鱼露和酱油的细菌回复突变实验研究

福建医科大学公共卫生学院毕业论文PAGE2鱼露和酱油的致突变性研究StudyonMutagenicityofFishSauceandSoySauce目录TOC\o"1-4"\h\z\u摘要 错误!未定义书签。IAbstract 错误!未定义书签。II前言 -3--1-1材料与方法 错误!未定义书签。-1-1.1研究材料 错误!未定义书签。-1-1.2研究方法 错误!未定义书签。-1-2结果与分析 -3--2-2.1鱼露与酱油原液检测结果 错误!未定义书签。-2-2.2去组氨酸鱼露与酱油检测结果 错误!未定义书签。-3-3讨论 错误!未定义书签。-4-结论 -6--7-致谢 -9--8-参考文献 -10--9-综述 错误!未定义书签。-10II鱼露和酱油的细菌回复突变实验研究摘要目的研究鱼露和酱油是否具有致突变性。方法分别将鱼露和酱油分成4个不同剂量处理组：25%，50%，75%，100%。采用细菌回复突变试验，通过平板渗入法检测鱼露和酱油对TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五种组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的致突变作用，评价鱼露及酱油引发菌株突变的可能性。结果鱼露和酱油实验组与溶剂对照组在样品剂量为75%和100%的培养基上的菌落总数差别具有统计学意义（P＜0.05）。结论结果表明，鱼露和酱油各试验组在100%的浓度梯度上可以得到阳性结果，因此可以说明鱼露与酱油在未经过硝化的情况下同样具有致突变性。关键词：鱼露酱油细菌回复突变AbstractObjectiveToinvestigatewhetherfishsauceandsoysaucearemutagenic.MethodSeparatethefishsauceandsoysauceinto4differentdosetreatmentgroups:25%,50%,75%,100%,TheBacterialreversemutationtestwasusedtodetectthemutagenicityoffishsauceandsoysauceonthefivehistidine-deficientSalmonellatyphimuriumTA97a,TA98,TA100,TA102,andTA1535.ResultsTheexperimentalgroupandthesolventcontrolgrouphadastatisticallysignificantdifferenceonthemediumwithsampledosesof75%and100%(P<0.05).ConclusionTheresultsshowthateachtestgroupobtainedapositiveresultonaconcentrationgradientof100%,Thetotalnumberofcoloniesintheexperimentalgroupwashigherthanthatinthecontrolgroupandwasstatisticallysignificant.soitcanbeshownthatfishsauceandsoysaucearealsomutagenicwithoutnitrification.KeyWords：FishsauceSoysauceBacterialreversemutation11-前言鱼露和酱油是我们日常生活中经常见到的调味品。鱼露为多种海鱼经过发酵而来，酱油则是以酱油是以脱脂大豆为主要原料,经曲霉长期发酵酿制而成，两者都经过许多学者证实具有致突变性。但是在多数实验中，鱼露与酱油都在亚硝化后表现出强致突变性[1-2]。作为日常食用调味品，在一些未有亚硝酸盐的环境时鱼露与酱油是否具有致突变性未见报道，为了进一步深入研究鱼露与酱油致突变性，我们对鱼露和酱油在没有亚硝化情况下，进行了致突变性实验，并对鱼露和酱油样品中的组氨酸是否干扰细菌回复突变试验结果进行了研究。2结果与分析2.1鱼露与酱油原液检测结果25%、50%、75%以及100%四个不同剂量的鱼露在未加入S9和已加入S9的条件下，对测试菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535诱发的回变菌落数和溶剂对照组菌落数表现出剂量-反应关系。在受试物在100%剂量上诱发的回变菌落数大于溶剂对照两倍以上，并且在75%和100%两个剂量上诱发的回变菌落数与溶剂对照组进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。对未加入S9和加入S9两个实验组进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。