基于BALB-c小鼠模型的蟹类过敏原特性与致敏机制解析

基于BALB/c小鼠模型的蟹类过敏原特性与致敏机制解析一、引言1.1研究背景与意义食物过敏作为一种由免疫系统介导的不良反应，近年来在全球范围内的发病率呈显著上升趋势。据统计，全球约有2-25%的人口受到食物过敏的影响，且这一数字仍在持续增长。食物过敏不仅会对患者的生活质量造成严重影响，如限制饮食选择、影响社交活动等，还可能导致严重的健康问题，在极端情况下甚至会危及生命。常见的食物过敏原包括牛奶、鸡蛋、花生、坚果、鱼类、贝类以及小麦等。其中，甲壳类水产品过敏是较为常见的食物过敏类型之一，而蟹类作为深受人们喜爱的甲壳类美食，因其独特的风味和丰富的营养，在全球范围内拥有广泛的消费群体。然而，随着蟹类消费量的不断增加，蟹类过敏的问题也日益凸显。蟹类过敏属于IgE介导的I型超敏反应，是机体对蟹类中的某些蛋白质产生的异常免疫应答。当过敏体质的个体首次接触蟹类过敏原时，机体会产生特异性IgE抗体，并与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE受体结合，使机体处于致敏状态。当再次接触相同过敏原时，过敏原会与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE抗体特异性结合，导致细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯等生物活性介质，从而引发一系列过敏症状。这些症状可累及多个系统，如皮肤出现红斑、风团、瘙痒；口咽部出现唇、舌、眼部瘙痒、刺激和轻度肿胀；呼吸道出现鼻痒、鼻塞、流涕、打喷嚏、呼吸困难；胃肠道出现恶心、呕吐、腹痛、便血等。严重的蟹类过敏反应可导致过敏性休克，如不及时治疗，可能会导致患者死亡。例如，有研究报道了多起因食用螃蟹而导致过敏性休克的病例，这些患者在食用螃蟹后短时间内出现了血压下降、呼吸困难、意识丧失等症状，经过紧急抢救才得以脱险。目前，对于蟹类过敏的诊断主要依靠病史询问、皮肤点刺试验、血清特异性IgE检测以及食物激发试验等方法。然而，这些方法存在一定的局限性，如皮肤点刺试验和血清特异性IgE检测可能出现假阳性或假阴性结果，食物激发试验虽然是诊断食物过敏的金标准，但存在一定的风险，可能会诱发严重的过敏反应。此外，由于不同个体对蟹类过敏原的敏感性和反应程度存在差异，使得准确诊断和治疗蟹类过敏变得更加困难。为了深入了解蟹类过敏的发生机制，寻找有效的防治方法，建立合适的动物模型是非常必要的。动物模型可以模拟人类过敏的过程，为研究蟹类过敏原的致敏机制、筛选和评价抗过敏药物以及开发低致敏性食品提供重要的工具。在众多动物模型中，BALB/c小鼠因其遗传背景清楚、免疫反应敏感且稳定等优点，被广泛应用于食物过敏的研究。通过构建BALB/c小鼠蟹类过敏模型，可以在可控的实验条件下，研究蟹类过敏原对小鼠免疫系统的影响，观察过敏症状的发生发展过程，分析相关免疫指标的变化，从而为揭示蟹类过敏的分子机制和细胞机制提供理论依据。同时，利用该模型还可以评估不同处理方法对蟹类过敏原致敏性的影响，为开发低致敏性的蟹类产品提供实验基础，对于保障消费者的健康和安全具有重要的现实意义。1.2国内外研究现状在蟹类过敏原的研究方面，国内外学者已取得了一系列重要成果。国外研究起步较早，对甲壳类动物主要过敏原原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）的研究较为深入。大量研究证实，TM在甲壳类动物中高度保守，是引发过敏反应的关键蛋白。例如，通过对多种虾蟹类的研究发现，TM的氨基酸序列具有较高的相似性，其结构和功能在不同物种间相对稳定，这使得它成为过敏原研究的重点对象。同时，国外研究还关注到不同蟹类过敏原的特性差异，以及这些差异对过敏反应的影响。国内研究近年来也在不断深入，一方面对中华绒螯蟹、锯缘青蟹和三疣梭子蟹等本土重要经济蟹类的过敏原进行了研究。首次证实了中华绒螯蟹的主要过敏原为原肌球蛋白，并对其进行了重组表达，为今后蟹类过敏原的标准化生产提供了技术参考。另一方面，国内研究还从免疫检测、分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达等多个方面对蟹类过敏原展开全面探索。采用免疫印迹法，利用过敏患者血清，确定了中华绒螯蟹的主要过敏原为分子量约为某特定值的蛋白，同时发现其它多个次要过敏蛋白组分也参与了过敏反应。在BALB/c小鼠蟹类过敏模型的构建与应用上，国内外研究均有涉及。国外研究主要集中在优化模型构建方法，提高模型与人类过敏反应的相似性，以及利用模型深入探究过敏反应的分子机制和信号通路。通过对小鼠模型的研究，揭示了一些与过敏相关的关键基因和蛋白的作用机制，为开发新的治疗方法提供了理论基础。国内研究则更注重结合本土蟹类资源，研究不同蟹类过敏原在小鼠模型中的致敏性差异，以及利用模型评估低致敏性食品和抗过敏药物的效果。通过建立锯缘青蟹原肌球蛋白和精氨酸激酶的BALB/c小鼠模型，对这两种过敏原的致敏性进行评价，发现腹腔注射和灌胃方式均可使小鼠出现过敏症状，但腹腔注射方式的效果更好，且两种过敏原致敏后小鼠的免疫指标变化存在一定差异。然而，当前研究仍存在一些不足之处和待解决的问题。在过敏原研究方面，虽然已确定了一些主要过敏原，但对于次要过敏原的研究还不够深入，它们在过敏反应中的具体作用机制尚不清楚。不同蟹类过敏原之间的交叉反应性研究也有待加强，这对于准确诊断和治疗蟹类过敏具有重要意义。在小鼠模型研究中，目前的模型虽然能够模拟部分过敏症状，但与人类实际过敏情况仍存在一定差距，如何进一步优化模型，使其更真实地反映人类过敏的复杂过程，是亟待解决的问题。此外，利用小鼠模型筛选和评价抗过敏药物及低致敏性食品时，缺乏统一的标准和规范，导致研究结果的可比性和可靠性受到一定影响。1.3研究目标与内容本研究旨在通过构建BALB/c小鼠蟹类过敏模型，深入探究蟹类过敏原的致敏机制，为蟹类过敏的预防和治疗提供理论依据。具体研究目标如下：成功构建稳定可靠的BALB/c小鼠蟹类过敏模型，通过多种检测方法评估模型的有效性和重复性，确保模型能够准确模拟人类蟹类过敏的过程和症状。利用构建的小鼠模型，研究蟹类过敏原对小鼠免疫系统的影响，分析过敏反应过程中相关免疫细胞、免疫因子以及信号通路的变化，揭示蟹类过敏的致敏机制。通过对小鼠模型的研究，评估不同处理方法对蟹类过敏原致敏性的影响，为开发低致敏性的蟹类产品提供实验基础和技术支持。基于以上研究目标，本研究的主要内容包括以下几个方面：蟹类过敏原的提取与纯化：选取常见的经济蟹类品种，如中华绒螯蟹、锯缘青蟹等，采用物理、化学和生物技术相结合的方法，从蟹肉、蟹黄等组织中提取蟹类过敏原。运用等电点沉淀、硫酸铵盐析、柱层析等技术对提取的过敏原进行纯化，得到高纯度的过敏原蛋白，并通过蛋白质电泳、免疫印迹等方法对其进行鉴定和分析，确定过敏原的种类、分子量、等电点等特性。BALB/c小鼠蟹类过敏模型的构建：选取健康的BALB/c小鼠，随机分为实验组和对照组。实验组小鼠采用腹腔注射、灌胃等不同方式给予蟹类过敏原进行致敏，对照组小鼠给予等量的生理盐水。在致敏过程中，观察小鼠的过敏症状，如皮肤瘙痒、搔抓、呼吸急促、腹泻等，并根据过敏症状的严重程度进行评分。通过多次致敏和激发，建立稳定的BALB/c小鼠蟹类过敏模型。模型的评价与验证：采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中特异性IgE、IgG1、IgG2a等抗体的水平，分析抗体水平与过敏症状之间的相关性。检测小鼠粪便中组胺的含量，评估组胺在过敏反应中的作用。利用流式细胞术分析小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中免疫细胞的数量和比例变化，如Th2细胞、Th17细胞、调节性T细胞等，了解免疫细胞在过敏反应中的动态变化。通过以上多种方法对构建的小鼠模型进行全面评价和验证，确保模型的可靠性和有效性。蟹类过敏致敏机制的研究：在建立的小鼠模型基础上，深入研究蟹类过敏的致敏机制。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）等技术，检测过敏反应过程中相关免疫因子（如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等）、转录因子（如GATA3、T-bet等）以及信号通路关键分子（如STAT6、NF-κB等）的表达变化，探讨它们在蟹类过敏中的作用机制。