DB61T 1134-2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法

DB61DetectionandidentificationofTomatoyellowleafcurlvirus陕西省质量技术监督局发布I 12规范性引用文件 1 1 1 1 2 2 2 2 3 4 7 本标准起草单位：陕西省生物农业研究所、陕西省园艺蚕桑技术工作站、陕西学前师范学1番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法本标准适用于番茄种苗及传毒介体中携带的番茄黄化曲叶病件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T23629-2009引进植物病原生物安全控制技术要求通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR进行检测5实验用仪器设备、用具及试剂5.1仪器设备5.3试剂酶联测定试剂，PCR检测试剂，除有特殊说明外，均为分析纯26.1.3若在取样过程中发现烟粉虱，应随机采集烟粉虱，-20℃6.2.2烟粉虱样品：取单头烟粉虱按照动物基因组提取试剂盒抽提DNA，-8.1样品经酶联免疫吸附、普通PCR、实时荧光定量PCR三种方法之8.3酶联测定为阳性后，普通PCR或实时荧光PC9结果记录与样品、资料保存9.1结果记录验时间、地点、方法、结果，检验人员签字9.2样品保存经检验确定携带TYLCV的样品保存在-80℃冰箱，标酶联测定需有酶联极反应的原始数据，普通PCR检测需有电泳结果照片及序列测定报告，荧光定量PCR检测需有扩增曲线图片，生物学测定需有鉴别寄主的症状图3实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489-2008的规定进行操作，实验废弃物按照GB/T4A.1生物学特性A.1.1主要寄主作物A.1.2野生寄主A.1.3病毒侵染部位A.2病害症状A.2.1番茄受害症状：寄主植株感染TYLCV后，初期主要表现生长迟缓或停滞，顶部叶片常退绿发黄，变小变厚，叶质脆硬，叶片有褶皱、向上卷曲，叶片边缘至叶脉区域黄化节间变短，植株明显矮化，下部老叶症状不明显（见图A.1、图A.2番茄植株具有明显曲叶症状外，后期表现坐果少，果实变小，膨大速度慢，成熟期的果实不能正常转色，果实产量和商品价值均大幅度下降。A.2.2烟草受害症状：寄主植株感染病毒后，株叶脉增粗叶片脊面出现耳突，叶片有卷曲、黄化现象。A.2.3辣椒受害症状：植株受害后，叶片卷曲、黄化。5TYLCV主要分布于亚洲、非洲、欧洲、美洲、大A.4传播方式A.5粒体形态番茄黄化曲叶病毒粒体呈孪生颗粒状，大小约30nm×A.6基因组6注：溶于900mL，1×PBST中，NaOH或HCl调节pH值至7.4，定容至1000mL注：加入900mL蒸馏水溶解，HCl调节pH值到9.6。蒸馏水定容至1000mL，7PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）应符合表B注：加入900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCl调节pH值至7.4，用蒸馏水定容至1000mL，4PVP（MW24000～MW4000底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）应注：溶解于800mL蒸馏水中，盐酸调pH9.8，蒸馏水定容至1000mL孵育过夜，清空酶联孔中溶液，PBST洗涤4次～6次，每次3液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照作相应的处理或按照说8酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3孵育4h，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3m用酶联检测仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。或用肉眼和阴性对照孔的OD405值＜0.15，当阴性对照孔的OD405值＜0.05时，按0.05计反应；阴性对照OD405值/阴性对照OD405值＞2；孔的重复性B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则9C.1.1电泳缓冲液（TAE50×)电泳缓冲液（TAE50×)应符合表C.1。PCR反应体系见表C.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积适当调整。检测时以含TYLCV病毒材料的DNA或含有TYLCV目标片段的质粒作为阳性对照，以照一致的扩增条带，可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与TYLCV的序列同源性达到99以上，则可判定样品为TYLCV阳性，未扩增到543bp的条带，则DNA提取应按本标准C.2.1和C.2.2的要求进行。PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。检测时以含TYLCV材料的DNA或含有TYLCV的质作为阳性对照，以健康植物）；）；D.4.1检测样品的Ct值不小于40或无Ct值时，则判定TYLCV阴性。D.4.2检测样品的Ct