺乳动物肌肉前体细胞。[0030]13.一种工程改造细胞，其内源性合成维生素C且包含一种或多种编码UDP-葡萄糖(RGN)和L-古洛糖酸-γ-内酯氧化酶(GULO)的外源多核苷酸。[0031]14.一种工程改造细胞，其内源性合成姜黄素且包含一种或多种编码酪氨酸氨裂[0032]15.一种工程改造细胞，其内源性合成大麻二酚(CBD)且包含一种或多种编码3,5,7-三氧代十二酰基-CoA合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(OAC)、大麻萜酚酸合成酶(CBGAS)和大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的异源多核苷酸。[0033]16.一种工程改造细胞，其包含编码具有与SEQIDNO:7至少95%相同的序列的纳米抗体V565的异源多核苷酸。[0034]17.根据实施方式16所述的工程改造细胞，其中所述多核苷酸编码通过可裂解多肽连接子与肿瘤坏死因子α(TNFa)共价连接的所述V565纳米抗体。[0035]18.根据实施方式17所述的工程改造细胞，其中所述可裂解多肽连接子包含SEQ[0036]19.一种工程改造细胞，其包含编码具有与SEQIDNO:8至少95%相同的序列的抗微生物肽16(AMP16)的异源多核苷酸。[0037]20.根据实施方式19所述的工程改造细胞，其中所述多核苷酸编码至少2个、至少37每个重复序列由包含Asn-Pro-Val重复序列的连接子多肽间隔开。[0038]21.一种培养肉产品，其包含汇合的无血清培养物，所述培养物包含在食品安全基质上接种的根据实施方式1-10和13-20中任一项所述的细胞。[0039]22.根据实施方式21所述的培养肉产品，其中所述基质是膜。[0040]23.根据实施方式21所述的培养肉产品，其中所述基质是海绵或三维基质。[0041]24.根据实施方式21-23中任一项所述的培养肉产品，其中所述基质是壳聚糖基[0042]25.根据实施方式21-24中任一项所述的培养肉产品，其中所述细胞培养物包含衍生自Pax7+哺乳动物卫星细胞的多核肌管。[0043]26.根据实施方式25所述的培养肉产品，其中所述多核肌管表达肌球蛋白重链(MHC)和肌动蛋白。附图说明[0044]本专利或专利申请文件含有至少一张彩色附图。附有彩色附图的本专利或专利申请公开拷贝将在请求和支付必要费用之后由专利局提供。[0045]图1显示基因构建体和其在类胡萝卜素生物合成途径中对应的终端产物。所有基因构建体含有由双向合成RBPSA/CMV启动子同时启动的嘌呤霉素抗性基因和目的基因。所有目的基因区域含有单独或作为多顺反子mRNA转录物的一部分产生的绿色荧光蛋白(GFP)[0046]图2A-图2B显示牛卫星细胞表征。(图2A)Pax7,即一种转录因子和卫星细胞标记物的免疫荧光染色(绿色),以及细胞肌动蛋白(毒伞素，re(D)和细胞核(DAPI,蓝色)的复染。(图2B)肌球蛋白重链(MF20),即一种骨骼肌收缩蛋白的免疫荧光染色(绿色),以及细胞肌动蛋白和细胞核的复染。分化细胞的高倍染色(high-objectivestaining)揭露肌动蛋白[0047]图3A-图3C显示工程改造细胞生长和发育。(图3A)用全部四种构建体(产生类胡萝卜素的构建体和对照构建体)工程改造的C2C12和BSC中的GFP表达的荧光图像。由于构建体的结构，GFP表达暗示基因构建体中的其它酶的成功表达。(图3B)用全部四种构建体工程改造的C2C12和BSC八天内的生长曲线，n=3个不同样品，*指示对应颜色的与pGFP的显著差异，p<0.05。(图3C)分化之前(顶部)和之后(底部)pCrtB/I/YBSC中Pax7(re(D)和肌球蛋白重链(re(D)的免疫荧光染色。DAPI复染(蓝色)显示细胞核，并且内源性GFP(绿色)显示细胞[0048]图4A-图4B显示工程改造细胞中的类胡萝卜素产量。工程改造细胞中的类胡萝卜素产量。(图4A)用pCrtB、pCrtB/I和pCrtB/I/Y工程改造的C2C12中的类胡萝卜素产量。在pCrtB细胞中，仅产生八氢番茄红素。在pCrtB/I细胞中，大部分八氢番茄红素转化为番茄红萝卜素水平显著减少。n=3个不同样品；不同字母指示条柱之间的统计差异，p<0.05。(图4B)用pCrtB、pCrtB/I和pCrtB/I/Y工程改造的BSC中的类胡萝卜素产量。趋势遵循C2C12,其中总类胡萝卜素含量在所有情况下与C2C12相比减少约10倍。n=3个不同样品；不同字母指8示条柱之间的统计差异，p<0.05。类胡萝卜素数据以μg/g蛋白质提供。相对于蛋白质比较类胡萝卜素的个别值和数据在图4C-图4D中给出。[0049]图4C-图4D显示类胡萝卜素和蛋白质定量数据。个别类胡萝卜素和蛋白质数据点用于产生μg/g数据。(图4C)对于所有细胞类型和处理，每百万细胞的C2C12类胡萝卜素和蛋白质定量。趋势与图4和图5中相同。(图4D)对于所有细胞类型和处理，每百万细胞的BSC类胡萝卜素和蛋白质定量。趋势与图4A-图4B和图5A-图5C中相同。对于全部，n=3个不同样[0050]图5A-图5C显示类胡萝卜素优化。(图5A)在其作为胆固醇合成中前体的共用途径的情形下的类胡萝卜素生物合成途径。显示了优化的可能机制。嘌呤霉素(紫色)通过选择提供较高酶表达并且因此增加类胡萝卜素合成通量的细胞而起作用。酮康唑(re(D)通过抑制羊毛固醇转化成酵母固醇，通过引起羊毛固醇、角鲨烯和FPP的上游累积，或通过减少胆固醇作为上游FPP合成反应的反馈抑制因子的影响来增加类胡萝卜素前体法呢基焦磷酸(FPP)水平起作用。(图5B)工程改造BSC的细胞团图像。可以看到类胡萝卜素的着色效果，其中pGFP细胞微绿，pCrtB不含色素，而pCrtB/I和pCrtB/Y细胞含有一些橙色色素。优化的pCrtB/I/Y细胞明显橙色更重，指示类胡萝卜素水平增加。(图5C)优化细胞中β-胡萝卜素的酮康唑和嘌呤霉素一起不显著增加β-胡萝卜素。n=3个不同样品；*p<0.05。类胡萝卜素数据以μg/g蛋白质提供。相对于蛋白质比较类胡萝卜素的个别值和数据在图4C-图4D中给出。