（正式版）DB37∕T 4879-2025 《大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法》

37MethodfortheseparationandidentificationofepiphyticandendophyticbacteriaofmacroalgaeI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。2大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法GB/T6682—2008分析实验室用水规格和GB/T30744—2014深海微生物样品前处理技DB37/T4092—2020鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术4试剂与耗材4.1.6生理盐水：0.9％的NaCl溶液。3经121℃,20min灭菌处理。向配置好的0.9%的NaCl溶液中添加甘油，至终浓度为15%(V/V),将配置好的保种液置于封闭容器储存。121℃,20min灭菌处理。4.1.8Zobell2216E培养基：5.0g蛋白胨，1.0g酵母膏，0.01gFePO₄4,20.0g琼脂(固体培养基添加),1000mL陈海水，pH7.4～7.8。121℃灭菌20min。4.2.1细菌基因组DNA提取试剂盒(市售)。4.2.2枪头：材料为聚丙烯的微量加样器套头，规格为0.2mL、1.0mL和5.0mL。4.2.3冻存管：材料为聚丙烯，或其它可耐121℃高温和液氮的塑料管，容积大于或等于2.5mL。5.1生化培养箱：培养室温度能在0℃~60℃范围内调节。5.2振荡培养箱：培养室温度能在0℃~60℃范围内调节，转速能在0r/min～300r/min范围内调节。5.3电子天平：精度为0.01g。5.4玻璃试管：直径×长度为18mm×180mm的平口玻璃试管和直径×长度为15mm×150mm的平口玻5.5锥形瓶：容量为250mL的广口玻璃锥形瓶。5.6脉冲场电泳仪系统：最高输出电压350V,电压连续可调，最大输出电流0.5A,转换范围50ms到18h,转换角度为0°~360°,包括电泳仪、水浴循环仪和电冰槽。5.7其他生物实验常规仪器：超净工作台、漩涡振荡器采用随机抽样的方法，选取生长状态良好、长势一致的藻类样本，每株样本的重量约为30g;样本处理前应置于原位海水中或在4℃冰箱中保存(不超过24h),2h内处理分析。用121℃,20min灭菌过滤后的海水洗涤清除藻体表面附加的沙粒、沉积物、食草动物和杂藻，备用。称取藻体样品2.00g(精确至0.01g),用灭菌封口膜封口，使用振荡培养箱(温度25℃,转速200r/min)振荡30min,获取藻体表面分离的附46.2.2.1取洗净的藻体样品2.00g放入烧杯中，先用75%乙醇浸泡，后用2.5%的次氯酸钠溶液浸泡，浸泡时间根据藻体种类及实际情况确定，浸泡后的藻体使用超纯水清洗5次以上。为了确定除菌是否彻底，可将最后一次冲洗液接种在2216E平板上，若无菌落生长则认为藻体表面除菌彻底。藻体表面除菌效果记录表，见附录A。6.2.2.2取6.2.2.1中表面除菌彻底的藻体置于无菌研钵中，加入18mL生理盐水研磨，获取内生细7.1.1.1取1mL附生细菌悬液(6.2.1),加入生理盐水进行10倍系列稀释，获得稀释倍数分别为10倍、100倍和1000倍的样品稀释液，振荡混匀，备用。7.1.1.2取6.2.1和7.1.1.1制备的样品各100μL,分别涂布于Zobell2216E固体培养基上。25℃培养72h,每24h观察记录单菌落形态特征，记录表格见附录B。7.1.2.1取1mL内生细菌悬液(6.2.2.2),加入生理盐水进行10倍系列稀释，获得稀释倍数10倍、100倍和1000倍的样品稀释液，振荡混匀，备用。7.1.2.2取6.2.2.2和7.1.2.1制备的样品各100μL,分别涂布于Zobell2216E固体培养基上。25℃培养72h,每24h观察记录单菌落形态特征，记录表格见附录B。7.2.1根据菌落生长状况及菌落形态特征，选择合适稀释度(每培养皿30个~300个菌落)的培养皿，a)菌落数在30左右的培养皿，每个菌落都挑取，进行划线纯化；b)菌落数在50左右的培养皿，挑取1/2个培养皿上的单菌落，进行划线纯化；c)菌落数在100左右的培养皿，挑取1/4个培养皿上的单菌落，进行划线纯化；d)菌落数大于100的培养皿，挑取特殊的其它培养皿上没有出现过的菌落，进行划线纯化。7.2.2观察划线菌落形态特征是否一致，如不一致，再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养菌株，将获得的纯培养菌株(7.2.2)接种于斜面培养试管，培养获得适龄斜面菌苔，加入4.5mL灭菌后的生理盐水通过漩涡振荡器振荡得到菌悬液。按照GB/T30744相关规定，进8.1.2细菌基因组16SrRNA基因扩增5GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’)对对扩增所得的PCR产物进行电泳检测，按照DB37/T4092—2020对检测合格的PCR产物进行Sanger测序，测序结果与模式菌数据库EzBioCloud进行序列比对，选取保藏的菌种不能反复冻融，如取用保藏菌株，需及时63min5min3min5min10m