基于内部核糖体进入位点提升重组NDV表达vvIBDV VP2基因效能研究

基于内部核糖体进入位点提升重组NDV表达vvIBDVVP2基因效能研究一、引言1.1研究背景新城疫（NewcastleDisease，ND）是由新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus，NDV）引起的一种急性、高度接触性禽类传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，在我国被列为一类动物疫病。NDV可感染多种禽类，包括鸡、火鸡、鸭、鹅等，发病率和死亡率都很高，给全球家禽养殖业带来了巨大的经济损失。根据病毒的致病性，NDV可分为强毒株、中等毒力毒株和弱毒株。强毒株感染可导致禽类急性死亡，死亡率高达100%，中等毒力毒株可引起呼吸道症状和一定程度的死亡，弱毒株感染通常只引起轻微的呼吸道症状或亚临床感染。鸡传染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要感染雏鸡和青年鸡，可导致免疫抑制，使鸡群对其他病原体的易感性增加，严重影响鸡群的健康和生产性能。IBDV主要侵害鸡的法氏囊，导致法氏囊淋巴细胞大量死亡，法氏囊萎缩，从而影响鸡的体液免疫功能。感染IBDV的鸡群，不仅对其他疫苗的免疫应答降低，而且容易继发其他传染病，如大肠杆菌病、新城疫等，给养鸡业带来严重的经济损失。近年来，随着养禽业的规模化和集约化发展，ND和IBD的防控面临着严峻的挑战。传统的疫苗接种虽然在一定程度上控制了这两种疾病的发生和传播，但由于病毒的不断变异和免疫逃逸，疫苗的保护效果逐渐下降。因此，开发新型的疫苗和防控技术具有重要的现实意义。基因工程技术的发展为病毒研究和疫苗开发提供了新的手段。通过基因工程技术，可以对病毒的基因进行改造和修饰，从而获得具有更好免疫原性和安全性的重组病毒疫苗。内部核糖体进入位点（InternalRibosomeEntrySite，IRES）是一段特殊的核酸序列，能够使核糖体在mRNA上不依赖于5'帽结构而直接启动翻译过程。IRES元件最初在病毒中被发现，后来在真核细胞中也有报道。在基因工程中，IRES常用于构建双顺反子表达载体，使一个转录本能够翻译出两个独立的蛋白质。将IRES元件引入重组NDV中，有望实现重组病毒对vvIBDVVP2基因的高效表达，从而开发出同时预防ND和IBD的新型二联疫苗。1.2NDV研究概述1.2.1NDV简介与特性新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus，NDV）是禽副粘病毒Ⅰ型（AvianparamyxovirustypeI,APMV-I）的代表成员，在最新分类系统中属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）、副粘病毒亚科（Paramyxovirina）、腮腺炎病毒属（Orthoavulavirus）。该病毒粒子呈多形性，大多呈球形，直径为100-500nm，最外层由脂质双层结构包裹，核心内含单股负链、不分节段的RNA，其基因组全长约15-16Kb，可编码6种特异性病毒结构蛋白，分别为核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，NP）、磷酸蛋白（Phosphoprotein，P）、基质蛋白（Matrixprotein，M）、融合蛋白（Fusionprotein，F）、血凝素-神经氨酸酶（Haemagglutinin-neuraminidaseprotein，HN）和大聚合酶链反应蛋白（Largeprotein，L）。NDV只有1种血清型，但存在多种基因型，根据决定病毒毒力的F蛋白序列可将病毒分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类，其中ClassⅠ有3种亚型，ClassⅡ至少有21种亚型。不同禽（鸟）类中流行的病毒基因型不同，在我国，分离到的NDV强毒株多为ClassⅡ中的基因Ⅶ型和基因Ⅸ型。依据病毒对鸡的致病性，NDV可分为强毒株、中等毒力毒株和弱毒株。弱毒株感染鸡群时，通常仅引发轻微的呼吸道感染症状，甚至不出现临床症状；中等毒力毒株会使鸡群出现呼吸道症状，死亡率处于中等水平；强毒株则可导致鸡群发生急性感染，鸡群表现出嗜睡、呼吸困难、产蛋量下降、持续的神经症状或严重腹泻等症状，死亡率高达100%。为准确区分这些病毒株，世界动物卫生组织（WOAH）引入了3个致病试验指数对NDV进行分类，即最小致死量致死鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄脑内接种致病指数（ICPI）和6周龄静脉接种致病指数（IVPI）。其中，ICPI从0（表示无症状）～2（表示禽类死亡）参数来衡量病毒的毒力，ICPI值低于0.6的为低致病性毒株，ICPI值介于0.7～1.6的为中等致病性毒株，ICPI值高于1.6的NDV毒株均被认定为高致病性毒株。1.2.2NDV反向遗传操作技术反向遗传操作技术是一种利用基因工程技术，对病毒基因组进行人为操作，从而实现对病毒生物学特性和致病机制深入研究的重要手段。其基本原理是将病毒的RNA反转录为cDNA，再通过PCR扩增等技术获得全长基因组片段，将该片段克隆到表达载体中，构建出病毒基因组表达载体。随后，通过转染细胞系，使载体中的基因组在细胞内转录出RNA，并包装成具有感染性的病毒粒子，从而实现对病毒基因组的精确操控。在NDV的研究中，反向遗传操作技术具有诸多重要应用。一方面，科研人员可通过该技术对NDV的基因进行敲除、置换、插入等操作，以研究病毒基因的功能及其在致病过程中的作用机制。例如，通过敲除NDV的某些毒力相关基因，可深入探究这些基因对病毒致病性的影响，为理解病毒的致病机理提供关键线索。另一方面，反向遗传操作技术在NDV疫苗研发领域也发挥着关键作用。通过对病毒基因进行改造，可开发出安全性更高、免疫效果更好的新型疫苗。如利用该技术构建缺失毒力基因的弱毒株作为疫苗株，既能保证疫苗的安全性，又能诱导机体产生有效的免疫应答，为新城疫的防控提供了有力的技术支持。1.2.3NDV活载体疫苗NDV作为活载体疫苗具有显著优势。首先，NDV具有广泛的宿主范围，能够感染多种禽类，这使得以NDV为载体构建的疫苗可同时预防多种禽类疾病，提高疫苗的通用性和应用价值。其次，NDV在禽类体内具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答，从而有效增强机体对病原体的抵抗力。此外，NDV的基因组相对较小，易于进行基因操作，方便将外源基因插入其基因组中，构建重组病毒疫苗。目前，NDV活载体疫苗在预防多种禽类疾病方面已得到广泛应用。例如，将其他禽类病原体的抗原基因插入NDV基因组中，构建出的重组NDV活载体疫苗可同时预防新城疫和其他相应疾病。在实际应用中，这些疫苗展现出良好的免疫保护效果，能够有效降低禽类疾病的发生率和死亡率，为养禽业的健康发展提供了重要保障。然而，NDV活载体疫苗在研发和应用过程中仍面临一些挑战，如外源基因的表达稳定性、疫苗的安全性评价等问题，需要进一步深入研究和解决。