[0051]图6显示有或无加热下的工程改造BSC的硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)分析。所有加热样品与生(raw)样品相比呈现丙二醛(MD(A)的显著增加，指示来自此“烹制”过程上不同(p<0.05)。[0052]图7A-图7B显示类胡萝卜素优化处理。(图7A)用pCrtB/I/Y工程改造的C2C12和BSC中的平均荧光强度的流式细胞术测量结果(完整流式细胞术数据在图8A_图8B中)。细胞与的荧光强度指示较高的平均GFP表达，其对应于较高的平均酶表达。误差以平均值标准差给[0053]图8A-图8B显示流式细胞术数据。(图8A)用不同水平的嘌呤霉素处理的细胞的BSC2.5μg/mL嘌呤霉素(1×puro)、pCrtB/I/Y与5μg/mL嘌呤霉素(2×puro)和pCrtB/I/Y与10μg/mL嘌呤霉素(4×)。顶部行是前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)数据，显示了针对活细胞(使用非工程改造对照组确定)的门控(gate),其中门控值(gatevalue)是相对于总计数(7,500)的百分比。底部行为GFP数据，显示了针对GFP阳性细胞(使用非工程改造对照组确定)的门控，其中门控值为相对于活细胞(在顶部行中门控)的百分比。(图8B)用不同水平的9×puro)和pCrtB/I/Y与10胞(使用非工程改造对照组确定)的门控，其中门控值是相对于总计数(7,500)的百分比。底部行为GFP数据，显示了针对GFP阳性细胞(使用非工程改造对照组确定)的门控，其中门控值为相对于活细胞(在顶部行中门控)的百分比。[0054]图9A-图9B显示优化细胞的类胡萝卜素概况。(图9A)无优化(顶部)或进行嘌呤霉素处理和酮康唑处理(底部)的pCrtB/I/YC2C12的八氢番茄红素、番茄红素和β-胡萝卜素含量。n=3个不同样品。(图9B)无优化(左上)、无嘌呤霉素处理但进行酮康唑处理(右上)、进行嘌呤霉素处理但无酮康唑处理(左下)或进行嘌呤霉素处理和酮康唑处理(左下)的同字母指示条柱之间的统计差异，p<0.05)。[0055]图10显示BSC中从前体的维生素C、姜黄素和大麻二酚合成途径。将被工程改造以合成各种化合物，所述各种化合物将在分化前和分化后分析。在3中，将分析细胞生长和发育、营养素生物可用性和营养素功能。[0057]图12显示实施例3的概述。将药物表达载体(A)和赋形剂(B)工程改造到牛肌肉和脂肪细胞中以探究体外药物合成。绿色荧光蛋白(GFP)与治疗组分的同时表达充当基因表达的简单标记。药物表达载体(V565和AMP16,各自包含GFP标记物)进一步被工程改造以并入用于药物活性的各种疾病反应性机制，包括可裂解胰蛋白酶的富含赖氨酸的连接子、可裂解弹性蛋白酶的NPV-连接子或两者的组合。在IBD和肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)感染的3D模型中测试牛肌肉细胞(增殖或分化)中的疾病反应性可食用治疗剂，[0058]图13A-图13E显示牛卫星细胞(BSC)培养结果。(图13A)原代BSC的表征。增殖细胞显示Pax7(一种肌肉干细胞标记物)的普遍表达(比例尺：100μm)。(图13B)分化细胞显示肌管形成和肌球蛋白重链(MF20)的表达，指示成肌分化(比例尺是100μm)。(图13C)在含血清的生长培养基(GM)和无血清培养基(B8)的稀释液中培养的BSC的四天生长。在所有情况下，包括B8单独使用(即无血清，最右柱),相比于GM单独使用(最左柱),含有B8的稀释液显示显著提高的四天内生长。不同字母指示组之间的统计显著性(p<0.05)。(图13D)用游离脂肪酸(FFA)进行的BSC的成脂转分化。用0到150μM亚油酸和亚油酸、芥子酸和反油酸(elaidid的AdipoRed分析结果。[0059]图14A-图14D显示BSC组成工程改造。(图14A)用pCrtB、pCrtB/I和pCrtB/I/Y工程大部分八氢番茄红素转化为番茄红素。在pCrtB/I/Y细胞中，类胡萝卜素以β-胡萝卜素累积，但与pCrtB和pCrtB/I相比，总类胡萝卜素水平显著减少。不同字母指示条柱之间的统计增加。*指示显著性(p<0.05)。(图14C)有或无加热下的工程改造BSC的硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)分析。所有加热样品与生样品相比呈现丙二醛(MDA)的显著增加，指示来自此现MDA的显著减少，且pCrtB不呈现显著变化。共享同一字母的条柱在统计学上不同(p<荧光和光学显微图像。绿色荧光指示基因表达。在嘌呤霉素选择之后，所有细胞都表达GFP[0060]图15A-图15H显示3D肠模型。图15A-图15D显示肠支架⁵7。(图15A-图15B)产生用于构建图案化和非图案化模型肠的基于丝的3D多孔支架的示意图。支架通过以下方式制备：将丝溶液浇铸于PDMS模具中，并且将特氟隆涂布的线材或尼龙螺钉插入穿过圆柱体，冻干且诱导β折叠形成(比例尺：4mm)。(图15C)支架中和2D培养物中的肠细胞标记物(Z0-1和液沉积的甲苯胺蓝染色的光学显微镜观察显示3D支架中相比于2D粘液厚度增加，且图案化支架中相比于非图案化粘液厚度增加(比例尺：200μm)。定量(数据未显示)揭露非图案化和图案化支架的粘液沉积的与2D培养物相比分别增加2倍和3倍。图15E-图15H显示IBD模型化55。图15E通过用大肠杆菌(E.coli)0111:B4LPS和IFNγ处理诱导发炎。发炎模型中e-钙黏素的染色显示在第7天发炎组与未发炎组之间的上皮覆盖度(epithelialcoverage)的差异(比例尺：100μm)。F)MUC2染色显示所有组的染色阳性指示杯状细胞的存在(比例尺：100μm)。图15G第7天模型的横截面显示不同的如通过e-钙黏素观察的上皮覆盖度(比例尺[0061]图15I-图15L显示微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)感染3D肠模型5⁶。图15I未感染的细胞显示规律的微绒毛(比例尺：2μm)。