DB36T-汉滩病毒和汉城病毒实时荧光RT-PCR检测方法编制说明

PAGE1《汉滩病毒和汉城病毒实时荧光RT-PCR检测方法》地方标准编制说明（征求意见稿）工作简介（一）任务来源2024年9月30日，江西省市场监督管理局下达了2024年第九批江西省地方标准制修订计划的通知文件，其中批准《汉滩病毒和汉城病毒实时荧光RT-PCR检测方法》（计划编号：DB36-2024-9-40）地方标准由江西省疾病预防控制中心负责制定。（二）起草单位起草单位：江西省疾病预防控制中心。（三）主要起草人姓名性别职务/职称工作单位任务分工刘师文女副主任技师江西省疾病预防控制中心标准起草；实验室方案设计；技术审核；分子实验李健雄男所长/副主任技师江西省疾病预防控制中心标准起草，技术审核施勇男副主任医师江西省疾病预防控制中心标准起草；实验方案设计徐刚男副主任技师江西省疾病预防控制中心实验优化；数据分析张艳妮女副主任技师江西省疾病预防控制中心实验优化；数据分析邱伟华女副主任技师江西省疾病预防控制中心标准起草;政策咨询肖芳女副主任技师江西省疾病预防控制中心文献调研刘晓庆女副主任技师江西省疾病预防控制中心分子实验周珺女副主任技师江西省疾病预防控制中心技术审核肖大瑾男主管技师江西省疾病预防控制中心文献调研；分子实验冉鑫男主管技师文献调研；分子实验文献调研；分子实验吴杨博文女主管技师江西省疾病预防控制中心文献调研；分子实验王倩女技师江西省疾病预防控制中心文献调研；分子实验熊英女副主任/主任技师江西省疾病预防控制中心政策咨询标准修订的必要性和意义近年来，新发传染病（EID）的频繁出现，引发重大公共卫生及生物安全风险，多数EID以人兽共患病为主。啮齿动物是全球分布最广泛，种类最多的哺乳动物，同时也是多种人兽共患病原的自然宿主，啮齿类动物病原监测是多种人畜共患病防控的重要手段。汉滩病毒（Hantaanvirus，HTNV））和汉城病毒（Seoulvirus，SEOV）均属汉坦病毒科的RNA病毒，主要以啮齿类动物为自然宿主，其中HTNV自然宿主主要为黑线姬鼠，SEOV自然宿主主要为褐家鼠。人类可通过接触、吸入受感染啮齿类动物的排泄物感染病毒，导致肾综合征出血热(HFRS)。HTNV和SEOV的致死率为1%~15%。啮齿类动物HTNV和SEOV监测对人间HFRS疫情预测、预警以有重要的指示作用，为HFRS精准防控措施制定提供数据支撑。国内外啮齿类动物中HTNV和SEOV感染检测方法主要是针对抗原或抗体检测的免疫学方法（如：免疫荧光法）、病毒分离、这些方法特异性不强、无法实现病毒基因分型，或需要特殊设备和专业技术，难以推广应用。常规RT-PCR也有应用于啮齿类动物中HTNV和SEOV感染检测，需通过电泳PCR产物检测目的条带大小或者基因测序判断病毒型别，操作复杂，检测时间长，灵敏度低，可操作性不强。如现有行业标准《输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式RT-PCR检测方法》（SN/T2777-2011）为常规RT-PCR方法，该法RCR检测分为逆转录、第一次PCR、第二次PCR，通过电泳PCR产物，根据目的条带大小判定病毒型别，操作非常复杂，易污染，灵敏度低，检测时间长，对设备要求高，难以向基层推广。实时荧光RT-PCR方法是在常规RT-PCR的基础上，在反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过检测荧光信号对核酸模板进行实时检测。该方法具有灵敏度高、特异性强、实时、准确等优点，已被广泛应用于细菌、病毒检测等多个领域。目前国内外尚无啮齿类动物中针对HTNV和SEOV一管双重实时荧光RT-PCR方法，也未见相关的实时荧光RT-PCR标准和技术规范。本标准建立后，将填补我省在改项技术上的空白，运用本标准可对我省啮齿类动物HTNV和SEOV进行快速检测，为我省HFRS精准防控提供准确的监测数据。主要起草过程（一）标准起草2020年10月，江西省科技厅批准了2020年度江西省重点研发计划项目“肾综合征出血热病原遗传变异和早期快速诊断关键技术的研究”（项目编号：2020BBGL73052）。在该项目支撑下，2020-2022年期间，初步建立了HTNV和SEOV实时荧光RT-PCR检测方法，并于2023年8月份顺利通过科技厅的项目验收。2024年1月-7月，在前期实验基础上，通过查阅文献，收集资料，参考国家标准、行业标准，标准起草小组起草了《汉滩病毒和汉城病毒实时荧光RT-PCR检测方法》（标准草案），并提交了项目立项建议材料至江西省卫生健康标准化技术委员会秘书处（以下简称秘书处）。（二）标准立项2024年7月5日，秘书处组织相关专家对本标准进行了立项论证预审查。通过预审查后，起草小组根据专家意见修改了标准草案，同项目申报表一并报送至江西省标准技术评审中心。8月29日，参加了江西省标准技术评审中心组织召开的立项评估会。通过专家评审、公示和审批等环节，9月30日，江西省市场监督管理局下达了该项目的制定计划。