1.3IBDV研究概述1.3.1IBD与IBDV特性鸡传染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease，IBD）是一种对雏鸡危害极为严重的急性免疫抑制病，其病原体为鸡传染性法氏囊病病毒（InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV）。该病毒属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，具有单层衣壳，无囊膜结构，这使其对外界环境具有较强的抵抗力。IBD主要感染3-6周龄的鸡，感染鸡通常会在3-5天内急性发病。发病鸡群常出现啄肛现象，随后排出白色或黄白色水样粪便，同时伴有食欲减退、精神沉郁、羽毛逆立等症状，常因极度衰竭而死亡。该病的显著特点是突然发病、高发病率、集中死亡和迅速恢复，死亡曲线呈典型的尖峰状，死亡率一般在20%-30%，严重时可达50%。由于IBDV主要侵害鸡的法氏囊，导致法氏囊淋巴细胞大量死亡，法氏囊萎缩，从而使鸡的体液免疫功能受到严重影响。感染IBDV的鸡群，不仅对其他疫苗的免疫应答降低，而且容易继发其他传染病，如大肠杆菌病、新城疫等，给养鸡业带来巨大的经济损失。IBDV的形态较为独特，病毒粒子呈球形，直径约为55-60nm，由32个壳粒组成，呈正二十面体对称。其基因组由A、B两个双链RNA片段组成，其中A片段大小约为3.2kb，编码VP2、VP3和VP4三种蛋白；B片段大小约为2.8kb，编码VP1蛋白。VP2蛋白是IBDV的主要免疫原性蛋白，其氨基酸序列的变异与病毒的毒力和抗原性密切相关。不同地区分离的IBDV毒株在VP2蛋白的氨基酸序列上存在一定差异，这些差异可能导致病毒的毒力和抗原性发生改变，从而影响疫苗的免疫效果。1.3.2IBDV主要保护性抗原VP2VP2基因在IBDV的免疫保护中起着关键作用，是IBDV的主要保护性抗原。VP2蛋白位于病毒粒子的表面，含有多个抗原决定簇，能够诱导机体产生中和抗体，从而对IBDV的感染提供免疫保护。研究表明，VP2蛋白的某些特定氨基酸位点与病毒的毒力和免疫原性密切相关。例如，VP2蛋白高变区的氨基酸残基变异可导致病毒毒力增强或抗原性改变，进而影响疫苗的保护效果。当VP2蛋白的某些关键氨基酸发生突变时，可能会使病毒逃避机体的免疫识别，导致免疫失败。由于VP2蛋白在IBDV免疫保护中的重要作用，其成为了IBD疫苗研发的关键靶点。通过对VP2基因进行克隆、表达和修饰，可以制备出多种类型的IBD疫苗，如亚单位疫苗、基因工程疫苗等。这些疫苗能够有效诱导机体产生针对VP2蛋白的特异性免疫应答，从而预防IBDV的感染。在亚单位疫苗的研发中，通常将VP2蛋白的抗原决定簇进行表达和纯化，然后作为疫苗的有效成分。这种疫苗具有安全性高、免疫原性强等优点，能够为鸡群提供有效的免疫保护。1.3.3IBD免疫防治现状当前，IBD的免疫防治主要依靠疫苗接种和加强饲养管理。疫苗接种是预防IBD的重要手段，目前市场上的IBD疫苗主要包括弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗等。弱毒疫苗具有免疫效果好、成本低等优点，但存在毒力返强的风险；灭活疫苗安全性高，但免疫原性相对较弱，需要多次接种才能达到较好的免疫效果；基因工程疫苗则具有安全性高、免疫原性强、可定制等优点，是IBD疫苗研发的重要方向。在实际应用中，疫苗的选择和使用需要根据鸡群的免疫状态、饲养环境和疫情情况等因素进行综合考虑。同时，加强饲养管理，如保持鸡舍清洁卫生、合理通风、控制饲养密度等，也能够有效降低IBD的发生风险。然而，随着IBDV的不断变异和免疫逃逸现象的出现，传统疫苗的保护效果逐渐下降，免疫失败的情况时有发生。一些变异株的出现使得现有的疫苗无法提供有效的保护，导致鸡群仍然感染发病。因此，开发新型的IBD疫苗和免疫防治技术具有重要的现实意义。未来的研究可以进一步探索IBDV的致病机制和免疫逃逸机制，优化疫苗的设计和制备工艺，提高疫苗的免疫效果和稳定性，以更好地防控IBD的发生和传播。1.4内部核糖体进入位点（IRES）1.4.1IRES结构与功能内部核糖体进入位点（InternalRibosomeEntrySite，IRES）是一段特殊的核酸序列，最早于1988-1989年被分别在脊髓灰质炎病毒（PV）和脑心肌炎病毒（EMCV）中发现，随后在真核细胞的mRNA上也被证实存在。IRES能够使核糖体在mRNA上不依赖于5'帽结构而直接启动翻译过程，这一特性打破了传统的翻译起始模式，为基因表达调控研究开拓了新领域。IRES的结构具有复杂性和多样性。从序列特征来看，其长度和碱基组成在不同病毒和生物中差异显著，长度通常在几十到几百个核苷酸不等。在二级结构上，IRES可形成复杂的茎环结构，这些结构对于其功能的发挥至关重要。茎环结构中的特定区域能够与核糖体、翻译起始因子以及其他反式作用因子相互作用，从而招募核糖体小亚基到病毒mRNA的翻译起始位点。一些IRES元件的茎环结构中存在保守序列，这些保守序列在不同病毒株间具有较高的相似性，提示其在IRES功能中具有关键作用。在蛋白质翻译起始过程中，IRES发挥着独特的作用机制。对于依赖IRES元件翻译起始的RNA病毒，如脊髓灰质炎病毒，其IRES能够招募核糖体的40S亚基或使其与该区域结合，令核糖体在该区域开始组装，进而启动3'方向开放阅读框的转译。在细胞处于应激状态或病毒感染时，帽依赖性翻译起始途径可能受到抑制，而IRES介导的翻译起始方式则能够继续进行，保证细胞内关键蛋白质的合成，维持细胞的正常生理功能。当细胞受到病毒感染时，病毒的IRES元件可以利用细胞内有限的翻译资源，优先启动自身mRNA的翻译，从而实现病毒的大量增殖。1.4.2IRES在基因表达中的应用IRES在基因表达领域有着广泛且重要的应用。在构建双顺反子表达载体方面，IRES发挥着关键作用。将IRES元件插入到两个基因之间，可使一个转录本能够翻译出两个独立的蛋白质。在基因工程研究中，为了在真核细胞中表达两个不同的蛋白质，如一个报告基因和一个目的基因，常常利用IRES构建双顺反子表达载体。通过这种方式，第一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，而第二个蛋白则依靠IRES起始翻译。IRES前后的两个蛋白的表达通常是成比例的，因此可以根据其中一个报告基因的表达情况来反映另外一个蛋白的表达情况。在重组病毒构建中，IRES同样具有重要意义。以重组NDV为例，将IRES元件引入重组NDV中，可实现重组病毒对vvIBDVVP2基因的高效表达。通过反向遗传操作技术，将IRES序列和vvIBDVVP2基因插入到NDV基因组中，构建重组病毒。这样，在重组病毒感染宿主细胞后，IRES元件能够启动VP2基因的翻译，使其表达出具有免疫原性的VP2蛋白。这种方法为开发同时预防ND和IBD的新型二联疫苗提供了有效的技术手段。研究表明，利用IRES构建的重组NDV能够在鸡体内有效表达VP2蛋白，并诱导机体产生针对NDV和IBDV的特异性免疫应答，为鸡群提供双重保护。1.5研究目的与意义1.5.1研究目的本研究旨在利用内部核糖体进入位点（IRES）元件，提高重组新城疫病毒（NDV）对鸡传染性法氏囊病超强毒（vvIBDV）VP2基因的表达水平。通过构建携带IRES和vvIBDVVP2基因的重组NDV，深入探究IRES元件在促进VP2基因表达过程中的作用机制，以及重组病毒在细胞和动物模型中的生物学特性，从而为开发高效、安全的同时预防新城疫和鸡传染性法氏囊病的新型二联疫苗奠定坚实基础。