图15J第3天的微小隐孢子虫I型裂殖体(meront)(粗箭头)和纳虫空泡(emptyparasitophorousvacuole)(细箭头)(比例尺：2μ[0062]图16A-图16B显示牛卫星细胞(BSC)培养结果。(图16A)原代BSC的表征。增殖细胞(左图)显示Pax7(一种肌肉干细胞标记物)的普遍表达。分化细胞(右图)显示肌管形成和肌球蛋白重链(MF20)的表达，指示成肌分化。(图16B)在含血清的生长培养基(GM)和无血清培养基(B8)的稀释液中培养的BSC(左图)。在所有情况下，包括B8单独使用(即无血清，最右柱),相比于GM单独使用(最左柱),含有B8的稀释液显示显著提高的四天内生长。B8培养基2浓度显示显著提高的四天内生长。在左图中，不同字母指示组之间的统计显著性(p<[0063]图17A-图17B显示用游离脂肪酸(FFA)进行的牛卫星细胞(BSC)的成脂转分化。(图导的脂质累积的定量分析的AdipoRed分析结果。[0064]图18显示实施例4的概述。将配制培养基以探究牛肌肉和脂肪组织的无血清和无11抗生素培养的各种不同的方法。将分析细胞增殖和分化，也将分析营养和肉类质量特征。[0065]以引用的方式并入[0066]本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同每个个别的公开、专利和专利申请特定地并且个别地指示以引用的方式并入具体实施方式[0067]本公开描述工程改造细胞和其在培养肉产品中的用途。细胞可以被工程改造以通过在细胞中表达一种或多种外源性生物合成途径酶来内源性地产生一种或多种代谢物。细胞还可以被工程改造以通过增加或减少细胞天然具有的生物合成途径酶来增加或减少一种或多种内源性产生的代谢物，或通过将非天然生物合成途径酶引入到细胞中来增加天然代谢物的内源性产生。[0068]如本文所用，“代谢物”是指是细胞中通过一种或多种生物合成途径的初级或次级代谢的中间产物或最终产物的化合物。细胞代谢物在对蛋白质和酶、酶辅因子或酶共底物、防御和与其它生物体或细胞的相互作用的供能、结构、信号传导、刺激和抑制作用方面具有苷酸、抗氧化因子、有机酸、多元醇和维生素。本文所述的细胞可以被工程改造以内源性地产生一种或多种代谢物，包括但不限于植物化学物[0069]如本文所用，“植物化学物”是指在植物中发现且由植物产生的生物活性化合物，其通常在植物生长或针对竞争者、病原体或捕食者的防御中起作用。植物化学物生物合成途径可以是初级或次级代谢途径。尽管植物化学物可以从来源植物中提取和分离，但也可以将产生植物化学物的生物合成途径基因工程改造到细菌、真菌或其它真核细胞中，或植物化学物可以合成方式产生。[0070]“植物营养素”是指作为哺乳动物饮食中的必需营养素或具有支持哺乳动物健康(health/wellness)的特定生物活性的植物化学物。植物营养素可以包括但不限于多酚、萜糖苷、植物雌激素、植物固醇、花色素苷、@-3脂肪酸和益生菌。植物域中描述了植物营养素和其在哺乳动物和人类健康(health/wellness)中的功能。参见例如Gupta等人("Phytonutrientsastherapeuticagents,"J.ComplementIntegr.Med.,2014,11(3):151-169),其以引用的方式并入本文中。[0071]总体来说，将编码产生所关注的一种或多种代谢物所必需的一种或多种生物合成途径酶的一种或多种异源和/或外源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中以产生基因工程改造细胞，所述基因工程改造细胞内源性产生所关注的一种或多种代谢物。细胞可以被工程改造以短暂地表达所需的所关注的生物合成途径酶，或细胞可以被工程改造以稳定地表达所需的所关注的生物合成途径酶。可使用任何所属领域中已知的转染或转导方法将编码生物合成途径酶的异源多核苷酸引入到细胞中。“生物合成途径酶”可互换地使用并且是指催化化学反应的蛋白质。关于任意独立或作为生物合成途径一部分的特定酶的叙述应理解为包括酶正常运作所必需的酶辅因子、辅酶和金酸、寡核苷酸、多核苷酸(所述术语可互换地使用)或其任何片段。这些短语还指天然或合成来源的DNA或RNA(其可以是单链或双链的并且可以表示有义链或反义链)。多核苷酸可以是cDNA或基因组DNA。[0074]还提供与本文所述的多核苷酸同源的多核苷酸。本领域技术人员应理解基因密码的简并性和多种多核苷酸可以编码同一多肽。在一些实施方式中，多核苷酸(即，编码生物合成途径酶以合成所关注的代谢物的多核苷酸)可针对特定细胞中的表达被密码子优化，所述特定细胞包括但不限于哺乳动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞。在一些实施方式中，多核苷酸针对属或物种特异性表达(例如，在牛细胞中表达)被密码子优化。虽然本文公开特定多核苷酸序列的实施例，但可使用编码本文所描述的多肽的所要形式的任何多核苷酸序列。因此，可以使用非天然存在的序列。这些可以是合乎需要的，例如以增强在多肽或蛋白质的异源表达系统中表达。可使用用于产生简并编码序列的计算机程序且用于此目多核苷酸为通过实验室方法形成的多核苷酸，其包括来源于至少两种不同天然来源的多核苷酸序列或其可以是合成的。因此，构建体可以包括通过例如基因组编辑技术引入的对于内源性基因的新修饰。构建体还可以包括使用例如重组DNA方法产生的重组多核苷酸。[0076]本文所提供的构建体可以通过本领域技术人员可用的方法制备。值得注意的是，本文所描述的构建体中的每一种为重组分子，并且因此不存在于自然界中。一般来说，本文中所用的命名法和本发明中所用的实验室程序包括本领域中众所周知并且常用的分子技术、生物化学技术和重组DNA技术。可供本领域的技术人员使用的标准技术可用于克隆、DNA[0077]本文所提供的构建体可以包含与本文所描述的多核苷酸中的任一种可操作地连接的启动子。启动子可以是与本文所述的生物合成途径相关的异源启动子或内源性启动基因的转录调节区，其可见于本文所描述的多核苷酸的5’侧或3’侧，或多核苷酸的编码区内，或多核苷酸中的内含子内的。通常，启动子是能够在细胞中结合RNA聚合酶并且起始下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调节区。