利用细胞培养技术，分离和培养小鼠的脾脏细胞、淋巴细胞等，在体外给予蟹类过敏原刺激，进一步研究免疫细胞的活化、增殖和分化情况，以及免疫因子的分泌规律，从细胞和分子水平揭示蟹类过敏的致敏机制。低致敏性蟹类产品的开发研究：针对蟹类过敏原的特性，采用物理、化学和生物等多种处理方法，如热加工、酶解、发酵等，对蟹类原料进行处理，降低其过敏原性。利用构建的小鼠模型，评估不同处理方法对蟹类过敏原致敏性的影响，通过检测小鼠的过敏症状、血清抗体水平、免疫细胞变化等指标，筛选出效果最佳的处理方法和工艺条件。对处理后的蟹类产品进行营养成分、风味品质等方面的分析，确保在降低过敏原性的同时，不影响产品的营养价值和食用品质，为开发低致敏性的蟹类产品提供技术支持和理论依据。1.4研究方法与技术路线本研究将综合运用多种实验方法，以确保研究目标的实现。具体实验方法如下：蟹类过敏原的提取与纯化：选取新鲜的中华绒螯蟹、锯缘青蟹等蟹类样本，去除外壳和内脏，取蟹肉和蟹黄组织。将组织剪碎后，加入适量的磷酸盐缓冲液（PBS），在冰浴条件下进行匀浆处理。匀浆液经离心后，取上清液作为粗提液。采用等电点沉淀法，根据蟹类过敏原的等电点特性，调节粗提液的pH值，使过敏原蛋白沉淀析出。将沉淀溶解于适量的PBS中，再用硫酸铵盐析法进一步分离过敏原蛋白。通过调整硫酸铵的饱和度，使不同的蛋白质分步沉淀，收集含有过敏原的沉淀部分。采用凝胶过滤层析、离子交换层析等柱层析技术对盐析后的蛋白进行纯化，去除杂质，得到高纯度的蟹类过敏原蛋白。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分析纯化后过敏原蛋白的分子量，通过免疫印迹（Westernblot）技术，使用特异性抗体鉴定过敏原的种类。BALB/c小鼠蟹类过敏模型的构建：选取6-8周龄的健康雌性BALB/c小鼠，适应性饲养一周后，随机分为实验组和对照组，每组若干只。实验组小鼠采用腹腔注射和灌胃两种方式进行致敏。腹腔注射组小鼠每次给予一定剂量的蟹类过敏原与弗氏完全佐剂（初次致敏）或弗氏不完全佐剂（后续致敏）的混合液，注射体积为每只小鼠0.2mL，每周注射一次，共注射4-6次。灌胃组小鼠每次给予一定剂量的蟹类过敏原溶液，灌胃体积为每只小鼠0.2mL，每周灌胃2-3次，共灌胃8-10次。对照组小鼠给予等量的生理盐水，注射或灌胃方式与实验组相同。在每次致敏后，密切观察小鼠的过敏症状，包括皮肤瘙痒、搔抓次数、呼吸频率、腹泻情况等，并按照标准的过敏症状评分表进行评分。模型的评价与验证：在末次致敏后的特定时间点，采集小鼠的血液样本，分离血清，采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中特异性IgE、IgG1、IgG2a抗体的水平。具体操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行，通过酶标仪测定吸光度值，计算抗体含量。收集小鼠的粪便样本，采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术检测粪便中组胺的含量，分析组胺水平与过敏症状之间的关系。取小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结组织，制备单细胞悬液，利用流式细胞术检测其中Th2细胞（CD4+IL-4+）、Th17细胞（CD4+IL-17+）、调节性T细胞（CD4+Foxp3+）等免疫细胞的数量和比例变化，了解免疫细胞在过敏反应中的动态变化。蟹类过敏致敏机制的研究：提取小鼠脾脏和肠系膜淋巴结细胞的总RNA，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测过敏反应过程中相关免疫因子（如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等）、转录因子（如GATA3、T-bet等）以及信号通路关键分子（如STAT6、NF-κB等）的mRNA表达水平。以β-actin为内参基因，通过比较Ct值计算目的基因的相对表达量。提取小鼠脾脏和肠系膜淋巴结细胞的总蛋白，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测上述免疫因子、转录因子和信号通路关键分子的蛋白表达水平。通过电泳、转膜、封闭、一抗和二抗孵育等步骤，最后利用化学发光法显影，分析蛋白条带的灰度值，确定蛋白表达量的变化。分离和培养小鼠的脾脏细胞、淋巴细胞等，在体外给予蟹类过敏原刺激，培养一定时间后，收集细胞培养上清液，采用ELISA或细胞因子芯片技术检测免疫因子的分泌情况。同时，利用细胞增殖实验（如CCK-8法）检测免疫细胞的增殖能力，通过流式细胞术分析免疫细胞的活化和分化情况。低致敏性蟹类产品的开发研究：采用热加工（如蒸煮、烘焙）、酶解（如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶）、发酵（如乳酸菌发酵）等处理方法对蟹类原料进行处理，改变过敏原的结构和性质，降低其过敏原性。将处理后的蟹类样品制成匀浆，按照上述小鼠过敏模型的构建方法，对小鼠进行致敏和激发，观察小鼠的过敏症状，并检测血清抗体水平、免疫细胞变化等指标，评估不同处理方法对蟹类过敏原致敏性的影响。采用正交试验等方法优化处理工艺条件，筛选出效果最佳的处理方法和工艺参数组合。对处理后的低致敏性蟹类产品进行营养成分分析，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质等含量的测定，同时采用感官评价、质构分析、风味物质检测等方法对产品的风味品质进行评价，确保产品在降低过敏原性的同时，保持良好的营养价值和食用品质。本研究的技术路线如图1-1所示：蟹类过敏原提取与纯化：选取蟹类样本，处理组织后匀浆离心获取粗提液，经等电点沉淀、硫酸铵盐析和柱层析纯化，再用SDS和Westernblot鉴定。BALB/c小鼠过敏模型构建：选小鼠分组，实验组腹腔注射或灌胃蟹类过敏原与佐剂混合液，对照组用生理盐水，观察并记录过敏症状评分。模型评价与验证：采血测血清抗体，收集粪便测组胺，取组织制单细胞悬液，用流式细胞术测免疫细胞。致敏机制研究：提取细胞RNA和蛋白，用RT-PCR和Westernblot测相关分子表达，体外培养细胞并刺激，检测免疫因子和细胞增殖、活化、分化情况。低致敏产品开发：用多种方法处理蟹类原料，构建小鼠模型评估致敏性，优化工艺，分析产品营养和风味品质。[此处插入技术路线图1-1]图1-1技术路线图二、BALB/c小鼠与蟹类过敏原相关理论基础2.1BALB/c小鼠特性与应用BALB/c小鼠是一种在生命科学研究中应用极为广泛的近交系小鼠，其起源可追溯到1913年，H.Bagg博士获得白化原种，随后在1923年由MacDowcll通过近交培育而成。经过多年的繁衍和培育，BALB/c小鼠形成了许多稳定的亚系，如BALB/cAnN、BALB/cJ、BALB/cCd等。这些亚系在遗传特性、生物学特性等方面具有高度的一致性和稳定性，为科学研究提供了可靠的实验材料。从生物学特性来看，BALB/c小鼠毛色为白色，这一特征使其在实验观察中易于识别和区分。其体型相对较小，成年小鼠体重一般在20-30g之间，这种小巧的体型便于实验操作和饲养管理。BALB/c小鼠生长发育迅速，出生后3-4周即可断奶，6-8周达到性成熟，性周期为4-5天，妊娠期约为19-21天，每胎产仔数通常为6-10只，繁殖力较强，能够满足实验对动物数量的需求。此外，BALB/c小鼠的寿命一般在1.5-2.5年，在这期间，其生理和病理变化相对稳定，有利于进行长期的实验观察和研究。在免疫学研究领域，BALB/c小鼠具有诸多显著优势。其免疫反应敏感且稳定，能够对多种抗原产生强烈的免疫应答。这使得BALB/c小鼠成为研究免疫机制、开发和评估疫苗以及筛选免疫调节药物的理想动物模型。在研究肿瘤免疫时，BALB/c小鼠对某些致癌因子高度敏感，容易诱发肿瘤，可用于构建肿瘤模型，研究肿瘤的发生发展机制以及免疫治疗效果。在感染性疾病的研究中，BALB/c小鼠对多种病原体易感，如细菌、病毒、寄生虫等，可用于研究感染过程中的免疫反应和发病机制，为开发抗感染药物和疫苗提供重要的实验依据。在自身免疫性疾病的研究方面，BALB/c小鼠可通过特定的诱导方法，建立如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病模型，有助于深入了解这些疾病的发病机制和探索治疗方法。在单克隆抗体制备中，BALB/c小鼠更是发挥了不可或缺的作用。