（正式版）DB65∕T 4278-2019 《棉花品种纯度鉴定技术规程 SSR分子标记法》

棉花品种纯度鉴定技术规程新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布本标准依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规则起草。本标准由新疆农业科学院经济作物研究所提出。本标准由新疆维吾尔自治区农业农村厅归口并组织实施。本标准起草单位：新疆农业科学院经济作物研究所。本标准主要起草人：艾先涛、李雪源、龚照龙、梁亚军、王俊铎、郑巨云、王欣怡、孙国清、郭江本标准实施应用中的疑问，请咨询自治区农业农村厅质量安全监管处、新疆农业科学院经济作物研究所。对本标准的修改意见建议，请反馈至自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167号)、新疆农业科学院经济作物研究所(乌鲁木齐南昌路403号)。自治区市场监督管理局联系电话传真邮编：830004自治区农业农村厅质量安全监管处联系电话邮编：830049新疆农业科学院经济作物研究所联系电话传真邮编：8300911本标准适用于基于简单重复序列(简称“SSR”)分子标记的棉花品种纯度鉴定。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB4407.1经济作物种子第1部分：纤维类2品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核苷酸序列不同所致。SSR广泛分布于棉花整个基因组中，根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的扩增产物，将扩增产物进行凝胶电泳，经硝酸银染色，可辨别SSR电泳谱带。通过选用品种间具有多态性的SSR引物，根据PCR扩增产物电泳谱带差异，鉴定棉花品种纯度。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制溶液配制方法见附录B。7试验设置每份样品检测100个单株，进行单株DNA分析。7.2DNA的提取a)液氮/石英砂研磨叶片干样(嫩叶)0.2g,放入2.0ml离心管内；b)向离心管中加入800μLSolutionI,30μLβ-巯基乙醇，充分混匀，12000rpm离心10min,弃上清液；c)于沉淀中加入800μLSolutionII,30μLβ一巯基乙醇，轻摇混匀，65℃水浴40min,期间翻转混匀3次；d)加入800μL氯仿-异戊醇(V:V=24:1)混合液，翻转5min~10min,12000rpm离心10min,将上清液转至新离心管，弃沉淀；e)于上清液加入等体积氯仿-异戊醇(V:V=24:1),轻摇3min~5min,12000rpm离心5min,再将上清液转至新离心管，弃沉淀；f)于上清液中加入等体积异丙醇(-20℃),轻摇30次混匀，静置10min,12000rpm离心10g)于沉淀中加入70%乙醇洗涤，轻摇使乙醇与沉淀充分接触，倒掉乙醇，重复一次；h)使用90%乙醇洗涤一次，倒掉乙醇，通风干燥沉淀；7.3PCR扩增10μL的反应体积：DNA模板(60ngL'1μL,正、反向引物(4pmolL¹)各0.4L,10×Buffer扩增。395℃预变性4min,1个循环；94℃变性45s,55℃退火35s,72℃延伸45s,共35个循环；72℃延伸7min,4℃保存。SSR扩增产物采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，该方法技术成熟，操作简便且成本在10μLPCR产物中加入1.2μL上样缓冲液(2.5mg/mL溴酚兰、40%(m/V)蔗糖),充分混匀。用自来水清洗长、短玻璃板，用去离子水冲洗后晾干；将玻璃板安装到胶框上(胶厚1.0mm),用1%琼脂糖封底；待琼脂糖凝固后，将封好的胶框安装至电泳槽上，拧紧螺栓，胶框上沿应注意保持水平；在一定体积的8%非变性聚丙烯酰胺溶液中加入0.5%体积的10%过硫酸铵溶液和0.1%体积的金丝(电泳缓冲液可反复使用多次，每周更换一次);拔出梳齿；100V恒压，预电泳10min~30min。用移液器冲洗胶孔，清除气泡和杂质；每孔加样1μL～3μL;200V~没过胶面为准);0.2%AgNO3渗透液摇动渗透，12min,用适量ddH2O快速漂洗两到三次，每次时间不超过25s;在新配制的显影液中摇动直至显出清晰的条带；可在胶片7.5引物4本标准中，每份受检品种分别从核心引物中筛选5对引物用于SSR纯度检测，以保证检测的准确每份受检品种随机选取100个单株作为检测样本，每个品种分别选取5对特征引物作为纯度检测标8.3棉花品种纯度的判读按GB4407.1的规定执行。棉花常规种原种纯度(光籽或包衣种)应大于等于99%、良种(大田用种)(光籽或包衣种)纯度应大于等于95%以上；棉花杂交种亲本纯度应大于等于99%、杂交一代种毛籽纯度应大于等于95%以上，杂交一代种光籽纯度应大于等于99%以上；否则即为品种纯度不达标。5(规范性附录)A.1.1PCR扩增仪A.1.2高压电泳仪：规格为3000V、400mA、400W,具有恒电压、恒电流和恒功率功能A.1.3垂直电泳槽及配套的制胶附件A.1.5水平电泳槽及配套的制胶附件A.1.6高速冷冻离心机：最大离心力不小于15000gA.1.8胶片观察灯A.1.12紫外分光光度计：波长A.1.13微波炉A.1.14高压灭菌锅A.1.15酸度计A.1.19凝胶成像系统或紫外透射仪A.2.3异丙醇。A.2.4异戊醇。A.2.5乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O)。A.2.6三羟甲基氨基甲烷(TriA.2.7盐酸：37%A.2.9氯化钠。6A.2.19硼酸。7(规范性附录)NaCl:8.766gVc(抗坏血酸):0.1g加ddH2O定容至100mL丙烯酰胺290g和甲叉双丙烯酰胺10g,定容至1000mL。硼酸27.5g、Tris54g和EDTA3.732g,定容至1000mL。1gAPS粉剂，定容至10mL。溴酚蓝粉剂0.25g和蔗糖40g,加入80mL蒸馏水搅拌均匀。30%甲叉溶液10%APS溶液8B.3银染溶液的制备B.3.1固定液量取5mL冰醋酸和25mL无水乙醇，加去离子水定容至500mL。B.3.2染色液称取1g硝酸银，溶于400mL去离子水