典型5’启动子序列在其3'端以转录起始位点为界，并且向上游(5’方向)延伸以包含在高于背景的可检测水平下转录起始所必需的最少数目个碱基或元件。启动子序列内有转录起始位点(方便地通过用核酸酶S1定位来定义)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。[0079]在一些实施方式中，编码本文所述的生物合成途径酶的多核苷酸与启动子可操作地连接。如本文所用，当多核苷酸处于与第二多核苷酸序列的功能关系中时，多核苷酸是“可操作地连接(operablyconnected/operablylinked)”。苷酸连接以使得其可影响该多核苷酸的转录，那么启动子与多核苷酸可操作地连接。在各种实施方式中，多核苷酸可以与至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或作地连接。[0080]可用于本发明的实践的异源启动子包括但不限于组成型、诱导型、时间调节型(temporally-regulated)、发育调节型、化学调节型、组织偏好和组织特异性启动子。异源启动子可以是植物、动物、细菌、真菌或合成启动子。适合于在植物中表达的启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus)的35S启动子质激素诱导型启动子、雌激素诱导型启动子和四环素诱导型和四环素抑制型启动子。其它启动子包括但不限于以下的启动子：劳氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)、巨细胞病毒(CMV)、Dox-诱导型启动子(例如Tet反应元件(TRE))、泛素C毒等；以及翻译延伸因子EF-lα启动子或泛素启动子。在昆虫细胞中，典型启动子包括但不限于上游活化序列(UAS)、肌动蛋白5c(Ac5)和多角体蛋白。在鱼细胞中，典型启动子包括但不限于非洲爪蟾(Xenopuslaevis)延伸因子1α启动子(X1Eefla1)和大洋鳕鱼(oceanpout)抗冻蛋白启动子(OP5a)。本领域技术人员熟悉广泛多种用于不同细胞类型的另外启动子。在一些实施方式中，异源启动子包括对于植物宿主内源或异源的植物启动子。[0081]提供包括本文所述的构建体或多核苷酸中的任一种的载体。术语“载体”意在指一种多核苷酸，其能够运输其已连接的另一多核苷酸。在一些实施方式中，载体可以是“质粒”,其是指其中可以连接额外DNA片段的环状双链DNA环。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体可以在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制，如一些病毒载体或转座子。举例来说，用于本公开的组合物和方法的适当载体包括附加以下组成的线性或环形DNA或RNA分子：染色体、非染色体、半合成或合成的核酸。许多适合的载体是本领域技术人员所已知的，并且是可商购的。在一些实施方式中，载体为附加型载体，其归因于复制起点的存在而能够自主复制。还包括植物微型染色体作为载体。在一些实施方式中，载体为多顺反子载体，其包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)和/或一个或多个2A肽序列，从而允许从单一构建体或载体共表达多个多核苷酸。载体可以带有基因元件，例如赋予某些药物或化学物质抗性的基因元件。[0082]在一些实施方式中，本文所述的构建体或载体可以包含可选标记物。如本文所用，“可选标记物”是指一种基因元件，其允许通过在细胞中表达所述基因元件来识别和选择含有具有所述基因元件的构建体或载体的细胞。在一些实施方式中，可选标记物是编码荧光蛋白的多核苷酸，使得可以视觉上或通过适合细胞分选方法(例如荧光活化细胞分选 (FACS))识别表达荧光蛋白的细胞。在一些实施方式中，可选标记物为使表达可选标记物的细胞带有抗生素抗性的多核苷酸(例如嘌呤霉素、青霉素、链霉素或潮霉素抗性基因)。用具有可选标记物的载体转导的细胞可暴露于对可选标记物具有特异性的选择化学物质以选出含有所述载体的细胞。可选标记物赋予针对选择化学物质的抗性，使得含有载体和可选标记物的细胞存活，而不含有载体和可选标记物的细胞被杀灭。[0083]如本文所用，“引入”描述将外源性多核苷酸(例如DNA或RNA)引入到接受细胞中的过程。将多核苷酸引入到细胞中的方法为本领域中已知的并且可包括但不限于显微注射、转化和转染方法。转化或转染可以根据本领域中众所周知的各种方法在天然或人工条件下进行，并且可以依赖于将外来核酸序列插入到宿主细胞中的任何已知方法。用于转化或转染的方法基于所转化的宿主细胞的类型选择，并且可以包括但不限于[0084]在一些实施方式中，本文所描述的外源性多核苷酸、构建体或载体使用适合的运载体(carrier)转染到细胞中。适合的运载体在本领域中是已知且被使用了的，包括但不限于脂质运载体(例如，脂染胺(Lipofetamine))、聚合纳米运载体，[0085]如果细胞相比于相同类型的未经基因组编辑的细胞包含对其基因组的修饰，那么外源性多核苷酸的原核或真核细胞，不管用于插入的方法是什么。在一些情况下，细胞已经被修饰以包含通过人工(例如使用重组DNA技术)产生或修饰的非天然存在的核酸分子或衍生自所述分子(例如通过转录、翻译等)。含有外源、重组、合成和苷酸的细胞被视为工程改造或“基因组编辑”的细胞。基因编辑或修饰细胞是指修饰细胞内的细胞核酸，包括基因修饰细胞内的内源性和/或外源性核酸。基因修饰可以包括缺失、插酸酶或人工工程改造的核酸酶)或转座酶进行基因编辑。适于根据本文所提供的方法使用的进行基因修饰的其它方法包括但不限于体细胞核转移(SCNT)和转基因引入。获得重组或基因修饰的细胞的程序在本领域中是一般已知的，并且描述于Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor(1989),其以引用的方式并入本文中。[0086]在一些实施方式中，使用CRISPR/Cas介导的基因编辑(例如II型CRISPR/cas系统)将编码产生所关注的代谢物所需的生物合成途径酶的多核苷酸整合到细胞的基因组中。