1.5.2研究意义在实际应用层面，本研究成果对家禽疫苗开发和养殖业发展具有至关重要的意义。新城疫和鸡传染性法氏囊病是严重威胁养禽业的两大重要疫病，每年给全球养禽业造成巨大的经济损失。开发同时预防这两种疾病的新型二联疫苗，可显著提高疫苗的免疫效率，减少免疫次数和成本，降低劳动强度。这种二联疫苗还能有效减轻因多次免疫对鸡群造成的应激反应，有利于鸡群的健康生长和生产性能的提高，为养禽业的可持续发展提供有力保障。从学术研究角度来看，本研究对病毒基因工程研究具有积极的推动作用。内部核糖体进入位点（IRES）在病毒基因表达调控中是一个关键元件，然而目前其作用机制仍存在许多未知领域。通过本研究，能够进一步深入了解IRES元件在重组病毒中的功能和作用机制，为病毒基因工程研究提供新的思路和方法。这不仅有助于优化重组病毒疫苗的设计和构建，还能为其他病毒相关研究提供重要的参考和借鉴，推动整个病毒学领域的发展。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1病毒株、细胞株和质粒新城疫病毒（NDV）弱毒株LaSota，由本实验室保存。鸡传染性法氏囊病超强毒（vvIBDV）毒株HN06，分离自河南地区发病鸡群，经本实验室鉴定和保存。鸡胚成纤维细胞（DF-1）购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），用于病毒的增殖和培养。含有vvIBDVVP2基因的重组质粒pMD18-T-VP2，由本实验室构建并保存。内部核糖体进入位点（IRES）序列克隆自脑心肌炎病毒（EMCV），并构建到pUC57载体中，得到pUC57-IRES质粒，由本实验室构建。表达载体pCI-neo，购自Promega公司，用于构建重组表达质粒。2.1.2培养基及生化试剂细胞培养基为Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium（DMEM），购自Gibco公司，用于DF-1细胞的培养。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，用于补充培养基的营养成分。胰蛋白酶、青链霉素双抗溶液购自Solarbio公司，用于细胞的消化和防止细菌污染。Trizol试剂购自Invitrogen公司，用于提取病毒RNA。反转录试剂盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser、PCR扩增试剂盒TaKaRaTaq均购自TaKaRa公司，用于cDNA的合成和PCR扩增。限制性内切酶BamHI、EcoRI、XhoI等以及T4DNA连接酶购自NEB公司，用于质粒的构建和酶切鉴定。DNAMarker、ProteinMarker购自ThermoFisherScientific公司，用于核酸和蛋白质分子量的判断。2.1.3引物设计与合成根据GenBank中公布的vvIBDVVP2基因序列和IRES序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及相关信息如下表所示：引物名称引物序列（5'-3'）用途VP2-FATGGCCAAGACAGTGACGAC扩增VP2基因VP2-RTCACAGCTGACGGACAGCAG扩增VP2基因IRES-FCGGGATCCATGCCACGCCATCCTG扩增IRES序列，引入BamHI酶切位点IRES-RCCGCTCGAGTTAGGGAGGGAGGGCG扩增IRES序列，引入XhoI酶切位点合成后的引物经PAGE纯化，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，确保引物质量符合实验要求。2.1.4鸡胚来源与准备SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，胚龄为9-11日龄。鸡胚到达实验室后，先将其置于37℃、湿度为60%-70%的恒温孵化箱中孵化24h，观察鸡胚的活力和发育情况。挑选活力良好、发育正常的鸡胚用于后续实验。在使用前，用75%酒精棉球擦拭鸡胚表面进行消毒，然后在无菌条件下进行病毒接种等操作。2.1.5主要仪器设备实验中用到的主要仪器设备如下表所示：仪器名称型号生产厂家PCR仪Veriti96-WellThermalCyclerThermoFisherScientific离心机5424REppendorf荧光显微镜IX73Olympus二氧化碳培养箱3111ThermoFisherScientific凝胶成像系统GelDocXR+Bio-Rad超净工作台SW-CJ-2FD苏州净化设备有限公司2.2实验方法2.2.1vvIBDVVP2基因克隆与分析从保存的vvIBDV毒株HN06中提取病毒RNA。具体操作如下：取适量感染vvIBDV的鸡胚尿囊液，加入Trizol试剂，充分混匀后室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全裂解。随后加入氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min，4℃、12000rpm离心15min，此时溶液分为三层，取上层无色水相转移至新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃、12000rpm离心10min，可见管底出现白色沉淀，即为RNA。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀两次，4℃、7500rpm离心5min，弃上清，将沉淀室温晾干后，用适量的无RNase水溶解RNA。以提取的RNA为模板，使用反转录试剂盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser合成cDNA。反应体系为：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，OligodTPrimer（50μM）1μl，RandomHexamers（100μM）1μl，RNA模板适量，加RNaseFreedH₂O至总体积20μl。反应条件为：37℃15min，85℃5s，反应结束后，将cDNA保存于-20℃备用。以合成的cDNA为模板，利用引物VP2-F和VP2-R进行PCR扩增VP2基因。PCR反应体系为：2×TaKaRaTaqPCRMasterMix25μl，上游引物VP2-F（10μM）2μl，下游引物VP2-R（10μM）2μl，cDNA模板2μl，加ddH₂O至总体积50μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察结果。将目的条带切下，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。回收后的VP2基因片段连接到pMD18-T载体上，连接体系为：pMD18-TVector1μl，VP2基因片段4μl，SolutionI5μl，混匀后16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体操作如下：取100μlDH5α感受态细胞，加入5μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2min；加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养1h；将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取平板上的单菌落，接种到含有Amp的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。