2-氨基芴、敌克松等阳性对照组菌落回变数均大于溶剂对照组回变菌落数两倍以上。结果表明：剂量为100%的鱼露在未加入S9和已加入S9的条件下，对于鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535五种测试菌株均有致突变性，检测结果见表1。表1鱼露加入S9与未加入S9对各种菌株的致突变性剂量（%）每皿回变菌落数（X±SD）TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S925126±10112±641±245±5140±14149±18270±19274±2115±116±250132±25136±1549±750±10182±18174±22296±22281±816±116±275183±7a177±23a67±5a63±19241±13a215±8a360±25a357±34a24±2a25±2a100247±23a242±9a83±13a87±14a301±12a310±10a472±23a478±30a33±3a36±5a自发回变117±14116±639±343±5142±13146±9273±15270±1515±214±3溶剂对照115±11119±1241±140±3145±7145±10269±10276±1815±317±4阳性对照1117±281125±361065±561094±421126±351183±691182±401202±61218±11224±18注：a表示P<0.0525%、50%、75%以及100%四个不同剂量的酱油在未加入S9和已加入S9的条件下，对测试菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535诱发的回变菌落数和溶剂对照组菌落数表现出剂量-反应关系。在受试物在100%剂量上诱发的回变菌落数大于溶剂对照两倍以上，并且在75%和100%两个剂量上诱发的回变菌落数与溶剂对照组进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。对未加入S9和加入S9两个实验组进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。2-氨基芴、敌克松等阳性对照组菌落回变数均大于溶剂对照组回变菌落数两倍以上。结果表明：剂量为100%的酱油在未加入S9和已加入S9的条件下，对于鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535五种测试菌株均有致突变性，检测结果见表2。表2酱油加入S9与未加入S9对各种菌株的致突变性剂量（%）每皿回变菌落数（X±SD）TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S925117±7128±1239±445±3143±10149±18143±10274±1115±216±250131±9138±2051±850±8191±28174±22191±28283±619±316±175178±12a185±14a65±6a60±17244±20a215±8a244±20a356±2924±4a21±5a续表剂量（%）每皿回变菌落数（X±SD）TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9100255±19a245±21a79±10a85±18a306±15a310±10a306±15a485±15a36±2a33±4a自发回变118±14122±1540±548±5144±16147±17144±16282±2715±216±3溶剂对照124±8120±1140±342±3146±17148±12146±17283±1115±216±3阳性对照1117±281125±361065±561094±421126±351183±691182±401202±61218±11224±18注：a表示P<0.052.2去组氨酸鱼露与酱油检测结果25%、50%、75%以及100%四个不同剂量的鱼露在经去除组氨酸处理后对测试菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535诱发的回变菌落数和溶剂对照组菌落数表现出剂量-反应关系。在受试物在100%剂量上诱发的回变菌落数大于溶剂对照两倍以上，并且在75%和100%两个剂量上诱发的回变菌落数与溶剂对照组进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2-氨基芴、敌克松等阳性对照组菌落回变数均大于溶剂对照组回变菌落数两倍以上。