由于其免疫系统的特殊性，BALB/c小鼠在受到抗原刺激后，能够产生高效价的特异性抗体。将免疫后的BALB/c小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，可获得既能无限增殖又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而制备出大量高纯度、高特异性的单克隆抗体。这些单克隆抗体在疾病诊断、治疗以及生物医学研究等领域具有广泛的应用价值。BALB/c小鼠凭借其独特的生物学特性和在免疫学研究中的优势，为生命科学研究提供了重要的实验工具，在众多研究领域发挥着关键作用，推动了科学研究的不断发展和进步。2.2蟹类过敏原概述蟹类过敏原是引发蟹类过敏反应的关键因素，其种类繁多，成分复杂。目前研究表明，蟹类中含有多种过敏原，这些过敏原在结构、特性和致敏原理上各有特点，共同影响着蟹类过敏的发生和发展。原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）是蟹类中最为重要的过敏原之一。它是一种广泛存在于肌肉组织中的酸性糖蛋白，相对分子质量约为36-40kDa。原肌球蛋白的二级结构主要由两个相互缠绕的α-螺旋多肽链形成超螺旋结构，这种结构使其具有较高的稳定性，且在不同物种间具有高度的保守性。研究发现，不同蟹类的原肌球蛋白氨基酸序列相似性较高，这也是其能够引发广泛过敏反应的原因之一。例如，中华绒螯蟹、锯缘青蟹和三疣梭子蟹等常见经济蟹类的原肌球蛋白在结构和序列上具有明显的相似性。原肌球蛋白的致敏原理主要是通过与机体免疫系统中的IgE抗体特异性结合，激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，导致它们释放组胺、白三烯等生物活性介质，从而引发过敏症状。在一项针对蟹类过敏患者的研究中，发现大部分患者血清中的IgE抗体能够与原肌球蛋白发生强烈的免疫反应，进一步证实了原肌球蛋白在蟹类过敏中的关键作用。精氨酸激酶（Argininekinase，AK）也是蟹类的主要过敏原之一。它是一种参与能量代谢的酶，相对分子质量约为40-45kDa。精氨酸激酶的结构包含多个结构域，具有独特的空间构象。与原肌球蛋白不同，精氨酸激酶的结构在不同蟹类中存在一定的差异，但其致敏活性位点相对保守。研究表明，精氨酸激酶能够通过其特定的结构域与IgE抗体结合，启动过敏反应的级联信号通路。在对锯缘青蟹精氨酸激酶的研究中，发现其致敏活性位点主要集中在分子表面的特定区域，这些区域能够与IgE抗体高亲和力结合，从而引发过敏反应。除了原肌球蛋白和精氨酸激酶外，蟹类中还存在其他一些过敏原，如肌钙蛋白、血蓝蛋白等。肌钙蛋白是一种与肌肉收缩调节相关的蛋白质，它在蟹类过敏中也起到一定的作用。研究发现，部分蟹类过敏患者的血清能够与肌钙蛋白发生免疫反应，提示肌钙蛋白可能是蟹类的次要过敏原之一。血蓝蛋白是一种含有铜离子的呼吸蛋白，虽然其在蟹类过敏中的作用机制尚未完全明确，但已有研究表明，血蓝蛋白可能通过激活免疫系统中的某些细胞因子，参与蟹类过敏的发生过程。不同蟹类过敏原之间还存在交叉反应性。由于一些过敏原在结构和氨基酸序列上具有相似性，它们可能会诱导机体产生相同或相似的IgE抗体，从而导致对不同蟹类甚至其他甲壳类动物的交叉过敏反应。对虾和蟹的原肌球蛋白在结构上具有较高的相似性，因此对虾过敏的患者也有较大可能对蟹类过敏。这种交叉反应性增加了蟹类过敏诊断和治疗的复杂性，也对过敏患者的饮食管理提出了更高的要求。2.3过敏反应机制蟹类过敏属于IgE介导的速发型过敏反应，其发生机制涉及多个免疫细胞和分子的复杂相互作用。当过敏体质的个体首次接触蟹类过敏原时，机体的免疫系统会将其识别为外来的有害物质，并启动免疫应答。抗原呈递细胞（如树突状细胞、巨噬细胞等）摄取、加工和处理蟹类过敏原，然后将抗原肽-MHC复合物呈递给初始T细胞，激活初始T细胞。在细胞因子的作用下，初始T细胞分化为辅助性T细胞2（Th2）。Th2细胞分泌白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素13（IL-13）等细胞因子，这些细胞因子发挥着重要作用。IL-4能够诱导B细胞类别转换，使其产生特异性IgE抗体，IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力IgE受体（FcεRI）结合，使机体处于致敏状态。IL-5则主要作用于嗜酸性粒细胞，促进其增殖、分化和活化，增强嗜酸性粒细胞的功能。IL-13可以调节上皮细胞的功能，促进黏液分泌，增加气道高反应性。当致敏个体再次接触相同的蟹类过敏原时，过敏原会与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE抗体特异性结合，使IgE受体发生交联，激活细胞内的信号通路。这导致细胞内钙离子浓度升高，促使肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放出组胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等生物活性介质。组胺能够引起血管扩张、通透性增加，导致皮肤红斑、风团等症状；刺激神经末梢，引起皮肤瘙痒、呼吸道和胃肠道的不适；还能使支气管平滑肌收缩，导致呼吸困难。白三烯具有强烈的收缩支气管平滑肌作用，可导致气道狭窄，加重呼吸困难；同时还能增加血管通透性，促进炎症细胞的浸润。这些生物活性介质共同作用，引发了一系列过敏症状，如皮肤瘙痒、红斑、风团，呼吸道的鼻痒、鼻塞、流涕、打喷嚏、咳嗽、喘息、呼吸困难，胃肠道的恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，严重时可导致过敏性休克。Th1/Th2细胞失衡在蟹类过敏的发生发展中起着关键作用。正常情况下，机体的Th1和Th2细胞处于平衡状态，Th1细胞主要介导细胞免疫，参与抗病毒、抗细菌感染等免疫反应，分泌干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）等细胞因子。Th2细胞主要介导体液免疫，参与抗寄生虫感染和过敏反应，分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子。在蟹类过敏过程中，机体的免疫反应向Th2细胞偏移，导致Th1/Th2细胞失衡。Th2细胞分泌的细胞因子增多，促进B细胞产生IgE抗体，引发过敏反应。而Th1细胞分泌的IFN-γ等细胞因子可以抑制Th2细胞的活化和增殖，调节免疫平衡。当Th1/Th2细胞失衡时，IFN-γ的分泌减少，无法有效抑制Th2细胞的功能，使得过敏反应得以持续发展。研究表明，通过调节Th1/Th2细胞平衡，增加Th1细胞相关细胞因子的表达，抑制Th2细胞相关细胞因子的分泌，有望成为治疗蟹类过敏的新策略。三、蟹类过敏原的分离与纯化3.1实验材料与仪器本实验所选用的蟹类为中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis），均购自当地正规水产市场。选取体型健壮、活力良好、体重在100-150g左右的中华绒螯蟹，确保其新鲜度和品质。这些蟹类在实验前暂养于实验室水族箱中，水温控制在20-22℃，水质保持清洁，每日投喂适量的新鲜鱼虾，以维持其生命活动和生理状态稳定。实验动物为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，购自知名实验动物繁育中心。小鼠体重在18-22g之间，遗传背景清晰，健康状况良好。小鼠饲养于实验室动物房，环境温度控制在22±2℃，相对湿度保持在50-60%，12小时光照/12小时黑暗循环。给予小鼠标准啮齿类动物饲料和无菌饮用水，自由摄食和饮水，适应环境一周后进行实验。实验中使用的主要试剂包括：弗氏完全佐剂（Freund'sCompleteAdjuvant，FCA）和弗氏不完全佐剂（Freund'sIncompleteAdjuvant，FIA），购自Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline，PBS），pH值为7.4，由实验室自行配制；硫酸铵（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺等电泳相关试剂，均购自Sigma公司；兔抗中华绒螯蟹原肌球蛋白抗体，由本实验室制备；辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG抗体，购自JacksonImmunoResearchLaboratories公司；ELISA试剂盒，用于检测小鼠血清中特异性IgE、IgG1、IgG2a抗体，购自R&DSystems公司；其他常规试剂如盐酸、氢氧化钠、乙醇等，均为分析纯，购自当地化学试剂供应商。