吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑在苹果上的残留检测方法研究

导论1.1选题背景苹果原产地位于中西亚和欧洲等区域，是蔷薇科落叶果树，在全球近百个国家均有种植。苹果因果实硕大，口感宜人，富含多种营养成分和功能性成分且热量低，受到了全球消费者欢迎，它在水果市场中占有一席之地，是世界四大水果之一。苹果参与的国际贸易有鲜食和加工2种形式。中国苹果产业起步时间较晚，但发展很迅速，产量与消费水平均在世界前列。中国苹果进行人工栽培是从十九世纪末烟台引进国外优良苹果品种开始的，上世纪90年代，我国苹果种植面积和产量开始跃居世纪首位，1999年产量高达21万吨，占全球总量的30%，之后产量和全球占比稳步上升，2017年，产量达4388万吨，超过全球产量58%，2010年以来，我国年人均鲜苹果消费量13kg，是世界水平8kg的1.6倍以上[1-2]。近年来，为了防止病虫害影响农产品质量，农药在现代农业生产中的使用正变得越来越普遍，然而使用不合理就会造农药成在食品中的累积，从而导致其残留量超标，引起农产品质量和安全问题，环境和食品的污染问题也在世界范围内越来越突出，严重危害了人类的生存和发展。1.2选题目的与意义近年来，国家加强了对水果和蔬菜中杀菌剂的监测和风险评估，水果和蔬菜中12种杀菌剂的监测在2016年开展，并逐年扩大监测的杀菌剂种类[3]。检测农药残留的技术和标准是确保食品质量和安全的重要支持，只有积极优化和采用先进的农药残留检测技术，才能有效推动食品的安全消费。目前苹果所使用的杀菌剂品种中用量占市场份额较大的苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯能够为该作物的细菌、真菌病害起到防治的作用，造福人类社会，但是也会对我们赖以生存的环境和我们的人体健康造成危害。在我国制定的农药残留限量标准中，苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯在苹果上的最大残留限量值（MRL）均为0.5mg/kg[4]，因此，对甲氧基丙烯酸酯类和三唑类杀菌剂残留量的检测方法进行优化具有十分重要的意义。1.3国内外研究现状在我国，农药主要分为五类：有机杀虫剂、有机杀螨剂、有机杀菌剂、有机除草剂和植物生长调节剂。其中，有机杀菌剂主要包括二硫代氨基甲酸酯类、二甲酰亚胺类、苯并咪唑类、酞酰亚氨类、有机磷类、苯基酰胺类、甾醇生物合成抑制剂等。人体受到有机农药的污染，主要是通过食物链富集作用最终进入人体，有机农药对人体的危害主要体现在三种形式上：急性中毒、慢性中毒以及“三致”危害[5]。急性中毒通常会引起大量个体死亡，所带来的危害和影响最为严重，主要表现为肌肉痉挛、恶心、呕吐、腹泻、视力减退以及呼吸困难等。慢性农药中毒不易被发现，因为一些症状类似于一般的疲劳和头痛，并且经常被忽视。如果长时间食用含有农药的食物，农药会在人体内积累，对人体健康构成严重威胁。残留的有机农药中有一些药物会引起基因突变或者染色体畸变，对人体造成潜在危害。2017年的“毒大葱”事件相信不少人到现在仍心有余悸，农残超标再次博得舆论头条，也让大众对其恐慌空前高涨。大蒜、韭菜、樱桃、苹果、梨、芹菜、西红柿、豆角等瓜果蔬菜总是都居于农残超标的名单前列。吡唑醚菌酯是一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，它是一类低毒、高效、广谱的内吸性杀菌剂，几乎所有真菌引起的疾病，如锈病、白粉病、霜霉病等均有较理想的防治效果，可用于各种蔬菜和水果，如苹果、番茄、葡萄和马铃薯的茎、叶喷雾、土壤和种子处理。苯醚甲环唑是一种三唑类杀菌剂[6]，是甾醇脱甲基化抑制剂，具有高效、广谱、低毒、用量低的特点，其内吸性极强。它能够抑制麦角甾醇的生物合成，麦角甾醇是细胞膜的重要组成部分，在细胞膜的通透性中起着重要的作用。除此之外，还会破坏细胞膜的结构功能，从而达到杀菌目的，对蔬菜和水果的纹枯病、锈病、早疫病、叶斑病、黑星病、白粉病等具有良好的保护和治疗作用，具有持效期长，与其他杀菌剂无交互抗性，不污染农产品，不伤害天敌的优点[7-8]。随着现代分析化学技术的不断进步，农药残留检测方法也得到了迅速发展。目前用于检测吡唑醚菌酯残留的方法有LC、GC、LC-MS/MS和GC-MS[9-10]，国外有一种通过使用免疫亲和柱结合液相色谱检测果汁中吡唑醚菌酯的方法。吡唑醚菌酯残留的检测方法根据基质特性、仪器检测条件和目标要求而变化。乙腈是样品提取过程中最常用的提取溶剂。使用C18、PSA或GCB作为填料的SPE（固相萃取）已经被广泛使用，并且使用双柱进行净化的效果优于单柱的效果。目前用于苯醚甲环唑残留检测的技术主要是气相色谱法、高效液相色谱法和其他方法，如质谱法、表面增强拉曼光谱和酶联免疫吸附技术[11]，目前用于苯醚甲环唑残留检测的方法主要是采用质谱法，但是质谱法对于复杂基质会出现假阳性结果。从当前的发展趋势来看，采用串联质谱法建立苯醚甲环唑残留检测方法，开展苯醚甲环唑残留精准筛查已成为研究的重点。对杀菌剂进行前处理的技术包括固相萃取、固相微萃取、凝胶色谱及QuEChERS[11]等。