在一些情况下，使用CRISPR/cas系统减少一种或多种内源性基因的蛋白质表达。在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统可用于进行位点特异性插入。举例来说，基因组中的插入位点上的点切可由CRISPR/cas进行以促进转基因在插入位点处的插入。适合于宿主细胞的CRISPR/Cas介导的基因编辑的技术是已知的且如本领域中所描述的。[0087]在一些实施方式中，使用转座子将编码产生所关注的代谢物所需的生物合成途径酶的多核苷酸整合到细胞的基因组中。适合的转座子是已知的且如本领域中所描述的，包Hsmar1和Harbinger3_DR。参见例如Ivics等人("Theexpandinguniverseoftransposontechnologiesforgeneandcellengineering,"MobileDNA,1(25),2010),其描述转座子系统和本领域中用途。[0088]在一些实施方式中，使用转基因将编码产生所关注的代谢物所需的生物合成途径酶的多核苷酸整合到细胞的基因组中。如本文所用，术语“转基因”是指可以转移到生物体或其细胞中的基因或基因材料。CN120210127A说明书12/87页[0089]在一些实施方式中，细胞被工程改造以内源性地产生类胡萝卜素八氢番茄红素。八氢番茄红素通过酶八氢番茄红素合成酶由两个香叶基氢番茄红素合成酶的多核苷酸引入到天然产生香叶基香叶基焦磷酸的细胞中以产生表达素合成酶来自细菌凤梨泛菌(Pantoeaananatis)并且具少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在凤梨泛菌中，八氢番茄红素合成酶13/87页13/87页[0119]CTGGGATCAGCGGCAGTCAACGACCACGCCCGAAAAATTAACGCTGCTGCTGGC[0120]CCTCTGGTCAGGCCCTTACTTCCCGGATGCGGGCTCAT[0122]在一些实施方式中，细胞内源性产生量为约1μg/g蛋白质到约800μg/g蛋白质、约5μg/g蛋白质到约600μg/g蛋白质、约10μg/g蛋白质到约500μg/g蛋白质、约25μg/g蛋白质到约300μg/g蛋白质、约30μg/g蛋白质到约250μg/g蛋白质或约30μg/g蛋白质到100μg/g蛋白质的八氢番茄红素。在一些实施方式中，与不含有编码八氢番茄红素合成酶的多核苷酸的细胞相比，细胞内源性地产生至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍或至少14倍更多的八氢番茄红素。[0123]在一些实施方式中，细胞被工程改造以内源性地产生类胡萝卜素番茄红素。番茄红素通过八氢番茄红素去饱和酶由八氢番茄红素合成。将编码八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸引入到产生八氢番茄红素的细胞中以产生表达八氢番茄红素去饱和酶并且内源性地合成番茄红素的细胞。在一些实施方式中，八氢番茄红素去饱和酶来自凤梨泛菌并且具有SEQIDNO:3的多肽序列。在一些实施方式中，八氢番茄红素去饱和酶具有与SEQIDNO:3至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在凤梨泛菌中，八氢番茄红素去饱和酶由具有SEQIDNO:4的序列的基因crtI编码。在一些实施方式中，crtI序列可以针对所关注的特定细胞中的表达被密码子优化。在一些实施方式中，crtI序列针对在牛细胞中的表达被密码子优化(例如SEQIDNO:39)。[0124]SEQIDNO:3八氢番茄红素去饱和酶(UniprotP21685):在一些实施方式中，细胞内源性产生量为约1μg/g蛋白质到约800μg/g蛋白质、约5μg/g蛋白质到约600μg/g蛋白质、约10μg/g蛋白质到约500μg/g蛋白质、约25μg/g蛋白质到质的番茄红素。在一些实施方式中，与不含有编码八氢番茄红素合成酶和八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸的细胞相比，细胞内源性地产生至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍或至少14倍更多的番茄红素。[0129]在一些实施方式中，细胞被工程改造以内源性地产生类胡萝卜素β-胡萝卜素。β-胡萝卜素通过酶番茄红素环化酶由番茄红素合成。将编码番茄红素环化酶的多核苷酸引入到产生番茄红素的细胞中以产生表达番茄红素环化酶并且内源性合成β-胡萝卜素的细胞。在一些实施方式中，番茄红素环化酶来自细菌凤梨泛菌并且具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:11的多肽序列。在一些实施方式中，番茄红素环化酶具有与SEQIDNO:5或SEQIDNO:11至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在凤梨泛菌中，番茄红素环化酶由具有SEQIDNO:6的序列的基因crtY编码。在一些实施方式中，crtY序列可以针对所关注的特定细胞中的表达被密码子优化。在一些实施方式中，crtY序列针对在牛细胞中的表达被密码子优化(例如SEQIDNO:40)。尽管下文所列的序列来自凤梨泛菌，但本领域技术人员将认识到同源序列可以从用于本文所述的工程改造细胞和方法的其它物种识别出。