提取质粒，使用BamHI和EcoRI进行双酶切鉴定，酶切体系为：质粒2μl，10×Buffer2μl，BamHI1μl，EcoRI1μl，加ddH₂O至总体积20μl，37℃酶切2h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定正确的重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。使用DNAStar、DNAMAN等软件对测定的VP2基因序列进行分析，包括与GenBank中已登录的vvIBDVVP2基因序列进行同源性比较，分析其核苷酸和氨基酸序列的变异情况，预测VP2蛋白的二级结构和抗原表位等。2.2.2IRES基因克隆与分析以含有IRES序列的pUC57-IRES质粒为模板，利用引物IRES-F和IRES-R进行PCR扩增IRES基因。PCR反应体系为：2×TaKaRaTaqPCRMasterMix25μl，上游引物IRES-F（10μM）2μl，下游引物IRES-R（10μM）2μl，pUC57-IRES质粒模板2μl，加ddH₂O至总体积50μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。回收后的IRES基因片段连接到pMD18-T载体上，连接体系和转化方法同vvIBDVVP2基因克隆。挑取单菌落进行培养，提取质粒，使用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，酶切体系和条件同VP2基因重组质粒鉴定。鉴定正确的重组质粒送测序，对测定的IRES基因序列进行分析，包括与已知的IRES序列进行同源性比较，分析其二级结构和功能元件等。利用RNAstructure软件预测IRES的二级结构，观察其茎环结构和保守序列，分析这些结构与IRES功能的关系。2.2.3重组质粒构建将含有vvIBDVVP2基因的重组质粒pMD18-T-VP2和表达载体pCI-neo分别用BamHI和EcoRI进行双酶切。酶切体系为：质粒5μl，10×Buffer5μl，BamHI2μl，EcoRI2μl，加ddH₂O至总体积50μl，37℃酶切3h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒分别回收VP2基因片段和线性化的pCI-neo载体。将回收的VP2基因片段和线性化的pCI-neo载体进行连接，连接体系为：线性化pCI-neo载体1μl，VP2基因片段4μl，T4DNA连接酶1μl，10×T4DNALigaseBuffer1μl，加ddH₂O至总体积10μl，16℃连接过夜，得到重组质粒pCI-VP2。用BamHI和XhoI对重组质粒pCI-VP2和含有IRES基因的重组质粒pMD18-T-IRES进行双酶切，酶切体系和条件同前。回收IRES基因片段和线性化的pCI-VP2载体，将两者连接，得到重组质粒pCI-VP2-IRES。再次用BamHI和EcoRI对重组质粒pCI-VP2-IRES和pMD18-T-VP2进行双酶切，回收VP2基因片段和线性化的pCI-VP2-IRES载体，连接后得到重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2。将构建好的重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素（Kan）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落进行培养，提取质粒，通过酶切鉴定和PCR鉴定验证重组质粒的正确性。2.2.4重组病毒基因组cDNA构建将重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2用NotI进行单酶切，使其线性化。酶切体系为：重组质粒10μl，10×Buffer2μl，NotI2μl，加ddH₂O至总体积20μl，37℃酶切3h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用DNA凝胶回收试剂盒回收线性化的pCI-VP2-IRES-VP2质粒。同时，从保存的NDV弱毒株LaSota中提取病毒RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，利用特异性引物扩增NDV基因组全长cDNA。PCR反应条件和体系根据引物和扩增片段的特点进行优化。将扩增得到的NDV基因组全长cDNA片段和线性化的pCI-VP2-IRES-VP2质粒进行连接，连接体系和条件参考T4DNA连接酶的使用说明。连接产物转化至感受态细胞中，通过筛选和鉴定获得含有表达VP2-IRES-VP2重组病毒基因组全长cDNA的阳性克隆。2.2.5重组NDV拯救及鉴定将含有重组病毒基因组全长cDNA的阳性克隆提取质粒，转染至DF-1细胞中进行重组病毒的拯救。转染前，将DF-1细胞接种于6孔板中，培养至80%-90%融合。按照Lipofectamine3000转染试剂的说明书进行操作，将重组质粒与转染试剂混合，室温孵育15min后，加入到DF-1细胞中，37℃、5%CO₂培养箱中培养。转染后6h，更换为含有10%FBS的DMEM培养基继续培养。在培养过程中，观察细胞病变效应（CPE），当出现明显的CPE时，收集细胞培养上清，即为拯救的重组NDV。将收集的重组NDV接种于9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中，0.2ml/胚，37℃继续孵化。接种后每天照蛋观察鸡胚的死亡情况，收集24-120h死亡鸡胚的尿囊液，进行后续鉴定。采用RT-PCR方法对拯救的重组NDV进行鉴定。以收集的尿囊液提取RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用特异性引物扩增VP2基因和IRES基因。PCR反应体系和条件同前，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现目的条带。测定重组NDV的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀），以评估病毒的感染性和滴度。将重组NDV尿囊液进行10倍系列稀释，从10⁻¹到10⁻¹⁰，每个稀释度接种8孔DF-1细胞，每孔接种100μl，同时设置正常细胞对照。37℃、5%CO₂培养箱中培养72h，观察CPE，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀。2.2.6重组病毒VP2基因表达检测采用间接免疫荧光试验（IFA）检测重组病毒在DF-1细胞中VP2基因的表达。将DF-1细胞接种于24孔板中，待细胞长至80%融合时，接种重组NDV，以感染野生型NDVLaSota的DF-1细胞作为对照。