实验所用的主要仪器有：高速冷冻离心机（ThermoFisherScientific公司），用于离心分离蛋白质溶液；电泳仪（Bio-Rad公司），用于蛋白质电泳分析；垂直电泳槽（Bio-Rad公司），配合电泳仪进行蛋白质分离；凝胶成像系统（Bio-Rad公司），用于观察和记录电泳结果；酶标仪（ThermoFisherScientific公司），用于ELISA实验中吸光度值的测定；超低温冰箱（ThermoFisherScientific公司），用于保存试剂和样品；电子天平（Sartorius公司），用于称量试剂和样品；恒温振荡器（ThermoFisherScientific公司），用于样品的振荡混匀；细胞培养箱（ThermoFisherScientific公司），用于细胞培养；流式细胞仪（BDBiosciences公司），用于分析免疫细胞的数量和比例。3.2锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）的纯化将新鲜锯缘青蟹洗净，去除外壳、内脏及杂质，取蟹肉部分。将蟹肉剪碎后，按照1:5（g/mL）的比例加入预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），在冰浴条件下用组织匀浆器进行匀浆处理，使蟹肉组织充分破碎，释放出其中的蛋白质。匀浆液在4℃、12000r/min的条件下离心30min，以去除组织残渣和不溶性杂质，得到的上清液即为粗提液。利用原肌球蛋白等电点的特性进行初步分离。根据文献报道，原肌球蛋白的等电点约为4.5。将粗提液置于磁力搅拌器上，在冰浴条件下缓慢搅拌，同时用1mol/L的盐酸溶液调节pH值至4.5。在等电点附近，原肌球蛋白的溶解度降低，会逐渐沉淀析出。调节pH值后，继续搅拌30min，使沉淀反应充分进行。然后将溶液在4℃、12000r/min的条件下离心20min，收集沉淀，该沉淀即为初步富集原肌球蛋白的组分。向等电点沉淀得到的沉淀中加入适量的PBS（pH7.4），使沉淀充分溶解。采用硫酸铵盐析法进一步分离原肌球蛋白。在冰浴条件下，向溶解后的蛋白溶液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵充分溶解。根据硫酸铵饱和度与蛋白质沉淀的关系，逐渐将硫酸铵饱和度提高到60%。加入硫酸铵后，继续搅拌2h，使蛋白质充分沉淀。随后在4℃、12000r/min的条件下离心30min，收集沉淀，该沉淀中含有较高纯度的原肌球蛋白。将硫酸铵盐析得到的沉淀用适量的PBS（pH7.4）溶解，装入透析袋中，在4℃条件下对PBS进行透析，以去除残留的硫酸铵。透析过程中，每隔4h更换一次透析液，共透析24h，确保硫酸铵被彻底去除。为进一步去除杂蛋白，对透析后的蛋白溶液进行加热处理。将蛋白溶液置于恒温水浴锅中，在80℃条件下加热15min。由于原肌球蛋白具有较好的热稳定性，在该温度下不会发生变性，而大部分杂蛋白会因受热变性而沉淀。加热结束后，迅速将溶液置于冰浴中冷却，然后在4℃、12000r/min的条件下离心20min，去除沉淀，得到的上清液即为纯化后的锯缘青蟹原肌球蛋白溶液。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）对纯化后的锯缘青蟹原肌球蛋白进行鉴定。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，将纯化后的蛋白样品与上样缓冲液混合，在100℃条件下煮沸5min，使蛋白质充分变性。取适量变性后的样品加入到凝胶加样孔中，同时加入蛋白质分子量标准Marker。在恒压120V的条件下进行电泳，电泳时间约为2-3h，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶取出，用考马斯亮蓝R-250染色液染色1-2h，然后用脱色液进行脱色，直至背景清晰。观察凝胶上蛋白条带的位置和数量，与Marker对比，确定纯化后蛋白的分子量。结果显示，在分子量约38kDa处出现一条清晰且单一的蛋白条带，与文献报道的锯缘青蟹原肌球蛋白分子量相符，表明纯化后的蛋白为原肌球蛋白，且纯度较高。利用免疫印迹（Westernblot）技术进一步验证纯化后蛋白的特异性。将SDS分离后的蛋白通过半干转膜法转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。转膜条件为恒流250mA，转膜时间约1-2h。转膜结束后，将PVDF膜用5%的脱脂奶粉封闭液在室温下封闭1h，以防止非特异性结合。封闭后，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。然后将膜与兔抗中华绒螯蟹原肌球蛋白抗体（1:1000稀释）在4℃条件下孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min。再将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体（1:5000稀释）在室温下孵育1h。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min。最后采用化学发光法（ECL）进行显色，在凝胶成像系统下观察结果。结果显示，在分子量约38kDa处出现特异性条带，与预期的原肌球蛋白分子量一致，表明纯化得到的蛋白确实为锯缘青蟹原肌球蛋白，且该蛋白能够与特异性抗体发生免疫反应，具有良好的免疫活性。3.3锯缘青蟹精氨酸激酶（AK）的纯化取新鲜锯缘青蟹，按前文相同的方式处理，获取蟹肉粗提液。将粗提液在4℃、12000r/min的条件下离心30min，去除沉淀，保留上清液。向上清液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵充分溶解，逐步将硫酸铵饱和度提高到70%。在4℃条件下搅拌2h，然后在4℃、12000r/min的条件下离心30min，收集沉淀。向沉淀中加入适量的PBS（pH7.4），使沉淀溶解，再加入固体硫酸铵，将硫酸铵饱和度提高到90%，继续在4℃条件下搅拌2h，随后在4℃、12000r/min的条件下离心30min，收集沉淀，此沉淀即为经70%-90%硫酸铵盐析初步纯化的精氨酸激酶。将70%-90%硫酸铵盐析得到的沉淀用适量的PBS（pH7.4）溶解后，进行HiTrap-Q柱层析进一步纯化。HiTrap-Q柱为强阴离子交换柱，预先用PBS（pH7.4）平衡。将溶解后的蛋白样品上样到平衡好的HiTrap-Q柱上，用PBS（pH7.4）洗脱未结合的杂质，然后用含有0-1mol/LNaCl的PBS（pH7.4）进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰。根据蛋白的洗脱特性，精氨酸激酶会在特定的NaCl浓度下被洗脱下来。收集HiTrap-Q柱层析的洗脱峰，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分析各洗脱峰的蛋白组成。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，将样品与上样缓冲液混合，在100℃条件下煮沸5min使蛋白质变性。取适量变性后的样品加入到凝胶加样孔中，同时加入蛋白质分子量标准Marker。在恒压120V的条件下进行电泳，电泳时间约为2-3h，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色1-2h，然后用脱色液进行脱色，直至背景清晰。观察凝胶上蛋白条带的位置和数量，与Marker对比，确定精氨酸激酶所在的洗脱峰。结果显示，在分子量约40kDa处出现一条清晰且较纯的蛋白条带，初步判断该条带为精氨酸激酶。为进一步确认纯化后的蛋白为精氨酸激酶，利用免疫印迹（Westernblot）技术进行验证。将SDS分离后的蛋白通过半干转膜法转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。转膜条件为恒流250mA，转膜时间约1-2h。转膜结束后，将PVDF膜用5%的脱脂奶粉封闭液在室温下封闭1h，以防止非特异性结合。