目前，QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)前处理技术结合高效液相色谱串联质谱是快速分析杀菌剂多残留的发展趋势[12-13]。高效液相色谱-串联质谱法(highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry，HPLC-MS/MS)是一种高效率、高特异性和高灵敏度的普适性方法，最明显的优点是它可以大大缩短仪器分析时间[14-16];目前，样品前处理和仪器条件选择都存在优缺点，对于同时检测苹果中的苯醚甲环唑以及吡唑醚菌酯两种农药的残留量的报道还很少。1.4研究内容通过QuEChERS净化-高效液相色谱串联质谱法和GB/T20768-2008检测苹果中吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑这两种农药残留。该研究旨在使用QuEChERS进行样品前处理，高效液相色谱串联质谱技术进行检测分析，从而能够建立和优化同时检测苹果中苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯残留量的方法，为监测蔬菜和水果中的农药残留提供方法支持，减少甲氧基丙烯酸酯类和三唑类杀菌剂残留引起的食品安全问题。2材料与方法2.1试验材料与试剂2.1.1材料苹果样品购自太原市小店区美特好超市，去果柄，用刀式研磨仪搅碎，于－18℃下密封保存，标明标记，备用。2.1.2试剂苯醚甲环唑标准品，99.9%，Dr.EhrenstorferGmbH吡唑醚菌酯标准品，99.5%，Dr.EhrenstorferGmbH乙腈：HPLC，>99.9%，TediaCompany，Inc，USA甲醇：LC-MS，>99.9%，默克股份两合公司，德国甲苯：HPLC，>99.9%，TediaCompany，Inc，USA甲酸：fisherchemical，>88%，赛默飞世尔科技（中国）有限公司乙酸铵：色谱纯，>99.0%，天津市光复精细化工研究所氯化钠：A.R.,>99.0%，北京化工厂纯净水：WatsonsWater屈臣氏饮用水广州屈臣氏食品饮料有限公司2.2主要仪器与设备净化管：2mL离心管，内装25mgPSA、25mgC18，岛津技迩（上海）商贸有限公司离心管：50mL，CORNING，CorningIncorporated，MadeinChina滤膜：NY，0.22µm×13mm，岛津技迩（上海）商贸有限公司注射器：A3型1mL，江西青山堂医疗器械有限公司旋转蒸发仪，RE-52A,上海亚荣生化仪器厂氮吹仪，WD-12，杭州奥盛仪器有限公司串联液质联用仪：HPLCI-ClassXEVOTQ-SMicro，WaterscorporationUSA天平：0.1mg，BS210S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司天平：0.1g，CAP8201，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司天平：0.1g，TP6101，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司刀式研磨仪：GM300，RetschGmbH，HaanGermany离心机：Centrifuge5804R，EppendorfGermany离心机：Centrifuge5424R，EppendorfGermany多管涡旋混合仪：TBOYSMULTI.TUBEVORTEXER945066，TroemnerLLC快速混匀器：XK80-A，江苏新康医疗器械有限公司2.3溶液配制4mmol/L乙酸铵甲醇溶液（含0.1%甲酸）：准确称取0.308g乙酸铵至1000mL容量瓶中，加入1mL甲酸，用甲醇定容至刻度线，摇匀，备用。4mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）：准确称取0.308g乙酸铵至1000mL容量瓶中，加入1mL甲酸，用水稀释定容至刻度线，摇匀，备用。标准储备溶液：准确称取10.0mg（精确至0.1mg）的苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯标准品，溶解于乙腈，定容至10mL容量瓶中，此溶液浓度为1000µg/mL，作为标准储备溶液；≤-18℃冷冻保存，有效期6个月。标准工作溶液：量取适量的标准储备溶液，用乙腈稀释成至浓度为100µg/mL、10µg/mL（2个月有效期）、1µg/mL、0.1µg/mL（现配现用）的混合标准溶液。2.4试验方法2.4.1提取和净化2.4.1.1GB/T20769-2008国标方法准确称取20.0g苹果样品于80mL具塞离心管中，加入40.0mL乙腈，并以15000r/min的转速匀浆1min，加5g氯化钠，继续匀浆1min，再于8000r/min的转速下离心5min。取20ml上清液，水浴中旋转浓缩至1ml（水浴温度为40℃），等待净化。将无水硫酸钠装入Sep-PakVac柱中，加入量约为柱高的2cm,并置于固定架上，固定架下端接有鸡心瓶。