感染后24h，弃去培养液，用PBS洗涤细胞3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗涤3次，每次5min。加入0.1%TritonX-100通透细胞10min，PBS洗涤3次，每次5min。加入5%BSA封闭液，37℃孵育1h，弃去封闭液，不洗涤。加入鼠抗vvIBDVVP2单克隆抗体（1:100稀释），37℃孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min。加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1:200稀释），37℃避光孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min。在荧光显微镜下观察，阳性细胞应呈现绿色荧光。利用Real-timePCR检测重组病毒VP2基因的表达水平。提取感染重组NDV和野生型NDVLaSota的DF-1细胞总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物进行Real-timePCR扩增。反应体系为：2×SYBRGreenMasterMix10μl，上游引物（10μM）0.5μl，下游引物（10μM）0.5μl，cDNA模板2μl，加ddH₂O至总体积20μl。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以β-actin基因作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算VP2基因的相对表达量。2.2.7重组病毒增殖稳定性分析将重组NDV在DF-1细胞中连续传代10次，每次传代时，收集细胞培养上清，测定病毒滴度（TCID₅₀）。观察每次传代后病毒滴度的变化情况，分析重组病毒在细胞培养过程中的增殖稳定性。同时，对第1代和第10代重组病毒进行RT-PCR和测序分析，检测VP2基因和IRES基因的序列是否发生变化，以评估重组病毒的遗传稳定性。将重组NDV接种于9-11日龄的SPF鸡胚中，连续传代10次。每次传代时，收集鸡胚尿囊液，测定病毒滴度（TCID₅₀）。观察鸡胚的死亡情况和病变特征，分析重组病毒在鸡胚传代过程中的增殖稳定性和致病性变化。对不同代次的重组病毒进行基因测序，检测VP2基因和IRES基因的序列变异情况，进一步验证重组病毒在鸡胚中的遗传稳定性。三、实验结果3.1基因克隆结果通过PCR扩增技术，成功从vvIBDV毒株HN06中克隆得到VP2基因，从pUC57-IRES质粒中克隆得到IRES基因。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。在图1中，M为DNAMarker，1泳道为VP2基因PCR扩增产物，可见在约1.3kb处出现特异性条带，与预期的VP2基因大小相符；2泳道为IRES基因PCR扩增产物，在约0.6kb处出现特异性条带，与预期的IRES基因大小一致。这表明VP2基因和IRES基因均成功扩增。图1：VP2基因和IRES基因PCR扩增产物电泳图。M：DNAMarker；1：VP2基因PCR扩增产物；2：IRES基因PCR扩增产物。将VP2基因和IRES基因的PCR扩增产物分别连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行培养，提取质粒进行酶切鉴定。VP2基因重组质粒经BamHI和EcoRI双酶切后，电泳结果显示在约1.3kb处出现VP2基因片段，在约2.7kb处出现pMD18-T载体片段（图2，M为DNAMarker，1泳道为未酶切的重组质粒，2泳道为双酶切后的重组质粒）；IRES基因重组质粒经BamHI和XhoI双酶切后，在约0.6kb处出现IRES基因片段，在约2.7kb处出现pMD18-T载体片段（图2，3泳道为未酶切的重组质粒，4泳道为双酶切后的重组质粒）。酶切鉴定结果表明，VP2基因和IRES基因均成功克隆到pMD18-T载体中。图2：VP2基因和IRES基因重组质粒酶切鉴定电泳图。M：DNAMarker；1：未酶切的VP2基因重组质粒；2：BamHI和EcoRI双酶切后的VP2基因重组质粒；3：未酶切的IRES基因重组质粒；4：BamHI和XhoI双酶切后的IRES基因重组质粒。将酶切鉴定正确的重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果经DNAStar、DNAMAN等软件分析，与GenBank中已登录的vvIBDVVP2基因序列和IRES序列进行比对，结果显示，克隆得到的VP2基因与参考序列的同源性高达99%，仅有几个核苷酸发生了同义突变，未引起氨基酸序列的改变；克隆得到的IRES基因与参考序列的同源性为98%，在一些非关键区域存在少量碱基差异，但不影响其功能元件的结构和活性。这进一步证实了克隆得到的VP2基因和IRES基因的准确性和可靠性。3.2重组质粒鉴定对构建的重组质粒pCI-VP2、pCI-VP2-IRES和pCI-VP2-IRES-VP2进行酶切鉴定。将重组质粒pCI-VP2用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。M为DNAMarker，1泳道为未酶切的重组质粒pCI-VP2，2泳道为双酶切后的产物，可见在约1.3kb处出现VP2基因片段，在约6.0kb处出现线性化的pCI-neo载体片段，与预期结果相符，表明VP2基因已成功插入到pCI-neo载体中。图3：重组质粒pCI-VP2酶切鉴定电泳图。M：DNAMarker；1：未酶切的重组质粒pCI-VP2；2：BamHI和EcoRI双酶切后的重组质粒pCI-VP2。用BamHI和XhoI对重组质粒pCI-VP2-IRES进行双酶切鉴定，结果如图4所示。M为DNAMarker，1泳道为未酶切的重组质粒pCI-VP2-IRES，2泳道为双酶切后的产物，在约0.6kb处出现IRES基因片段，在约7.3kb处出现含有VP2基因的线性化载体片段，说明IRES基因已成功插入到pCI-VP2载体中。图4：重组质粒pCI-VP2-IRES酶切鉴定电泳图。M：DNAMarker；1：未酶切的重组质粒pCI-VP2-IRES；2：BamHI和XhoI双酶切后的重组质粒pCI-VP2-IRES。对重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，结果如图5所示。M为DNAMarker，1泳道为未酶切的重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2，2泳道为双酶切后的产物，在约1.3kb处出现第二个VP2基因片段，在约7.9kb处出现含有VP2-IRES的线性化载体片段，证实第二个VP2基因已成功插入到pCI-VP2-IRES载体中。图5：重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2酶切鉴定电泳图。M：DNAMarker；1：未酶切的重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2；2：BamHI和EcoRI双酶切后的重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2。