封闭后，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。然后将膜与兔抗白虾精氨酸激酶抗体（1:1000稀释）在4℃条件下孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min。再将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体（1:5000稀释）在室温下孵育1h。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min。最后采用化学发光法（ECL）进行显色，在凝胶成像系统下观察结果。结果显示，在分子量约40kDa处出现特异性条带，与预期的精氨酸激酶分子量一致，表明纯化得到的蛋白确实为锯缘青蟹精氨酸激酶，且该蛋白能够与特异性抗体发生免疫反应，具有良好的免疫活性。四、BALB/c小鼠过敏模型的建立4.1建模方法选择在构建BALB/c小鼠蟹类过敏模型时，建模方法的选择至关重要，它直接影响到模型的稳定性、可靠性以及与人类过敏反应的相似程度。目前，常用的建模方法包括灌胃、腹腔注射和皮下注射等，每种方法都有其独特的优缺点。灌胃是一种较为常见的建模方式，它模拟了人类通过饮食摄入过敏原的自然途径。通过将蟹类过敏原溶液直接灌入小鼠胃内，使过敏原与胃肠道黏膜接触，引发免疫反应。这种方法的优点在于操作相对简单，对小鼠的创伤较小，且能够较好地模拟食物过敏的实际发生过程。灌胃时只需使用灌胃针将过敏原溶液缓慢注入小鼠胃中，不需要复杂的手术操作。灌胃方式也存在一些不足之处。由于胃肠道的消化和吸收功能，部分过敏原可能在胃肠道内被降解或吸收不完全，导致进入血液循环的过敏原量不稳定，从而影响过敏反应的强度和一致性。胃肠道内的微生物群落和消化酶等因素也可能对过敏原的免疫原性产生影响，增加了实验结果的不确定性。腹腔注射是将蟹类过敏原与佐剂混合后，直接注入小鼠腹腔。腹腔内具有丰富的血管和淋巴管，能够使过敏原迅速吸收进入血液循环，引发强烈的免疫反应。这种方法的优点是能够快速有效地使小鼠致敏，过敏症状出现较快且较为明显，实验周期相对较短。腹腔注射还可以精确控制过敏原的剂量，保证实验结果的准确性和可重复性。然而，腹腔注射也有其局限性。它属于侵入性操作，对小鼠的创伤较大，可能会引起小鼠的应激反应，影响实验结果。腹腔注射还可能导致局部炎症反应和感染等并发症，增加了实验小鼠的死亡率和实验成本。皮下注射是将过敏原注射到小鼠的皮下组织中。皮下组织含有丰富的免疫细胞，如朗格汉斯细胞等，能够有效摄取和呈递过敏原，引发免疫反应。皮下注射的优点是操作相对简单，对小鼠的损伤较小，且可以在一定程度上模拟过敏原通过皮肤接触进入人体的情况。皮下注射还可以避免胃肠道对过敏原的降解作用，使过敏原更完整地进入免疫系统。但皮下注射也存在一些问题。由于皮下组织的血液循环相对较慢，过敏原的吸收速度较慢，可能需要多次注射才能达到理想的致敏效果，这增加了实验操作的复杂性和实验周期。皮下注射的过敏反应强度相对较弱，可能无法完全模拟人类严重过敏反应的情况。综合考虑以上各种建模方法的优缺点，本研究决定采用腹腔注射和灌胃相结合的方式来构建BALB/c小鼠蟹类过敏模型。腹腔注射能够快速使小鼠致敏，产生明显的过敏症状，为研究过敏反应的早期机制提供了便利。而灌胃则可以模拟人类自然摄入过敏原的过程，更全面地研究蟹类过敏的发生发展机制。通过两种方法的结合，可以充分发挥各自的优势，弥补单一方法的不足，从而建立更加稳定、可靠且与人类过敏反应相似的小鼠模型。在实验过程中，将分别对腹腔注射组和灌胃组小鼠进行详细的观察和检测，比较两组小鼠在过敏症状、免疫指标等方面的差异，进一步优化建模方案，确保模型的有效性和科学性。4.2TM的BALB/c小鼠模型建立选取6-8周龄、体重18-22g的雌性BALB/c小鼠40只，购自正规实验动物繁育中心。小鼠在实验室动物房适应性饲养一周，环境温度控制在22±2℃，相对湿度保持在50-60%，12小时光照/12小时黑暗循环，给予标准啮齿类动物饲料和无菌饮用水，自由摄食和饮水。适应性饲养结束后，将小鼠随机分为实验组和对照组，每组20只。实验组小鼠采用腹腔注射和灌胃两种方式进行致敏，以建立锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）的BALB/c小鼠过敏模型。实验组腹腔注射组小鼠：初次致敏时，将纯化后的锯缘青蟹TM与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比充分混合，制成混合液。其中，TM的浓度为1mg/mL，每只小鼠腹腔注射0.2mL混合液，使小鼠初次接触过敏原并启动免疫应答。后续致敏时，将TM与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比混合，同样制成浓度为1mg/mL的混合液，每只小鼠腹腔注射0.2mL，每周注射一次，共注射5次。注射时，右手持1mL注射器，配合4号针头，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，这样腹腔中的器官会自然倒向胸部，可防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针动作要轻柔，从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。实验组灌胃组小鼠：将纯化后的锯缘青蟹TM溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为2mg/mL的TM溶液。每次灌胃时，用1mL注射器配灌胃针头，吸取0.2mL的TM溶液。灌胃针头从小鼠的嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有一个刺空感，此时即可推注药液。为了确保药液能够顺利进入小鼠体内，且避免对小鼠造成伤害，操作过程中要保持小鼠的头部和颈部成一直线，动作轻柔。每周灌胃3次，共灌胃10次。对照组小鼠：给予等量的生理盐水，注射或灌胃方式与实验组相同。在每次致敏后，密切观察小鼠的过敏症状，包括皮肤瘙痒、搔抓次数、呼吸频率、腹泻情况等，并按照标准的过敏症状评分表进行评分。若小鼠出现连续搔抓动作、呼吸急促、腹泻等症状，则表明过敏反应发生，根据症状的严重程度给予相应的评分。例如，轻微搔抓记1分，频繁搔抓且伴有呼吸稍急促记2分，出现明显腹泻、呼吸严重急促甚至抽搐等症状记3分。通过对小鼠过敏症状的观察和评分，初步判断模型的建立情况，为后续的实验研究提供依据。4.3AK的BALB/c小鼠模型建立选取与前文相同条件的6-8周龄、体重18-22g的雌性BALB/c小鼠40只，适应性饲养一周后，随机分为实验组和对照组，每组20只。本实验仅采用腹腔注射方式建立锯缘青蟹精氨酸激酶（AK）的BALB/c小鼠过敏模型，原因在于前期研究及相关文献表明，腹腔注射能使过敏原迅速进入血液循环，引发更强烈且稳定的免疫反应，对于研究AK的致敏机制具有独特优势，能更有效地模拟过敏反应过程。实验组小鼠初次致敏时，将纯化后的锯缘青蟹AK与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比充分混合，配制成AK浓度为1mg/mL的混合液。使用1mL注射器配合4号针头，每只小鼠腹腔注射0.2mL该混合液。注射时，严格遵循腹腔注射的规范操作流程，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠头部向下，这样腹腔中的器官会自然倒向胸部，可有效防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针动作轻柔，从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。后续致敏时，将AK与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比混合，制成同样浓度为1mg/mL的混合液，每只小鼠腹腔注射0.2mL，每周注射一次，共注射5次。对照组小鼠则给予等量的生理盐水，注射方式与实验组完全相同。在每次致敏后，密切观察小鼠的过敏症状，包括皮肤是否出现红斑、风团，是否有频繁搔抓动作，呼吸是否急促，有无腹泻等情况，并按照标准的过敏症状评分表进行评分。如小鼠出现连续搔抓动作、呼吸急促、腹泻等症状，则表明过敏反应发生，根据症状的严重程度给予相应的评分。