在加入样品之前用4ml乙腈+甲苯（3+1）预先洗柱，等到液面至硫酸钠的顶端时，将样品浓缩液快速转移到净化柱上，并用新的鸡心瓶代替接收。然后每次用2ml乙腈+甲苯（3+1）洗涤样液瓶，洗涤3次，并将洗涤液转移到柱中。在柱上加上50ml注液器，用25ml乙腈+甲苯（3+1）洗脱苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯，再合并到鸡心瓶中，在40℃水浴中进行旋转浓缩，浓缩至0.5ml。用氮吹仪将浓缩液吹干，迅速加入1ml的乙腈+水（3+2），混匀，通过0.22µm有机滤膜过滤后，用液相色谱-串联质谱进行测定[16]。2.4.1.2QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法将10.0g苹果样品准确称取至量程为50mL的具塞离心管中，加入10.0mL乙腈以及5.0g氯化钠，于2500r/min涡旋振荡提取10min，再于8000r/min下离心5min。吸上清液1.5mL加入装有25mgPSA、25mgC18的2mL离心管，2500r/min涡旋分散固相萃取3min，5000r/min离心2min，上清液过0.22µm有机滤膜后，吸0.5mL加0.5mL水，混匀，待液相色谱-串联质谱测定。2.4.2仪器检测2.4.2.1液相色谱条件色谱柱：WatersACQUITYHPLCBEHC18，50mm×2.1mm，1.7µm，SN：02973711115141；柱温：40℃；样品盘温度：15℃；流速：0.3mL/min；进样量：5µL；流动相采用梯度模式，具体梯度洗脱条件参数见表2-1。表2-1梯度洗脱条件参数表t/min流速(mL/min)A%B%0.00.390101.00.390101.10.310903.00.310903.10.390105.00.39010注：流动相A:4mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）流动相B:4mmol/L乙酸铵甲醇溶液（含0.1%甲酸）2.4.2.2质谱条件以正离子模式扫描两种200μg/L的吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑标准溶液，确定化合物的母离子，并选择具有较强丰度和较小干扰的两个子离子作为定性和定量离子，吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑2种杀菌剂质谱参数见表2-2。表2-2质谱条件表名称保留时间(min)定性离子对(M/Z)定量离子对(M/Z)Dwells（s）锥孔电压（V）碰撞能量(V)吡唑醚菌酯2.11388.0/163.1-0.0813028388.0/194.0388.0/194.00.0813010苯醚甲环唑2.16406.0/110.9-0.0813760406.0/251.0406.0/251.00.0813725离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：3.5KV；DesolvationTemp(℃)：300；Desolvation（L/Hr）：800；碰撞气体：氩气，纯度>99.999%；检测方式：多重反应监测（MRM）2.4.3定性测定在相同的实验条件下测定样品时，如果检测出的色谱峰的保留时间与相应的标准样品一致，并且在扣除背景后的样品检测质谱图中，存在所选的离子，并且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（相对丰度＞50％，允许±20％偏差；相对丰度＞20％～50％，允许±25％偏差；相对丰度＞10％～20％，允许±30％偏差；相对丰度≤10％，允许±50％偏差），则可以确定样品中含有这种农药。2.4.4定量测定液相色谱-串联质谱进行定量测定的方法为外标-校准曲线法。为了减少基质对定量测定结果的影响，应选择基质混合标准工作溶液绘制标准曲线，并确保所检测的样品中该种农药的响应值符合仪器的线性范围。2.4.5标准曲线的绘制基质混合标准工作溶液配制：准确称取苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯标准品(精确至0.1mg)，用乙腈（液谱级）溶解并定容至10.0ml，以制配成标准母液。用苹果空白对照样品溶液，配制成0.0025、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25mg/kg的标准工作液，进样5µL，分别以苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。2.4.6添加回收率试验分别取已制备好并经检测不含目标化合物的苹果样品，并加入一定量的苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯标准溶液，放置30min以上，按照“2.4.1”的方法进行提取和净化，根据“2.4.2”的条件测定回收率并计算相对标准偏差。在苹果中苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯的添加水平为0.01、0.1、0.5mg/kg，每个浓度重复5次。