将酶切鉴定正确的重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果经DNAMAN软件与预期的重组质粒序列进行比对，结果显示，重组质粒pCI-VP2-IRES-VP2的序列与预期完全一致，VP2基因、IRES基因以及各酶切位点等均正确无误，表明重组质粒构建成功。3.3重组病毒拯救与鉴定通过转染含有重组病毒基因组全长cDNA的质粒到DF-1细胞中，成功拯救出重组NDVrClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2。转染后，在37℃、5%CO₂培养箱中培养，观察到细胞病变效应（CPE）逐渐出现，细胞变圆、皱缩，部分细胞脱落，这表明重组病毒在细胞内成功增殖。收集出现明显CPE的细胞培养上清，接种于9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中进行进一步培养。接种后每天照蛋观察鸡胚的死亡情况，在24-120h内，部分鸡胚出现死亡，死亡鸡胚的尿囊液浑浊，表明重组病毒在鸡胚中也能够有效增殖。对拯救的重组NDV进行RT-PCR鉴定，结果如图6所示。以收集的尿囊液提取RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用特异性引物扩增VP2基因和IRES基因。M为DNAMarker，1泳道为rClone30-VP2-IRES-VP2重组病毒RT-PCR扩增产物，可见在约1.3kb处出现VP2基因条带，在约0.6kb处出现IRES基因条带；2泳道为rClone30-VP2重组病毒RT-PCR扩增产物，仅在约1.3kb处出现VP2基因条带；3泳道为阴性对照（未感染病毒的鸡胚尿囊液），无特异性条带出现。结果表明，重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2中均含有目的基因VP2，rClone30-VP2-IRES-VP2中还含有IRES基因，与预期结果一致，成功拯救出重组病毒。图6：重组NDVRT-PCR鉴定电泳图。M：DNAMarker；1：rClone30-VP2-IRES-VP2重组病毒RT-PCR扩增产物；2：rClone30-VP2重组病毒RT-PCR扩增产物；3：阴性对照。3.4重组病毒VP2基因表达采用间接免疫荧光试验（IFA）检测重组病毒VP2基因在DF-1细胞中的表达情况。结果如图7所示，感染重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2的DF-1细胞在荧光显微镜下均可见绿色荧光，表明VP2蛋白在感染细胞中得到表达；而感染野生型NDVLaSota的DF-1细胞以及未感染病毒的正常DF-1细胞均未出现绿色荧光，说明野生型NDVLaSota不表达VP2蛋白，正常细胞也无VP2蛋白的本底表达。图7：重组病毒感染DF-1细胞的IFA检测结果。A：感染rClone30-VP2-IRES-VP2的DF-1细胞；B：感染rClone30-VP2的DF-1细胞；C：感染野生型NDVLaSota的DF-1细胞；D：未感染病毒的正常DF-1细胞。绿色荧光表示VP2蛋白的表达。利用Real-timePCR检测重组病毒VP2基因的mRNA水平，以感染野生型NDVLaSota的DF-1细胞作为对照，以β-actin基因作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算VP2基因的相对表达量。结果如图8所示，重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2基因的mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明IRES元件的引入能够有效提高重组NDV对vvIBDVVP2基因的表达水平，为进一步研究重组病毒的免疫效果奠定了基础。图8：重组病毒VP2基因mRNA水平的Real-timePCR检测结果。*表示与rClone30-VP2相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。3.5重组病毒增殖稳定性将重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2在DF-1细胞中连续传代10次，测定每次传代后的病毒滴度（TCID₅₀），结果如图9所示。由图9可知，两株重组病毒在连续传代过程中，病毒滴度虽有一定波动，但整体较为稳定，均维持在较高水平，且与亲本NDVLaSota株的病毒滴度无显著差异（P>0.05）。这表明重组病毒在细胞培养中具有良好的增殖稳定性，外源基因的插入和IRES元件的引入并未对病毒的增殖能力产生明显影响。图9：重组病毒在DF-1细胞中的生长曲线。rClone30-VP2-IRES-VP2（■）；rClone30-VP2（▲）；NDVLaSota（●）。对第1代和第10代重组病毒进行RT-PCR和测序分析，结果显示，VP2基因和IRES基因的序列均未发生变化，表明重组病毒在传代过程中具有良好的遗传稳定性，能够稳定表达目的基因。将重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2接种于9-11日龄的SPF鸡胚中，连续传代10次，测定每次传代后的病毒滴度（TCID₅₀），观察鸡胚的死亡情况和病变特征。结果表明，重组病毒在鸡胚中也能够稳定增殖，病毒滴度维持在较高水平，且鸡胚的死亡情况和病变特征与亲本NDVLaSota株相似。对不同代次的重组病毒进行基因测序，VP2基因和IRES基因的序列无明显变异，进一步验证了重组病毒在鸡胚中的遗传稳定性。四、讨论4.1vvIBDVVP2基因选择依据本研究选择vvIBDVHLJ07株VP2基因进行重组NDV的构建，具有充分的科学依据。VP2基因作为IBDV的主要免疫原性蛋白编码基因，在病毒的免疫保护中发挥着核心作用。其氨基酸序列的变异与病毒的毒力和抗原性密切相关，含有多个抗原决定簇，能够诱导机体产生中和抗体，对IBDV的感染提供免疫保护。从免疫原性角度来看，vvIBDVHLJ07株VP2基因具有较强的免疫原性。研究表明，该基因所编码的VP2蛋白能够有效刺激机体的免疫系统，引发强烈的免疫应答。当机体受到vvIBDV感染时，VP2蛋白作为主要的抗原物质，能够被免疫系统识别，进而激活B淋巴细胞，促使其分化为浆细胞，分泌特异性的中和抗体。这些中和抗体能够与病毒表面的VP2蛋白结合，阻止病毒与宿主细胞的吸附和侵入，从而发挥免疫保护作用。与其他毒株的VP2基因相比，HLJ07株VP2基因在关键氨基酸位点上具有独特的序列特征，这些特征可能影响VP2蛋白的空间构象，使其更易于被免疫系统识别和攻击，从而增强了免疫原性。从保护性抗原特性方面分析，vvIBDVHLJ07株VP2基因所表达的VP2蛋白是IBDV的主要保护性抗原。VP2蛋白位于病毒粒子的表面，直接暴露于外界环境中，是病毒与宿主免疫系统相互作用的关键部位。其含有的多个抗原决定簇能够与宿主免疫系统中的抗体特异性结合，从而引发免疫反应。当机体接种含有HLJ07株VP2基因的疫苗后，VP2蛋白能够诱导机体产生针对IBDV的特异性免疫应答，包括体液免疫和细胞免疫。