（三）征求意见为进一步增强标准的科学性和可行性，随后起草小组再次优化了试验方法，修改和完善标准草案，起草编制说明，形成征求意见稿，并在卫生健康单位、行业学（协）会以及高校广泛征求意见。制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系（一）标准的制定与起草原则本标准的编制遵循以下原则，以确保标准的科学性、适用性和可操作性：1、科学性原则起草小组成员长期从事病毒性传染病监测，具有丰富的病毒检测工作经验。团队成员紧密协作，参考国内外最新研究成果，结合HTNV和SEOV病原学特征、流行病学特点、省重点研发计划项目的前期基础以及实时荧光RT-PCR实验验证确保本标准内容科学、准确、可靠。2、适用性原则江西地区啮齿类动物种类和数量繁多，且分布广泛。啮齿类动物病原监测是多种人畜共患病防控的重要手段。由于缺乏啮齿类动物中HTNV和SEOV统一的检测方法，导致监测数据不准确，无法实现肾综合征出血热的精准防控，存在较大的公共卫生风险。本标准紧密结合江西本地HTNV和SEOV病原学特征、各市县疾病预防控制中心实验室均具备实时荧光RT-PCR检测能力和条件以及对啮齿类动物中HTNV和SEOV检测需求的防控实际，制定相应的检测方法和结果判定标准，确保标准实用、可操作、易推广。3、规范性原则本标准按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，从检测原理、试剂和材料、生物安全要求、检测步骤和结果判定等五个方面进行规定和明确，使得标准易于理解和执行。4、先进性原则实时荧光PCR已广泛应用于病原体检测领域，而目前尚无HTNV和SEOV的实时荧光PCR检测标准，本标准采用实时荧光PCR方法，方法简单易行、灵敏度高、准确可靠，具有先进性。（二）与现行法律、法规、标准的关系本标准在编制过程中严格遵循现行相关法律、法规和标准的要求，并与之保持协调一致，具体体现在以下几个方面：1、与现行法律、法规的关系本标准严格遵循《中华人民共和国标准化法》、《中华人民共和国生物安全法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关法律法规要求，确保标准的制定和实施符合国家法律法规的规定。本标准旨在为啮齿类动物HTNV和SEOV的实验室检测提供技术规范、为相关传染病的预防、控制提供支撑依据，符合《中华人民共和国传染病防治法》关于加强传染病监测、预警和实验室检测能力的相关要求。2、与现行标准的关系目前尚无HTNV和SEOV实时荧光RT-PCR检测方法相关现行国内外标准。本标准参考了GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》、GB19489《实验室生物安全通用要求》、GB/T28940《病媒生物感染病原体采样规程鼠类》等相关国家标准，在实验用水质量控制、实验室生物安全、样本采集方面与现行标准保持一致。本标准在遵循现行法律、法规和标准的基础上，结合本地区HTNV和SEOV病原学特点和防控需求，对啮齿类动物中HTNV和SEOV实时荧光RT-PCR检测方法进行了详细的规定，具有较强的针对性和实用性，能够给啮齿类动物中HTNV和SEOV检测提供有效的技术支撑。主要条款的说明本标准围绕汉滩病毒和汉城病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，结合技术特点与江西地区啮齿类动物鞋带病原体监测的实际需求，对核心条款进行规范，具体说明如下：（一）适用范围条款内容：规定了汉滩病毒和汉城病毒实时荧光RT-PCR检测的原理、试剂和材料、生物安全要求、检测步骤和结果判定等内容。明确适用于疾病预防控制机构对啮齿类动物中汉滩病毒和汉城病毒的实时荧光RT-PCR检测。说明：依据江西地区汉滩病毒/汉坦病毒的基因组特征，选定高度保守的S基因作为靶标基因，确保检测的特异性。结合本地啮齿类动物种类多，汉滩病毒和汉城病毒携带率高，各级疾病预防控制机构需对啮齿类动物中汉滩病毒和汉城病毒进行检测的实际，明确了该适用范围。（二）检测方法和步骤条款内容：详细规范了样本采集、样本处理、核酸提取、实时荧光RT-PCR检测等流程。说明：通过比对文献及预实验数据，优化了反应体系，退火温度、引物探针浓度等条件。（三）检测结果判定条款内容：规定实验成立、检测结果判定包括阈值设定、阴性、单阳、双阳判定标准以及可疑样本的处理。说明：多次试验表明，高于最低检出线浓度的样本Ct均小于35，因此设定≤35.0为阳性判断阈值，提高检测灵敏度的同时避免假阳性。同时要求每批次的试验包含阴性对照、阳性对照，确保实验过程无污染。六、重大意见分歧的处理依据和结果本标准征求了卫生健康单位、行业学（协）会以及高校意见,无重大意见分歧.七、贯彻标准的措施建议本标准虽为推荐性文件，但执行本标准可对我省啮齿类动物HTNV和SEOV进行快速检测，为我省HFRS精准防控提供准确的监测数据。为贯彻实施该标准，将采取以