2.4.7结果计算按式（1）计算试样中苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯残留量：(1)式中：X——样品中苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c——由标准曲线得出的测定液中苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；V——测定液定容体积，单位为毫升（mL）；f——样品稀释倍数；m——样品质量，单位为克（g）。测定结果保留两位有效数字。3结果与分析3.1提取和净化条件优化由于水果基质复杂，所以在提取杀菌剂时，通常伴随着色素和糖类等提取物，易产生干扰和基质效应，通过采用GB/T20769-2008和QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法两种实验方法比较样品前处理技术，发现国标所用固相萃取法所需设备繁杂，操作步骤繁琐耗时长，需要匀浆、浓缩、换相，提取液乙腈用量40mL；而采用QuEChERS方法净化样品，所需的设备也较为简单，提取液乙腈用量10mL，基质分散萃取后即可进样，减少环境污染、节约经济成本;单个样品预处理时间小于15min，可有效去除极性有机酸、脂类、糖类、蛋白质、类胡萝卜素和叶绿素等，结果回收率十分满意，且操作快速、简便、廉价、高效、可靠、安全。故选择QuEChERS方法净化样品。3.2方法线性范围以各杀菌剂的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。浓度x（µg/mL）与响应值y(峰面积）呈线形相关：苯醚甲环唑y=2E+0.7x+30729R2=0.9996吡唑醚菌酯y=7E+0.7x+175275R2=0.9994结果表明，标准溶液质量浓度与其相对应的色谱峰峰面积在所选定的质量浓度范围内呈现良好的线性关系，可以用来进行样品中吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑的定量分析。线性方程及相关系数见表3-1、表3-2和图3-1、图3-2,标准溶液色谱图见附录1。表3-1苯醚甲环唑在苹果中的响应值序号浓度mg/L峰面积或峰高123平均值10.00255348551322507825186320.0051001879808510303810043730.0119381221358420715220484940.0510437471079156976552103315250.1191337719126351930521191884460.254695811465903847329234695924表3-2吡唑醚菌酯在苹果中的响应值序号浓度mg/L峰面积或峰高123平均值10.002522975422211022077522421320.00542776042724842703742734830.0183560885925085165984883940.05414248241545034068391412179250.1777153577845447803377778648560.2518650226185902441847937418573281图3-1苯醚甲环唑苹果标准曲线图3-2吡唑醚菌酯苹果标准曲线3.3回收率3.3.1正确度正确度通过添加回收率试验来评价。按2.4.1描述进行前处理，进行加标回收。QuEChERS净化-高效液相色谱串联质谱法和国标方法的平均回收率分别在75%～97%和91%～97%之间。符合《农作物中农药残留试验准则》（NY/T788-2018）的要求[18]。结果见表3-3、表3-4。具体参数参见附录2，色谱图见附录3。表3-3QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯添加回收率农药名称添加浓度mg/kg回收率（%）RSD（%）12345平均值苯醚甲环唑0.0198949795989620.189979999989640.57370758080756吡唑醚菌酯0.0196969995989710.1919698100999740.58281818283821表3-4GB/T20769-2008方法苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯添加回收率农药名称添加浓度mg/kg回收率（%）RSD（%）12345平均值苯醚甲环唑0.019410099969793100.59487988198918吡唑醚菌酯0.019710110298919840.596989897989713.3.2精密度精密度的衡量标准是添加回收率试验的相对标准偏差。在上述添加回收率试验中，QuEChERS净化-高效液相色谱串联质谱法和GB/T20769-2008方法的相对标准偏差分别在1%～6%和1%～10%之间。符合《农作物中农药残留试验准则》（NY/T788-2018）的要求[17]，结果见表3。3.4定量限10倍信噪比(S/N)计算定量限(limitofquantification,LOQ)。