在体液免疫方面，产生的中和抗体能够中和病毒，阻止病毒的感染和传播；在细胞免疫方面，激活的T淋巴细胞能够识别并杀伤被病毒感染的细胞，从而清除病毒。因此，选择vvIBDVHLJ07株VP2基因用于重组NDV的构建，有望使重组病毒表达具有良好免疫原性和保护性的VP2蛋白，为鸡群提供有效的免疫保护。4.2IRES选择与作用本研究选用脑心肌炎病毒（EMCV）的IRES序列，主要基于以下几方面的考虑。从IRES元件的特性来看，EMCV的IRES在多种细胞和病毒系统中都展现出了高效的翻译起始活性。在一些基于真核细胞的基因表达研究中，将EMCV的IRES引入表达载体后，能够显著提高下游基因的表达水平。与其他常见的IRES元件，如脊髓灰质炎病毒（PV）的IRES相比，EMCV的IRES在宿主细胞范围和翻译效率上具有独特优势。PV的IRES虽然也能有效启动翻译，但对宿主细胞的种类有一定的偏好性，在某些细胞系中的活性相对较低；而EMCV的IRES则能够在更广泛的细胞类型中发挥作用，包括本研究中使用的鸡胚成纤维细胞（DF-1），这为重组NDV在不同细胞环境中的高效表达提供了保障。从功能验证和应用经验角度分析，EMCV的IRES在重组病毒构建领域已有成功的应用案例。在一些重组病毒疫苗的研发中，将EMCV的IRES引入重组病毒基因组，有效实现了外源基因的高效表达，并且不影响病毒的增殖和感染特性。在构建表达外源抗原的重组腺病毒时，利用EMCV的IRES元件成功实现了抗原基因的稳定表达，增强了疫苗的免疫原性。这些成功案例为本研究选择EMCV的IRES提供了重要的参考和借鉴，增加了本研究成功构建高效表达VP2基因的重组NDV的可能性。在提高重组NDV对vvIBDVVP2基因表达方面，IRES发挥着至关重要的作用。其作用机制主要体现在以下几个方面。IRES能够介导VP2基因的高效翻译。在重组NDV感染宿主细胞后，病毒基因组转录产生的mRNA包含IRES序列和VP2基因。IRES元件独特的结构能够招募核糖体等翻译起始因子，使核糖体直接结合到IRES区域，从而启动VP2基因的翻译过程。与传统的依赖5'帽结构的翻译起始方式不同，IRES介导的翻译起始不受细胞内一些翻译调控因素的影响，即使在细胞处于应激状态或病毒感染导致帽依赖性翻译起始途径受到抑制时，IRES仍能保证VP2基因的持续翻译，从而提高VP2蛋白的表达水平。研究表明，在病毒感染细胞的过程中，细胞内的一些翻译起始因子会优先参与病毒自身mRNA的翻译，导致宿主细胞的帽依赖性翻译受到抑制，但IRES介导的VP2基因翻译不受影响，保证了VP2蛋白的正常合成。IRES还能促进mRNA的稳定性和翻译效率。IRES序列形成的复杂二级结构能够与细胞内的一些RNA结合蛋白相互作用，这些相互作用有助于保护mRNA免受核酸酶的降解，延长mRNA的半衰期，从而增加了VP2基因的转录本数量，为VP2蛋白的表达提供了更多的模板。IRES与核糖体和翻译起始因子的结合能够优化翻译起始复合物的组装，提高翻译效率，使VP2基因能够更快速、高效地翻译为VP2蛋白。在一些细胞实验中，通过对含有IRES的mRNA进行半衰期测定，发现其半衰期明显长于不含有IRES的mRNA，同时检测VP2蛋白的合成速度，发现含有IRES的重组病毒感染细胞后，VP2蛋白的合成速度更快，进一步证实了IRES对mRNA稳定性和翻译效率的促进作用。4.3外源基因插入位置影响外源基因插入NDV基因组的位置对病毒的复制和基因表达有着显著的影响。在本研究中，将vvIBDVVP2基因插入到NDV基因组的不同位置，构建了重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2，并对其进行了深入研究。从病毒复制方面来看，不同插入位置的重组病毒在DF-1细胞和SPF鸡胚中的复制能力存在差异。研究表明，重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2在DF-1细胞中的生长曲线与亲本NDVLaSota株相似，病毒滴度在连续传代过程中虽有一定波动，但整体较为稳定，均维持在较高水平。这表明将VP2基因和IRES元件插入到该位置，对病毒的复制能力影响较小，病毒能够在细胞内稳定增殖。而rClone30-VP2在细胞中的复制能力相对较弱，病毒滴度在传代过程中略有下降。这可能是由于VP2基因的插入位置影响了病毒基因组的结构和功能，进而影响了病毒的复制效率。在基因表达方面，VP2基因插入位置的不同导致其表达水平存在明显差异。Real-timePCR检测结果显示，rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2基因的mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2。这说明IRES元件的引入以及VP2基因的特定插入位置，能够有效提高VP2基因的表达水平。IRES元件能够介导VP2基因的高效翻译，其独特的结构能够招募核糖体等翻译起始因子，使核糖体直接结合到IRES区域，从而启动VP2基因的翻译过程。VP2基因的插入位置可能影响了其周围的基因调控元件，使得VP2基因的转录和翻译效率得到提高。从病毒生物学特性角度分析，外源基因插入位置还可能影响病毒的毒力、免疫原性等生物学特性。将外源基因插入到NDV基因组的某些关键位置，可能会破坏病毒的毒力相关基因或影响其表达，从而降低病毒的毒力。在免疫原性方面，合适的插入位置能够使外源基因更好地表达，从而增强病毒的免疫原性，激发机体产生更强的免疫应答。然而，如果插入位置不当，可能会导致外源基因表达不稳定或免疫原性降低，影响重组病毒作为疫苗的效果。4.4重组NDV构建与拯救关键因素在重组NDV的构建与拯救过程中，多个关键因素对实验的成功起着决定性作用。首先，重组质粒的构建是基础且关键的环节。在构建重组质粒时，目的基因（如vvIBDVVP2基因）与载体（如pCI-neo载体）的连接效率直接影响后续实验的开展。连接反应中，T4DNA连接酶的活性、连接体系的比例以及反应时间和温度等条件都需要精确控制。若连接效率低下，可能导致重组质粒的产量不足，影响后续的转染和病毒拯救。转染效率是影响重组病毒拯救的重要因素之一。将重组质粒转染至宿主细胞（如DF-1细胞）时，转染试剂的选择和使用方法至关重要。本研究中使用的Lipofectamine3000转染试剂，其与重组质粒的比例、转染操作的准确性以及细胞的状态都会对转染效率产生影响。若转染效率过低，重组质粒无法有效进入细胞，就难以实现病毒基因组的复制和组装，从而无法成功拯救出重组病毒。宿主细胞的状态对重组病毒的拯救也有着显著影响。健康、生长旺盛的DF-1细胞能够为重组病毒的复制和装配提供良好的环境。在实验中，需要严格控制细胞的培养条件，包括培养基的成分、温度、二氧化碳浓度等，确保细胞处于最佳状态。若细胞受到污染或生长状态不佳，可能导致重组病毒的拯救失败。在重组病毒拯救过程中，对细胞病变效应（CPE）的观察和判断是确定病毒拯救成功的重要依据。然而，CPE的出现可能受到多种因素的干扰，如细胞自身的病变、其他微生物的污染等。因此，需要结合多种检测方法，如RT-PCR、间接免疫荧光试验等，准确判断重组病毒是否成功拯救。针对以上关键因素，可以采取一系列优化策略。在重组质粒构建方面，优化连接体系，进行预实验确定最佳的连接条件，同时对连接产物进行严格的鉴定，确保重组质粒的质量。在转染过程中，根据细胞类型和实验条件，优化转染试剂与重组质粒的比例，规范转染操作流程，提高转染效率。