[0130]SEQIDNO:5番茄红素环化酶(UniprotP21687):CN120210127AMQPHYDLILVGAGLANGLIALRLQQQQPDMRILLIDAAPQAGGNHTWSFHRWIAPLVVHHWPDYQVRFPTRRRKLNSGYFCITSQRFAEVLLRQFGPVNAESVRLKKGQVIGARAVIDGRGYAANSALSVGFQAFIGQEWRLSRPHGLS[0131]TVDQQNGYRFVYSLPLSPTRLLIEDTHYIDNATLDPERARQNICDYAAQQGWQLQTLLREEQGALPITLSGNADAFWQQRPLACSGLRAGLFHPTTGYSLPLAVAVAASIHQAITHFARERWQQQRFFRMLNRMLFLAGPADLRWRVMQRFYGLPEDKLTLTDRLRILSGKPPVPVLAALQA[0132]SEQIDNO:11番茄红素环化酶：MQPHYDLILVGAGLANGLIALRLQQQQPDMRILLIDAAPQAGGNHTWSFHRWIAPLVVHHWPDYQVRFPTRRRKLNSGYFCITSQRFAEVLQRQFGPVNAESVRLKKGQVIGARAVIDGRGYAANSALSVGFQAFIGQEWRLSHPHGLS[0133]TVDQQNGYRFVYSLPLSPTRLLIEDTHYIDNATLDPECARQNICDYAAQQGWQLQTLLREEQGALPITLSGNADAFWQQRPLACSGLRAGLFHPTTGYSLPLAVAVAASIHHAITHFARERWQQQGFFRMLNRMLFLAGPADSRWRVMQRFYGLPEDKLTLTDRLRILSGKPPVPVLAALQAATGCAACCGCATTATGATCTGATTCTCGTGGGGGCTGGACTCGCGAAGCCCTGCGTCTTCAGCAGCAGCAACCTGATATGCGTATTTTCCCCAGGCGGGCGGAAATCATACGTGGTCATTTCACCACGATCAACATCGTTGGATAGCGCCGCTGGTGGTTCATCACTGGCCTTTCCCACACGCCGTCGTAAGCTGAACAGCGGCTACTTCTGTTCGCTGAGGTTTTACTGCGACAGTTTGGCCCGCACTTGTGGATCAGAGGTTAATGCGGAATCTGTTCGGTTGAAAAAGGGTCAGGCGGTGATTGACGGGCGGGGTTATGCGGCAAACTCAGCACTGGCGTTTATTGGCCAGGAATGGCGATTGAGCCGCCCGCATGTATCATGGATGCCACGGTCGATCAGCAAAATGGTTATCGCTTGCTCTCGCCGACCAGATTGTTAATTGAAGACACGCACTATATAGATCCTGAACGCGCGCGGCAAAATATTTGCGACTATGCCGCGCAACAGCTTCAGACTCTGCTGCGTGAAGAACAGGGCGCCTTACCCATTACCATGCCGACGCATTCTGGCAGCAGCGCCCCCTGGCCTGTAGTGGATTATGTTCCATCCTACCACCGGCTATTCACTGCCGCTGGCGGTTTGAGCGCACTTGATGTCTTTACGTCGGCCTCAATTCATCAGGCCCGCGAGCGCTGGCAGCAGCAGCGCTTTTTCCGCATGCTGAAGCCGGGCCCGCCGATTTACGCTGG[0136]在一些实施方式中，细胞内源性产生量为约1μg/g蛋白质到约800μg/g蛋白质、约5μg/g蛋白质到约600μg/g蛋白质、约10μg/g蛋白质到约500μg/g蛋白质、约25μg/g蛋白质到约300μg/g蛋白质、约30μg/g蛋白质到约250μg/g蛋白质或约30μg/g蛋白质到100μg/g蛋白质的β-胡萝卜素。在一些实施方式中，与不含有编码八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和番茄红素环化酶的多核苷酸的细胞相比，细胞内源性地产生至少2倍、至少3倍、至13倍或至少14倍更多的β-胡萝卜素。[0137]在一些实施方式中，工程改造细胞中的总类胡萝卜素产量为约1μg/g蛋白质到约质到100μg/g蛋白质。在一些实施方式中，工程改造细胞中的总类胡萝卜素产量比不含编码八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和番茄红素环化酶的多核苷酸的细胞中的总[0138]在一些实施方式中，细胞被工程改造以内源性产生维生素C。尽管哺乳动物细胞例如天然产生维生素C前体UDP-葡萄糖并且具有编码维生素C生物合成途径酶的基因，但维生素C生物合成途径通常在哺乳动物细胞中沉默。维生素C生物合成，包括中间物的示意图显示于图10中。维生素C生物合成途径酶包括UDP-葡萄糖6-脱氢酶(UGDH)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶1(UGT1A1)、醛-酮还原酶家族1(AKR1A1)、钙调素(RGN)和L-古洛糖酸-γ-内酯氧化多核苷酸引入到细胞中。在一些实施方式中，将编码RGN的异源多核苷酸引入到细胞中。在一些实施方式中，将编码GULO的异源多核苷酸引入到细胞中。在一些实施方式中，将编码列对于其中引入多核苷酸序列的细胞是内源性的。在一些实施方式中，UGT1A1、UGDH、的氨基酸序列对于其中引入多核苷酸序列的细胞是外源性的。在一些实IDNO:12-16的多肽序列，并且将多核苷酸序列引入到其中的细胞是牛细胞。在一些实施方至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。虽然下文所列的序列来自欧洲牛，但本领域技术人员将认识到同源序列可以从用于本文所述的工程改造细胞和方法的其它物种识别出。[0139]SEQIDNO:12UGDH(UniProt:P123SEQIDNO:14AKR1A1(UniProt:Q3ZCJ2):SEQIDNO:15RGN(UniProt:Q9TTJ5):SEQIDNO:16GULO(UniProt:Q3ZC33):在一些实施方式中，细胞被工程改造以内源性地产生姜黄素。在哺乳动物细胞中天然产生的酪氨酸是使用生物合成途径酶酪氨酸氨裂解酶(PTAL)、4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)、苯基丙酰基-二酮-CoA合成酶(DCS)和姜黄素合成酶(CURS3)的姜黄素生物合成的前体。生物合成途径，包括中间物的示意图显示于图10中。