我国已制定苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯在苹果上的MRL值均为0.5mg/kg,两种方法对两种农药的定量限为0.01mg/kg。4结论通过在QuEChERS方法中选择萃取剂的类型，以及对净化剂PSA、C18种类和用量的选择，优化超高效液相色谱-串联质谱最佳条件，建立了用QuEChERS净化-高效液相色谱串联质谱法检测苹果中吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑2种杀菌剂，该方法是高通量、快速分析的方法。结果表明：在0.0025～0.25mg/kg范围内,吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑的质量浓度与相对应的峰面积间呈良好的线性关系，相关系数分别为均大于0.99。定量限(LOQ)在0.01mg/kg；QuEChERS净化-高效液相色谱串联质谱法在0.01、0.1、0.5mg/kg3个添加水平下，平均添加回收率在75%～97%之间。而GB/T20769-2008国标方法在0.01、0.5mg/kg2个添加水平下的平均添加回收率则在91%～98%之间，两种方法的相对标准偏差(RSD)分别在1%～6%和1%～10%之间。该方法简便、快速、准确度高、成本低廉，可用于同时检测苹果中吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑在苹果上的残留量。并且，此方法有高通量、对基体干扰少、能高效率萃取、分析速度快、操作放便简单、溶剂消耗少、成本低等特点，满足现如今的发展对食物中残留检测的高通量和高效率要求，有利于保护人民群众身体健康，对维护食品安全有着重要意义。

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致谢时光飞逝，在象牙塔的这四年转眼间就要画上句号。回首四年时光中的点点滴滴，心中倍感幸福和充实。这篇毕业论文的撰写，让我感受到努力是一种幸福，心中也不禁泛起波澜，感慨良多。感谢我的母校山西工商学院，是它给我提供了良好的学习环境；感谢我的导师—张持晨教授和指导老师—王媛媛老师，在我论文的写作过程中，不论是选题方向、论文框架还是细节修改，他们都给予了我耐心的指导，提出了许多宝贵的意见与建议，使我能够顺利完成论文的写作；感谢我的实验指导老师—王霞老师，在实验过程中，王老师就像一位慈祥的母亲，在指导我们实验的同时，不忘记关心我们的生活；感谢我的父母，是他们在背后默默的奉献与支持，才让我毫无后顾之忧，能全身心投入到本篇论文的撰写中来；感谢四年以来授课的各位老师，是他们的兢兢业业的教导，才使我掌握了诸多食品质量与安全的相关知识。此外，我最要感谢的是旅游与酒店管理学院院长王丽娟，她对我严厉的教诲和无微不至的关爱，是我完成此篇论文最大的动力。在此，诚恳地请各位老师对我论文中的缺陷批评指正，使我在未来的工作中能及时完善论文的不足之处。最后，我要向百忙之中抽时间参加我论文答辩的各位老师表示衷心的感谢！ 附录1基质标准溶液色谱图0.0025mg/kg添加浓度0.005mg/kg添加浓度0.01mg/kg添加浓度0.05mg/kg添加浓度0.1mg/kg添加浓度0.25mg/kg添加浓度注：bzmjz:吡唑醚菌酯bmjhz:苯醚甲环唑附录2残留试验添加回收率计算表农药介质（g）添加浓度mg/kg编号标准浓度(μg/ml)标准峰面积样品峰面积浓缩倍数样品含量mg/kg回收率%平均回收率%标准偏差%相对标准偏差%苯醚甲环唑苹果10g0.01G110.005701416881120.0098989622G126591120.009494G136780720.009797G146646420.009595G156886720.0098980.1G160.0572692164637620.089899644G1770633220.09797G1871838120.09999G1971824520.09999G2071433820.098980.5G210.254672805339870820.36737556G22324783820.3570G23349609420.3775G24374043120.4080G25372382420.4080残留试验添加回收率计算表农药介质（g）添加浓度mg/kg编号标准浓度(μg/ml)标准峰面积样品峰面积浓缩倍数样品含量mg/kg回收率%平均回收率%标准偏差%相对标准偏差%吡唑醚菌酯苹果10g0.01G110.00530888729786220.0096969711G1229640020.009696G1330463320.009999G1429465320.009595G1530198720.0098980.1G160.053139673285104820.0919197440969609898G19312560520.100100G20310984920.099990.5G210.25185342481520669220.41828211G221499919820.4081G231495957320.40