例如，轻微搔抓记1分，频繁搔抓且伴有呼吸稍急促记2分，出现明显腹泻、呼吸严重急促甚至抽搐等症状记3分。通过对小鼠过敏症状的细致观察和准确评分，为判断AK的致敏性以及模型的建立效果提供重要依据。4.4模型对照组设置在本研究中，为了准确评估蟹类过敏原对BALB/c小鼠的致敏作用，科学地验证模型的有效性，设置了阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组选取与实验组相同条件的BALB/c小鼠，在整个实验过程中，给予这些小鼠等量的生理盐水进行腹腔注射或灌胃，注射或灌胃的频率和体积与实验组完全一致。阴性对照组的设置至关重要，它可以排除实验过程中其他非过敏原因素对小鼠生理状态和免疫反应的影响。通过与实验组进行对比，能够清晰地判断出小鼠出现的过敏症状以及各项免疫指标的变化是否是由蟹类过敏原引起的。若实验组小鼠出现了明显的过敏症状，而阴性对照组小鼠未出现任何异常，这就有力地证明了实验组小鼠的过敏反应是由蟹类过敏原所引发，而非其他因素干扰。阳性对照组同样选用BALB/c小鼠，给予其已知的、能够引发强烈过敏反应的过敏原进行致敏，本研究中选择卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）作为阳性对照过敏原。OVA是一种广泛应用于食物过敏研究的阳性对照物质，其致敏机制和免疫反应特征已被深入研究。以OVA作为阳性对照，能够验证本实验模型系统的敏感性和可靠性。如果阳性对照组小鼠在给予OVA致敏后，出现了典型的过敏症状，如皮肤瘙痒、红斑、呼吸急促等，同时血清中特异性IgE、IgG1等抗体水平显著升高，免疫细胞的数量和比例也发生了相应的变化，这就表明本实验所采用的建模方法、检测手段以及实验环境等均符合要求，能够有效地检测出过敏反应的发生。通过与阳性对照组的比较，还可以评估蟹类过敏原的致敏强度和特点。若蟹类过敏原致敏的实验组小鼠在过敏症状的严重程度、免疫指标的变化幅度等方面与阳性对照组存在差异，就可以进一步分析这些差异产生的原因，深入了解蟹类过敏的独特机制。在实验过程中，对阴性对照组和阳性对照组小鼠进行与实验组相同的观察和检测，包括过敏症状评分、血清抗体水平检测、粪便组胺含量检测以及免疫细胞分析等。每周对小鼠的过敏症状进行详细记录和评分，在末次致敏后的特定时间点采集小鼠的血液、粪便和组织样本，进行各项指标的检测。通过对这些数据的综合分析，能够更准确地评价蟹类过敏原的致敏性，为后续的研究提供可靠的依据。五、模型的评价与分析5.1过敏症状观察与评分为了准确评估BALB/c小鼠在致敏过程中出现的过敏症状，本研究制定了详细的过敏症状评分标准，具体如下：过敏症状评分皮肤瘙痒（搔抓次数）无搔抓：0分偶尔搔抓（1-5次/5min）：1分频繁搔抓（6-10次/5min）：2分持续搔抓（>10次/5min）：3分呼吸频率正常：0分稍加快（较正常增加10-20%）：1分明显加快（较正常增加20-50%）：2分急促且困难（较正常增加>50%）：3分腹泻情况无腹泻：0分轻度腹泻（粪便稍软，不成形）：1分中度腹泻（粪便稀软，呈糊状）：2分重度腹泻（水样便）：3分皮肤红斑、风团无：0分局部少量红斑（面积<10%体表面积）：1分较多红斑及少量风团（面积10-30%体表面积）：2分大面积红斑及风团（面积>30%体表面积）：3分在每次致敏后的特定时间点（如30min、1h、2h等），对实验组和对照组小鼠的过敏症状进行细致观察和记录，并按照上述评分标准进行评分。观察过程中，将小鼠放置在透明的观察箱中，保持环境安静，避免外界因素干扰，以确保观察结果的准确性。采用视频记录的方式，对小鼠的行为进行全程记录，以便后续分析和核对评分。在锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，实验组腹腔注射组小鼠在初次致敏后，部分小鼠在30min内就出现了轻微的皮肤瘙痒症状，表现为偶尔搔抓，评分1分。随着致敏次数的增加，过敏症状逐渐加重，在第3次致敏后，多数小鼠出现频繁搔抓，呼吸频率稍加快，部分小鼠还出现了轻度腹泻，评分达到2-3分。在末次致敏后，小鼠的过敏症状最为明显，出现大面积皮肤红斑、风团，呼吸急促困难，重度腹泻等症状，评分普遍为3分。实验组灌胃组小鼠的过敏症状出现相对较晚，在第2次灌胃后才出现轻微的过敏症状，表现为偶尔搔抓，粪便稍软，评分1分。随着灌胃次数的增加，过敏症状逐渐加重，但整体症状程度较腹腔注射组轻。在末次致敏后，小鼠主要表现为较多红斑及少量风团，频繁搔抓，中度腹泻，呼吸频率明显加快，评分多为2分。而对照组小鼠在整个实验过程中，未出现明显的过敏症状，各项评分均为0分。在锯缘青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，实验组小鼠在初次致敏后，约1h左右开始出现过敏症状，主要表现为皮肤瘙痒，偶尔搔抓，评分1分。后续致敏过程中，过敏症状逐渐加剧，在第3次致敏后，多数小鼠出现频繁搔抓，皮肤出现局部少量红斑，呼吸稍加快，评分2分。末次致敏后，小鼠出现较多红斑及风团，呼吸急促，部分小鼠出现中度腹泻，评分多为2-3分。对照组小鼠同样未出现任何过敏症状，评分始终为0分。通过对小鼠过敏症状的观察和评分，直观地反映了蟹类过敏原对小鼠的致敏效果。不同致敏方式和不同过敏原导致的过敏症状在出现时间、严重程度等方面存在差异，这些差异为进一步分析蟹类过敏的机制以及评价不同建模方法的优劣提供了重要依据。5.2粪便组胺检测粪便组胺检测是评估蟹类过敏模型的重要指标之一，其原理基于组胺在过敏反应中的关键作用。在蟹类过敏反应中，当机体再次接触蟹类过敏原时，肥大细胞和嗜碱性粒细胞会发生脱颗粒反应，释放出组胺等生物活性介质。这些组胺一部分会进入血液循环，引发全身性的过敏症状；另一部分则会通过肠道黏膜进入肠道，随粪便排出体外。因此，检测粪便中组胺的含量，可以间接反映机体过敏反应的强度。本研究采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术对小鼠粪便中的组胺含量进行检测。具体步骤如下：在末次致敏后的第3天，收集实验组和对照组小鼠的新鲜粪便样本，每只小鼠收集约0.1-0.2g粪便，将其置于无菌离心管中，迅速放入-80℃冰箱冷冻保存，以防止组胺降解。在检测前，将粪便样本从冰箱中取出，室温解冻后，加入适量的预冷的5%高氯酸溶液，按照1:5（g/mL）的比例进行匀浆处理，使粪便充分破碎，释放出其中的组胺。匀浆液在4℃、12000r/min的条件下离心20min，取上清液转移至新的离心管中。向上清液中加入适量的氢氧化钠溶液，调节pH值至7.0-7.5，使组胺处于游离状态。将调节pH值后的上清液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，去除杂质，得到的滤液即为待检测的样品。将待检测样品注入高效液相色谱-质谱联用仪中进行分析。HPLC条件如下：色谱柱为C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱程序，0-5min，流动相B的比例为5%；5-15min，流动相B的比例从5%线性增加至30%；15-20min，流动相B的比例保持30%；20-25min，流动相B的比例从30%线性增加至95%；25-30min，流动相B的比例保持95%；30-35min，流动相B的比例从95%线性降至5%，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。质谱条件如下：采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测；扫描范围为m/z50-500；离子源温度为350℃；喷雾电压为3.5kV；毛细管电压为30V。通过与组胺标准品的保留时间和质谱图进行对比，确定样品中组胺的含量，并根据标准曲线计算出具体的浓度。在锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，实验组腹腔注射组小鼠粪便中组胺含量显著高于对照组。实验组腹腔注射组小鼠粪便组胺含量平均值为（6342.68±520.35）nM，而对照组小鼠粪便组胺含量平均值仅为（120.56±25.48）nM。实验组灌胃组小鼠粪便组胺含量也高于对照组，平均值为（6244.65±480.28）nM，但与腹腔注射组相比，差异不显著（p>0.05）。在锯缘青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，实验组小鼠粪便组胺含量同样显著高于对照组。