对于宿主细胞，建立严格的细胞培养和质量控制体系，定期检测细胞的纯度和活性，确保细胞处于良好状态。在检测重组病毒时，综合运用多种检测方法，提高检测的准确性和可靠性。4.5重组病毒增殖能力分析本研究对重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2的增殖能力进行了深入分析，旨在探究VP2基因和IRES对病毒复制的影响。通过在DF-1细胞和SPF鸡胚中进行病毒增殖实验，对比重组病毒与亲本病毒的生长曲线和病毒滴度，获得了重要的实验结果。在DF-1细胞中，将重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2、rClone30-VP2以及亲本NDVLaSota株以相同的感染复数（MOI）接种细胞，定期收集细胞培养上清，测定病毒滴度（TCID₅₀），绘制生长曲线。结果显示，重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2在接种后的前24h内，病毒滴度增长较为缓慢，与亲本NDVLaSota株相似。随着培养时间的延长，从24h到72h，两株重组病毒的病毒滴度均呈现出快速上升的趋势，且与亲本NDVLaSota株的增长速率相近，在72h时，病毒滴度均达到较高水平，且三者之间无显著差异（P>0.05）。这表明在细胞培养环境中，VP2基因的插入和IRES元件的引入并未对病毒的增殖能力产生明显的负面影响，重组病毒能够在细胞内稳定复制，保持与亲本病毒相当的增殖水平。在SPF鸡胚实验中，将重组病毒和亲本病毒分别接种于9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中，接种后每天照蛋观察鸡胚的死亡情况，收集不同时间点死亡鸡胚的尿囊液，测定病毒滴度。结果表明，重组病毒rClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2在鸡胚中的增殖能力与亲本NDVLaSota株相似。在接种后的24-48h，鸡胚开始出现死亡，重组病毒和亲本病毒的尿囊液病毒滴度逐渐升高，且三者之间的病毒滴度无显著差异（P>0.05）。随着时间的推移，在48-120h内，病毒滴度继续上升，但增长趋势逐渐趋于平缓，重组病毒与亲本病毒的病毒滴度仍保持在相近水平。这进一步证实了在鸡胚中，重组病毒能够稳定增殖，VP2基因和IRES元件的存在未对病毒的复制产生明显的阻碍作用。综合细胞和鸡胚实验结果，VP2基因的插入以及IRES元件的引入，对重组NDV的增殖能力影响较小。这可能是因为NDV基因组具有较强的可塑性，能够容纳外源基因的插入而不显著影响其基本的复制和转录功能。IRES元件虽然改变了基因的表达模式，但并未干扰病毒的正常生命周期。从病毒复制机制角度分析，NDV的复制主要依赖于自身的RNA聚合酶和相关的病毒蛋白，VP2基因的插入和IRES元件的存在可能并未影响到这些关键复制元件的功能和相互作用，从而使得重组病毒能够保持与亲本病毒相似的增殖能力。4.6重组病毒VP2基因表达量比较本研究中，通过构建表达双拷贝VP2基因的重组NDV（rClone30-VP2-IRES-VP2）和表达单拷贝VP2基因的重组NDV（rClone30-VP2），并对两者的VP2基因表达量进行比较，发现rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2基因的mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2。这一结果表明，双拷贝VP2基因在重组病毒中的表达具有显著优势。从基因表达调控角度分析，双拷贝VP2基因增加了基因的拷贝数，使得在相同的转录和翻译条件下，能够产生更多的mRNA转录本和VP2蛋白。这为机体提供了更多的抗原刺激，有助于增强免疫应答。当机体感染rClone30-VP2-IRES-VP2时，细胞内大量表达的VP2蛋白能够更有效地激活免疫系统中的T淋巴细胞和B淋巴细胞，促使T淋巴细胞分化为效应T细胞，杀伤被病毒感染的细胞；B淋巴细胞分化为浆细胞，分泌更多的特异性抗体，从而提高机体对IBDV的免疫保护能力。IRES元件在双拷贝VP2基因的表达中起到了关键的协同作用。IRES能够介导VP2基因的高效翻译，使得双拷贝VP2基因能够充分表达。IRES独特的结构能够招募核糖体等翻译起始因子，使核糖体直接结合到IRES区域，启动VP2基因的翻译过程，不受细胞内一些翻译调控因素的影响。即使在细胞处于应激状态或病毒感染导致帽依赖性翻译起始途径受到抑制时，IRES仍能保证VP2基因的持续翻译，从而提高VP2蛋白的表达水平。在rClone30-VP2-IRES-VP2中，IRES元件促进了两个VP2基因的翻译，进一步增强了双拷贝VP2基因的表达优势。双拷贝VP2基因在重组病毒中的高效表达对疫苗研发具有重要意义。在疫苗设计中，更高水平的抗原表达能够增强疫苗的免疫原性，提高疫苗的保护效果。将表达双拷贝VP2基因的重组NDV作为疫苗候选株，有望为鸡群提供更有效的免疫保护，预防IBDV的感染。由于双拷贝VP2基因的表达优势，疫苗的使用剂量可能可以适当降低，从而减少疫苗生产的成本和潜在的不良反应。五、结论5.1研究成果总结本研究成功构建了表达vvIBDVVP2基因的重组NDV，通过引入IRES元件，有效提高了VP2基因的表达水平。经实验验证，重组病毒在细胞和鸡胚中均能稳定增殖，且遗传稳定性良好。具体研究成果如下：基因克隆与重组质粒构建：从vvIBDV毒株HN06中成功克隆得到VP2基因，从pUC57-IRES质粒中克隆得到IRES基因。通过一系列的酶切、连接和转化等操作，成功构建了重组质粒pCI-VP2、pCI-VP2-IRES和pCI-VP2-IRES-VP2，并经酶切鉴定和测序验证，确认重组质粒构建正确。重组病毒拯救与鉴定：将含有重组病毒基因组全长cDNA的质粒转染至DF-1细胞中，成功拯救出重组NDVrClone30-VP2-IRES-VP2和rClone30-VP2。通过RT-PCR鉴定，证实重组病毒中含有目的基因VP2和IRES，表明重组病毒拯救成功。重组病毒VP2基因表达检测：采用间接免疫荧光试验（IFA）和Real-timePCR检测重组病毒VP2基因的表达情况。IFA结果显示，感染重组病毒的DF-1细胞中VP2蛋白得到表达；Real-timePCR结果表明，rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2基因的mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2，说明IRES元件的引入能够有效提高VP2基因的表达水平。重组病毒增殖稳定性分析：将重组病毒在DF-1细胞和SPF鸡胚中连续传代10次，测定病毒滴度并进行基因测序。结果表明，重组病毒在传代过程中病毒滴度稳定，VP2基因和IRES基因的序列未发生变化，说明重组病毒具有良好的增殖稳定性和遗传稳定性。5.2研究创新点与不足本研究具有显著的创新点。在重组病毒构建方面，创新性地构建了表达vvIBDVVP2基因的重组NDV，并通过引入IRES元件，实现了VP2基因的高效表达。这种双基因重组病毒的构建策略，为开发同时预防新城疫和鸡传染性法氏囊病的新型二联疫苗提供了新的思路和方法，具有重要的应用价值。