第三节动物细胞工程讲课文档

第三节动物细胞工程第一页，共38页。优选第三节动物细胞工程第二页，共38页。2动物细胞培养定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。第三页，共38页。3发展历史1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞第四页，共38页。4生长特性贴附生长型如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮生长型细胞如血液白细胞，淋巴组织细胞等第五页，共38页。5体外培养细胞基本技术体外培养特点体外培养工具体外培养条件体外细胞生长增殖过程培养方法大规模培养技术第六页，共38页。5.1体外培养特点营养条件苛刻适应性差,敏感培养时间长，易污染第七页，共38页。培养工具器皿为各种类型的培养瓶、培养皿、培养室、小室等载体：空心纤维和微珠第八页，共38页。5.2体外培养工具空心纤维微球第九页，共38页。5.3体外培养条件温度，37度pH：7.2-7.4气体，氧，二氧化碳，氮气营养条件需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供第十页，共38页。动物细胞培养基天然培养基：主要有血清，组织提取液、鸡胚汁合成培养基无血清培养基第十一页，共38页。动物细胞培养必需的溶液平衡盐水培养基pH细胞消化液：把组织解离成分散细胞胰蛋白酶消化液和EDTA溶液抗生素溶液第十二页，共38页。

5.4体外细胞生长增殖过程原代培养期传代培养期衰退期第十三页，共38页。5.5培养方法悬滴：最早由Harrison1907年创立旋转管：灌注小室培养瓶培养板第十四页，共38页。原代培养与传代培养技术1）组织快培养首先从机体获得组织快，然后放入一个培养皿中用Hanks液洗，用小剪刀剪成1mm3的组织快，加入少许培养液，塞上瓶塞置于37度培养箱培养，成单层后做传代培养。为促进细胞帖壁，也可以瓶内壁涂一层血清。第十五页，共38页。组织消化培养过程取材分离和组织消化培养过程接种、培养-常规检查第十六页，共38页。传代培养技术当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展成片，占满器皿表面。这时需要对其分离培养，这一操作过程称为传代。（1）吸取培养瓶内旧培养液。（2）加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。（3）2-5min后检查，如有细胞间隙变大或细胞质回缩现象，终止消化。（4）吸出消化液，加入Hanks液。（5）用吸管轻打瓶壁，使细胞脱落成悬浮液（6）重新接种第十七页，共38页。贴壁培养技术贴壁培养的材料：1）玻璃2）塑料

3）金属

4）微载体第十八页，共38页。基本操作1）将培养材料用物理或生物化学法分散成细胞悬浮液。2）过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。3）放入CO2培养箱培养。第十九页，共38页。生长过程及优点游离期吸附期繁殖期退化期优点：1）贴壁培养比较容易更换培养基2）容易采用灌注培养，提高细胞密度。3）更有效表达同一产品。4）方便地调节培养液和细胞比例。5）易于观察细胞生长状况。第二十页，共38页。5.6大规模培养技术悬液培养，使用微球载体微载体培养多孔载体培养微囊化培养中空纤维法第二十一页，共38页。动物细胞生物反应器培养动物细胞培养用生物反应器种类：微载体式中空纤维式：最经典，最常用灌注培养式旋转壁式第二十二页，共38页。6动物细胞培养的应用1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等，酶类，激素，病毒杀虫剂（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（3）用于检测有毒物质（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据第二十三页，共38页。动物细胞培养培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等第二十四页，共38页。动物细胞动物细胞原代培养分裂10次细胞株传代培养分裂50次(细胞系)(细胞株)细胞系无限分裂遗传物质未发生改变遗传物质发生改变无限增值第二十五页，共38页。植物体培养结果获得细胞或细胞分泌蛋白培养目的葡萄糖动物血清蔗糖植物激素液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目细胞株、细胞系植物体培养结果分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株培养目的葡萄糖动物血蔗糖植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较第二十六页，共38页。动物细胞融合第二十七页，共38页。诱导动物细胞融合的方法物理法：离心、振动、电刺激化学法：聚乙二醇（PEG）生物法：灭活的动物病毒动物细胞融合的用途制备单克隆抗体第二十八页，共38页。主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较第二十九页，共38页。采用此方法可以将两个不同种、属的动物优点集中在一起，产生具有双亲优点的可繁殖的杂种动物。细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重大意义。这一技术的成功与完善对于优良家禽的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种意义重大。第三十页，共38页。Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺DMEM培养基胎牛血清其他成分锥形瓶逐级放大培养加碱（碳酸氢钠）加糖（葡萄糖）灌注培养液微载体5L种子罐培养培养液50L生物反应器接种狂犬病毒出液口收获病毒第三十一页，共38页。6.1单克隆抗体

1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。

第三十二页，共38页。每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。

单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。第三十三页，共38页。（1）提出问题：从动物血清中分离抗体的方法产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏（2）设计方案：由于每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，就可以产生单克隆抗体。由于B淋巴细胞不能无限增殖，因此利用小鼠骨髓瘤细胞与之融合，就可达到目的。第三十四页，共38页。杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图第三十五页，共38页。单克隆抗体的应用①在基础理论研究中具有重要意义