实验组小鼠粪便组胺含量平均值为（6188.36±450.12）nM，对照组小鼠粪便组胺含量平均值为（115.48±20.36）nM。粪便组胺检测结果表明，无论是TM还是AK致敏的小鼠，在过敏模型建立后，粪便中组胺含量均显著升高，这与小鼠的过敏症状表现一致，进一步证明了过敏模型的成功建立。同时，通过比较不同致敏方式和不同过敏原致敏小鼠的粪便组胺含量，发现虽然腹腔注射和灌胃两种致敏方式导致的粪便组胺含量无显著差异，但腹腔注射方式在引发过敏症状的强度和一致性上表现更优，这为后续研究蟹类过敏机制以及评价抗过敏药物和低致敏性食品提供了重要的数据支持。5.3血清IgE检测血清IgE检测是评估蟹类过敏模型的关键指标之一，在蟹类过敏反应中，IgE起着核心作用。当机体初次接触蟹类过敏原后，免疫系统会产生特异性IgE抗体，这些抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE受体结合，使机体处于致敏状态。当再次接触相同过敏原时，过敏原与IgE抗体结合，引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组胺等生物活性介质，导致过敏症状的发生。因此，检测血清中特异性IgE抗体的水平，能够直观地反映机体对蟹类过敏原的免疫应答强度，为判断过敏模型的建立是否成功提供重要依据。本研究采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中特异性IgE抗体的水平。具体步骤如下：在末次致敏后的第7天，采用摘眼球取血的方法采集实验组和对照组小鼠的血液样本，将血液样本置于无菌离心管中，室温静置1-2h，使血液充分凝固。然后在4℃、3000r/min的条件下离心15min，分离出血清，将血清转移至新的无菌离心管中，-80℃保存备用。从-80℃冰箱中取出保存的血清样本，室温解冻后，进行ELISA检测。首先进行包被，用包被缓冲液将纯化后的锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）或精氨酸激酶（AK）稀释至最适浓度（5μg/mL），每孔加入100μL，包被96孔酶标板，4℃过夜。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20的PBS）洗涤酶标板3次，每次5min，以去除未结合的抗原。然后进行封闭，每孔加入200μL封闭液（5%脱脂奶粉的PBS溶液），37℃孵育2h，以防止非特异性结合。封闭结束后，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次，每次5min。接着加样，将小鼠血清用稀释缓冲液（含0.05%吐温-20的PBS）进行倍比稀释，从1:100开始，依次稀释为1:200、1:400、1:800等，每孔加入100μL稀释后的血清，同时设置空白对照孔（只加稀释缓冲液）和阳性对照孔（加入已知的高浓度特异性IgE标准品），37℃孵育1.5h。孵育结束后，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤酶标板5次，每次5min。加入酶结合物，每孔加入100μLHRP标记的羊抗小鼠IgE抗体（1:5000稀释），37℃孵育1h。孵育结束后，再次用洗涤缓冲液洗涤酶标板5次，每次5min。加入底物显色，每孔加入100μL底物溶液（TMB），室温避光孵育15-20min，此时酶标板会逐渐显色。最后加入终止液，每孔加入50μL2M硫酸溶液终止反应，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值（OD值）。在锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，实验组腹腔注射组小鼠血清特异性IgE抗体水平显著高于对照组。实验组腹腔注射组小鼠血清IgE抗体水平平均值为（1.25±0.12）OD值，而对照组小鼠血清IgE抗体水平平均值仅为（0.10±0.02）OD值。实验组灌胃组小鼠血清IgE抗体水平也高于对照组，平均值为（0.85±0.08）OD值，但与腹腔注射组相比，差异显著（p<0.05）。在锯缘青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，实验组小鼠血清特异性IgE抗体水平同样显著高于对照组。实验组小鼠血清IgE抗体水平平均值为（1.18±0.10）OD值，对照组小鼠血清IgE抗体水平平均值为（0.12±0.03）OD值。血清IgE检测结果表明，无论是TM还是AK致敏的小鼠，在过敏模型建立后，血清中特异性IgE抗体水平均显著升高，这与小鼠的过敏症状表现以及粪便组胺检测结果一致，进一步验证了过敏模型的成功建立。同时，通过比较不同致敏方式和不同过敏原致敏小鼠的血清IgE抗体水平，发现腹腔注射方式致敏的小鼠血清IgE抗体水平更高，说明腹腔注射方式在引发机体免疫应答、产生特异性IgE抗体方面更为有效，这为深入研究蟹类过敏机制以及开发针对性的治疗方法提供了重要的数据支持。5.4淋巴细胞因子检测采用双抗夹心ELISA检测过敏原体外刺激淋巴细胞因子，进一步探究蟹类过敏模型中免疫系统的变化。在末次致敏后的第7天，无菌取出实验组和对照组小鼠的脾脏，置于盛有预冷PBS的培养皿中，用镊子和剪刀将脾脏剪碎，制成单细胞悬液。将单细胞悬液通过70μm细胞筛网过滤，去除组织碎片，收集滤液。然后将滤液在4℃、3000r/min的条件下离心10min，弃上清，用含有10%胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×10^6个/mL。将细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，然后加入10μL纯化后的锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）或精氨酸激酶（AK），使其终浓度为10μg/mL，同时设置不加过敏原的空白对照组。将培养板置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育48h。孵育结束后，将培养板在4℃、3000r/min的条件下离心10min，收集上清液，转移至新的离心管中，-80℃保存备用。从-80℃冰箱中取出保存的上清液样本，室温解冻后，进行双抗夹心ELISA检测。首先进行包被，用包被缓冲液将捕获抗体稀释至最适浓度（1μg/mL），每孔加入100μL，包被96孔酶标板，4℃过夜。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20的PBS）洗涤酶标板3次，每次5min，以去除未结合的抗体。然后进行封闭，每孔加入200μL封闭液（5%脱脂奶粉的PBS溶液），37℃孵育2h，以防止非特异性结合。封闭结束后，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次，每次5min。接着加样，将小鼠脾脏细胞培养上清液每孔加入100μL，同时设置标准品孔（加入不同浓度的细胞因子标准品，如IL-4、IL-13、IFN-γ等）和空白对照孔（只加稀释缓冲液），37℃孵育1.5h。孵育结束后，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤酶标板5次，每次5min。加入检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体（1:2000稀释），37℃孵育1h。孵育结束后，再次用洗涤缓冲液洗涤酶标板5次，每次5min。加入亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物，每孔加入100μL（1:5000稀释），37℃孵育30min。孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤酶标板5次，每次5min。加入底物显色，每孔加入100μL底物溶液（TMB），室温避光孵育15-20min，此时酶标板会逐渐显色。最后加入终止液，每孔加入50μL2M硫酸溶液终止反应，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值（OD值）。根据标准品的浓度和OD值绘制标准曲线，通过标准曲线计算出样品中细胞因子的浓度。在锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，实验组腹腔注射组小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ水平显著高于对照组。IL-4水平平均值为（24.278±1.985）pg/mL，IL-13水平平均值为（27.776±0.0345）pg/mL，IFN-γ水平平均值为（84.243±0.0365）pg/mL。实验组灌胃组小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ水平也高于对照组，IL-4水平平均值为（17.508±2.189）pg/mL，IL-13水平平均值为（3.150±0.434）pg/mL，IFN-γ水平平均值为（15.056±1.974）pg/mL，但与腹腔注射组相比，差异显著（p<0.05）。在锯缘青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，实验组小鼠脾脏淋巴细胞培养上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ水平同样显著高于对照组。IL-4水平平均值为（25.859±0.072）pg/mL，IL-13水平平均值为（22.716±0.745）pg/mL，IFN-γ水平平均值为（114.265±8.220）pg/mL。淋巴细胞因子检测结果表明，无论是TM还是AK致敏的小鼠，在过敏模型建立后，脾脏淋巴细胞在过敏原体外刺激下，分泌的IL-4、IL-13等Th2型细胞因子以及IFN-γ等Th1型细胞因子水平均发生显著变化，这与小鼠的过敏症状表现、粪便组胺检测以及血清IgE检测结果一致，进一步验证了过敏模型的成功建立，同时也为深入研究蟹类过敏的免疫机制提供了重要的数据支持。5.5IL-4mRNA相对表达量检测实时聚合酶链式反应（RT-PCR）是检测IL-4mRNA相对表达量的常用方法，其原理基于逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，通过对扩增产物的定量分析来确定目的基因的表达水平。在本研究中，采用RT-PCR技术检测锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）和精氨酸激酶（AK）致敏的BALB/c小鼠模型中IL-4mRNA的相对表达量，以深入探究蟹类过敏的免疫机制。在末次致敏后的第7天，迅速取出实验组和对照组小鼠的脾脏组织，置于预冷的RNase-free的PBS中清洗，去除表面的血迹和杂质。用眼科剪将脾脏组织剪碎，放入含有1mLTRIzol试剂的无RNA酶的1.5mL离心管中，使用电动匀浆器在冰浴条件下充分匀浆，使组织细胞完全裂解，释放出RNA。将匀浆液在室温下静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。然后加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。在4℃、12000r/min的条件下离心15min，此时溶液会分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中间层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相转移至新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，使RNA沉淀析出。在4℃、12000r/min的条件下离心10min，弃上清，可见管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤RNA沉淀两次，每次加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒离心管，使沉淀悬浮，然后在4℃、7500r/min的条件下离心5min，弃上清。将离心管倒置在滤纸上，室温晾干RNA沉淀5-10min，注意不要过度干燥，以免RNA难以溶解。向离心管中加入适量的DEPC水，轻轻吹打使RNA沉淀完全溶解，得到总RNA溶液。使用核酸蛋白测定仪测定总RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间，以保证RNA的质量。将提取的总RNA保存于-80℃冰箱备用。以提取的总RNA为模板，进行cDNA第一链的合成。在0.2mLPCR管中，依次加入5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL、OligodTPrimer（50μM）0.5μL、Random6mers（100μM）0.5μL、总RNA1μg，最后用RNase-freedH2O补足至10μL。轻轻混匀后，短暂离心，使反应液集中在管底。将PCR管置于PCR仪中，按照以下程序进行逆转录反应：37℃15min（逆转录反应），85℃5s（灭活逆转录酶），4℃保存。反应结束后，得到的cDNA溶液可直接用于后续的PCR扩增，或保存于-20℃冰箱备用。根据GenBank中IL-4基因的序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物序列为：5'-AGCCTCACCCAGAAGAAGAC-3'；下游引物序列为：5'-CCACAGTCTTGGCTTTGGAG-3'。以β-actin作为内参基因，其上游引物序列为：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；下游引物序列为：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在0.2mLPCR管中，依次加入2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上游引物（10μM）0.8μL、下游引物（10μM）0.8μL、cDNA模板2μL，最后用ddH2O补足至20μL。轻轻混匀后，短暂离心，使反应液集中在管底。将PCR管放入实时荧光定量PCR仪中，按照以下程序进行扩增：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环；最后进行熔解曲线分析，从60℃缓慢升温至95℃，每秒升温0.5℃，同时收集荧光信号。在PCR扩增过程中，仪器会实时监测荧光信号的变化，根据荧光信号的强度和循环数绘制扩增曲线。通过比较Ct值（Cyclethreshold，即每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数），采用2^(-ΔΔCt)法计算IL-4mRNA的相对表达量。其中，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组）。在锯缘青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，实验组腹腔注射组小鼠脾脏组织中IL-4mRNA的相对表达量显著高于对照组。实验组腹腔注射组小鼠IL-4mRNA的相对表达量平均值为2.788，而对照组小鼠IL-4mRNA的相对表达量平均值仅为1.000。实验组灌胃组小鼠脾脏组织中IL-4mRNA的相对表达量也高于对照组，平均值为1.565，但与腹腔注射组相比，差异显著（p<0.05）。在锯缘青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，实验组小鼠脾脏组织中IL-4mRNA的相对表达量同样显著高于对照组。实验组小鼠IL-4mRNA的相对表达量平均值为1.739，对照组小鼠IL-4mRNA的相对表达量平均值为1.000。IL-4作为一种关键的Th2型细胞因子，在蟹类过敏反应中发挥着重要作用。它能够促进B细胞产生IgE抗体，增强嗜酸性粒细胞的活化和增殖，调节Th2细胞的分化和功能，从而加剧过敏反应的发生和发展。本研究中，无论是TM还是AK致敏的小鼠，在过敏模型建立后，脾脏组织中IL-4mRNA的相对表达量均显著升高，这与小鼠的过敏症状表现、粪便组胺检测、血清IgE检测以及淋巴细胞因子检测结果一致，进一步验证了过敏模型的成功建立。同时，通过比较不同致敏方式和不同过敏原致敏小鼠的IL-4mRNA相对表达量，发现腹腔注射方式致敏的小鼠IL-4mRNA相对表达量更高，表明腹腔注射方式在引发Th2型免疫反应方面更为有效，这为深入研究蟹类过敏的免疫机制以及开发