将编码PTAL、4CL、DCS和CURS3的一种或多种多核苷酸引入到天然产生酪氨酸的细胞中以产生表达PTAL、4CL、DCS和CURS3并且内源性合成姜黄素的细胞。在一些实施方式中，PTAL、4CL、DCS和CURS3生物合成酶来自水稻(0ryzasativa)和姜黄(Curcumalonga),并且分别具有SEQIDNO:17-20的多肽序列。在一些实施方式中，PTAL、4CL、DCS和CURS3分别具有与SEQIDNO:17-20至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在一些实施方式中，将生物合成途径酶中的仅一种、两种或三种工程改造到细胞中以使得产生途径中间物。虽然下文所列的序列来自水稻和姜黄，但本领域技术人员将认识到同源序列可以从用于本文所述的工程改造细胞和方法的其它物种识别出。[0150]SEQIDNO:17PT[0158]在一些实施方式中，细胞被工程改造以使用生物合成途径酶PTAL、4CL和双脱甲氧姜黄素合成酶内源性产生姜黄素。将编码PTAL、4CL和双脱甲氧姜黄素合成酶的一种或多种多核苷酸引入到天然产生酪氨酸的细胞中以产生表达PTAL、4CL和双脱甲氧姜黄素合成酶并且内源性合成姜黄素的细胞。在一些实施方式中，PTAL、4CL和双脱甲氧姜黄素合成酶分别具有SEQIDNO:17、18和21的氨基酸序列。在一些实施方式中，PTAL、4CL和双脱甲氧姜黄素合成酶分别具有与SEQIDNO:17、18和21至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的氨基酸序列。虽然下文所列的序列来自水稻，但本领域技术人员将认识到同源序列可以从用于本文所述的工程改造细胞和方法的其它物种识别出。[0159]SEQIDNO:21双脱甲氧姜黄素合成酶粳稻(UniProt:Q8LILO):[0161]在一些实施方式中，细胞被工程改造以内源性地产生大麻二酚。在哺乳动物细胞中天然产生的丙二酰基-CoA是使用生物合成途径酶3,5,7-三氧代十二酰基-CoA合成酶(OLS)、橄榄醇酸环化酶(0AC)、大麻萜酚酸合成酶(CBGAS,也称为异戊二烯基转移酶1或PT1)和大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的大麻二酚(CBD)生物合成的前体。生物合成途径，包括细胞。在一些实施方式中，CBD生物合成途径中可使用异戊二烯基转移酶NphB代替CPGAS。在且分别具有SEQIDNO:22-26的多肽序列。在一些实施方式中，0LS、OAC、CPGAS、CBDAS和NphB分别具有与SEQIDNO:22-26至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在一些实施方式中，将生物合成途径酶中的仅一种、两种或三种工程改造到细胞中以使得产生途径中间物。虽然下文所列的序列来自大麻，但本领域技术人员将认识到同源序列可以从用于本文所述的工程改造细胞和方法的其它物种识别出。[0162]SEQIDNO:[0164]SEQIDNO:230AC[0168]SEQIDNO:25CBDAS(UniProt:A6P6V9):[0170]SEQIDNO:26NphB(UniProt:ACN120210127AMSGAADVERVYAAMEEAAGLLDVSCAREKIYPLLTVFQDTLTDGVVVFLDFSISVPVSQGDPYATVVKEGLFQATGSPVDELLADTVAHLPVSMFAIDGTYAFFPTDDMPGVAQLAAIPSMPASVAENAELFARYGLDKVQMTSM[0171]SDLKQEYLQPESVVALARELGLRVPGELGLEFCKRSFAVYPTLNWDTGKDPTLVPSEDERDIEMFRNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSSTEEYYKL[0172]以下基因序列针对牛细胞中表达被密码子优化。本领域的技术人员将认识到，基因序列可针对来自花药(anther)物种的细胞中的表达而优化，或可以使用来自大麻的野生型序列。ATGAACCACCTGAGAGCCGAAGGACCTGCCTCTGTGCTGGCCATCGTCCTGAGAACATCCTGCTGCAGGACGAGTTCCCCGACTACTAGAGCGAGCACATGACCCAGCTGAAAGAGAAGTTCCGCAAGAATGATCCGCAAGAGGAACTGCTTCCTGAACGAGGAACACCTGAAGCAGCTGGTGGAACACGAGATGCAGACCCTGGACGCCAGACAGGAAAGTGCCCAAGCTGGGCAAAGATGCCTGTGCCAAGGCCATCAAAGAGCCTAAGAGCAAGATCACCCACCTGATCTTCACCAGCGCCAGGGCGCCGATTACCACTGCGCCAAACTGCTGGGACTGAGCCCATGATGTACCAGCTGGGCTGTTACGGCGGAGGCACCGTGCTGAGAATTATCGCCGAGAACAACAAGGGCGCCAGAGTGCTGGCCGTGTG[0174]CCTGCCTGTTCAGGTTTTTGGAGATGGCGCCGCTGCTGTGATCGTGGGAGCTGAGCCGCGAAAGACCCATCTTCGAGCTGGTGTCTACCGGCCAGACCAGGGAACCATCGGCGGCCACATCAGAGAAGCCGGCCTGATCTTTGACGACGTGCCCATGCTGATCTCCAACAACATCGAGAAGTGCCTCCCATCGGCATCAGCGACTGGAACAGCATCTTCTGGATCAGGCCATCCTGGACAAGGTGGAAGAGAAGCTGCACCTGAAGTCACAGCAGACACGTGCTGTCCGAGCACGGCAACATGAGCAGCTCTACGTGATGGACGAGCTGAGGAAGCGCTCTCTGGAAGAGGGCAAGCGGATTTGAATGGGGCGTGCTGTTTGGCTTCGGCCCTGGACTATGGCAGTTAAGCACCTGATCGTGCTGAAGTTCAAGGACGAGATCACGAAAGAAGAGTTCTTCAAGACCTACGTGAACCTGGTCAACAAGGACGTGTACTGGGGCAAAGACGTGACCCAGAAGAACAAAGAGGAACCACATCGTGGAAGTGACCTTCGAGTCCGTGGAAACCATCCCCCCGCTCACGTCGGATTCGGCGACGTGTACAGATCCTTCTCN120210127A说明书22/87页ATGGGATTGAGTAGCGTGTGCACCTTCAGCTTCCAAACGAACTACCAAACCCGCACAACAACAACCCCAAGACCAGCCTGCTGTGCTACAGGCACCCATCAAGTACAGCTACAACAACTTCCCCAGCAAGCACTGCAGCTCCATCTGCAAAACAAGTGCAGCGAGAGCCTGTCTATCGCCAGCCGCCACCACCAATCAGACCGAGCCTCCAGAGTCTGACACAAGATCCTGAACTTCGGCAAGGCCTGCTGGAAGCTGCAGATTGCCTTCACCTCTTGCGCCTGCGGCCTGTTCGGAAAAGAGCATCTGATCAGCTGGTCCCTGATGTTCAAGGCCTTCTTCTTCCTGGTGTATCGCCAGCTTCACCACCACCATCAACCAGATCTACGATCTCAACAAGCCCGATCTGCCTCTGGCCTCTGGCGAGATCTCTG[0178]CATGAGCATCATCGTGGCCCTGTTCGGGCACCCCTGTACATCTTCGGCTACTGCTTCGGCATCTTCGGAGGCATCGCCTCCATTCCGCTGGAAGCAGAATCCCTCTACCGCCTTCCTACATCATTACCAACTTCACCTTCTACTACGCCAGCAGGGCCGCTCTTTGAACTGAGGCCCTCTTTCACCTTTCTGCTGGCCTTTATGAACCTGGCTCTGATCAAGGATGCCAGTGATGTGGAAGGCGACAGCACCCTGGCCTCTAAGTACGGCAGCAGAAATCTGACCCTGTGCTGCTGTCTTACGTGGCCGCTATCCTGGCCGGAATCATTTGCAGCAACGTGATGCTGCTGAGCCACGCCATTCTGGCCTTTTCAGGGATTTCGCCCTGACCAACTACGATCCTGAGGCCGGCACATGTGGAAGCTGTACTACGCCGAGTACCTGG[0181]在一些实施方式中，细胞被工程改造以表达抗TNFa纳米抗体V565(SEQIDNO:7)。用编码纳米抗体V565的异源多核苷酸转染细胞以产生表达纳米抗体V565的细胞。在一些实施方式中，多核苷酸编码与SEQIDNO:7至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的多肽。在一些实施方式中，编码V565的多核苷酸针对所关注的特定细胞中的表达被密码子优化。在一些实施方式中，编码V565的多核苷酸针对牛细胞中的表达被密码子优化。SEQIDNO:7纳米抗体V565:在一些实施方式中，V565通过柔性可裂解连接子与人TNFa连接，并且将表达通过柔性可裂解连接子与人TNFa连接的V565的多核苷酸引入到细胞中。不希望受任何特定理论CN120210127A说明书24/87页苷酸编码与SEQIDNO:8至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的多肽。在一些实个、至少8个、至少9个或至少10个AMP16的重复序列将在构建体中组装，每个重复序列由NPV连接子间隔开。[0189]在一些实施方式中，细胞被工程改造以表达丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)以抑制氨基酸序列或与其至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在一些实施方式中，SPI为TspAd5,其具有SEQIDNO:33的氨基酸序列或与其至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。MANLYNSMMLISLILCPLNEIWNSCGSSCEETCESIASGKDTPCTLQCVPGCDLRGRCIPMSLCPNKVNSSCPENEVFQECGSACPETCDTVSSGFERPCTG[0191]GYVRGYDGKCIPPEDCGKPNNDKCFCKSGYVRASTGECLAPEACGAHLGGCGPREEYRACGSACPESCESIKDVPGCFCKFPFVRGYDLRCIatggccaatctctataatagtataaagacacaccttgcactctgcagtgcgttgtttcctcgggatttgaaagaccttgcacgaatgggtatgtacgaggttatgcttctgcaaatctggcttgtccagaatcttgtgaatcSEQIDNO:33TspAd5(GenBank:EU263307.1)agattattggagaaaattgtggaattgttgtgaacgaaatcattagctgatttcgcttattcgctttatcaattggaagaagcaggaaatgtattctttcaccagtatcgatttctgatactcaactgctgaatgtgatgttcaaagctggctggaagaaaaatcgcaatgcggtcgttcgtttcatcgtggccaatcgattgtatgcttgaaaagatatctatcaagtgatttggttagtgtaaattttgtttgcagattaataagtgggtgagcgataatctggaacagttgaggcaaatcctcttgggatgaggttttcgacgaagcacatacaaagcggcgcacagttcaattaaaataccaatgatattaccaaagtcaggaaaaacacttttgttaaattggtatccaaagttagcggtgctgaagtgaaagtgacaatt