结果表明：剂量为100%的鱼露在去除组氨酸的条件下，对于鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535五种测试菌株均有致突变性，检测结果见表3。表3去组氨酸鱼露对各种菌株的致突变性剂量（%）每皿回变菌落数（X±SD）TA97aTA98TA100TA102TA153525117±1443±4148±16270±2516±250136±1548±10176±20284±2322±775177±23a64±11220±11a351±37a26±4a100242±9a89±16a311±12a485±36a40±4a自发回变117±1440±4142±13268±2114±2溶剂对照115±1142±3145±7264±1417±2阳性物1117±281065±561126±351182±40218±11注：a表示P<0.0525%、50%、75%以及100%四个不同剂量的酱油在经去除组氨酸处理后对测试菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535诱发的回变菌落数和溶剂对照组菌落数表现出剂量-反应关系。在受试物在100%剂量上诱发的回变菌落数大于溶剂对照两倍以上，并且在75%和100%两个剂量上诱发的回变菌落数与溶剂对照组进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2-氨基芴、敌克松等阳性对照组菌落回变数均大于溶剂对照组回变菌落数两倍以上。结果表明：剂量为100%的酱油在去除组氨酸的条件下，对于鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535五种测试菌株均有致突变性，检测结果见表4。表4去组氨酸酱油对各种菌株的致突变性剂量（%）每皿回变菌落数（X±SD）TA97aTA98TA100TA102TA153525127±1039±4141±12274±2516±250135±1845±6181±19297±2327±775182±17a64±11a234±25a364±27a24±2100246±30a82±13a307±10a465±31a33±3a自发回变117±1440±4142±13268±2114±2溶剂对照115±1142±3145±7264±1417±2阳性物1117±281065±561126±351182±40218±11注：a表示P<0.053讨论鱼露是我国沿海地区一种具有特殊风味的传统调味品，其为各种小鱼虾和一定量的海盐，经过腌制、发酵、提炼后得来的一种汁液。鱼露中含有各种氨基酸和蛋白质，味道带有咸香味，广受沿海居民喜爱。泰国作为最大的鱼露生产国，年生产量高达4.4×107L[3]，鱼露因为其风味独特而受到人们欢迎，许多鱼露生产地都在扩大鱼露的生产量。鱼露在发酵过程中经过各种化学反应后产生容易被人体吸收的各种氨基酸，也会产生致突变前体物的胺类物质。胺类物质在合适的条件下会形成具有强致癌性的N-亚硝基化合物，N-亚硝基化合物具有致癌活性，目前还没有发现有一种动物对N-亚硝基化合物的致癌性有抵抗力[4]。N-亚硝基化合物形成中所需的亚硝酸盐可能的来源于处理原料鱼所用的粗盐，亚硝酸盐能够在适宜的环境下与原料鱼体内的胺类物质经亚硝化后生成亚硝胺。张汝等[5]经生态学研究发现鱼露摄入与胃癌死亡率正相关。李铭新等[6]认为鱼露会诱发人体染色体畸变，对人体有致突变作用。蔡海英[7]多次使用肌氨酸乙酯亚硝胺作为诱导因子，研究认为鱼露具有促癌作用。在对未加入S9的鱼露实验组与溶剂对照组的对比中可以发现，在25%和50%剂量的培养皿上并未发现细菌回复突变试验阳性，而在75%和100%剂量的培养皿上都可以通过统计学分析得出与溶剂对照组具有显著差异，且100%剂量的培养皿中菌落总数超过了对应未处理对照组的两倍，呈细菌回复突变试验阳性。由此可以得知，在鱼露处于未处理的原液的情况下，在浓度在100%的情况下也具有一定的致突变性。在对加入S9的鱼露实验组与溶剂对照组的对比中可以发现，其情况表现与未加入S9的试验组基本一致，在25%和50%剂量的培养皿上并未表现出致突变性，在100%剂量的条件下诱发的菌落回变数呈阳性结果，存在着致突变性。从中可以得出结论，在食用高于一定剂量的鱼露时将有可能成为一种致癌的隐患。为了降低鱼露的致突变性，可以从鱼露的原材料着手，鱼露在发酵中是否会产生大量生物胺可能与原材料的品质和新鲜程度有关，原料鱼受到污染后会造成细菌的大量繁殖，从而产生生物胺，使得原料鱼在还未参与鱼露的发酵过程时就已经含有大量的生物胺[8]。福建省长乐县是我国胃癌高发地区之一，据调查其男性胃癌死亡率为134.44/10万，居全国之冠首[9]。鱼露因其风味和特色是当地居民日常食用的调味品，调查后发现其居民鱼露摄入量每日达10~15ml，经生态学研究发现鱼露摄入与胃癌死亡率之间存在正相关联系[10]。酱油是家家户户常用的调味品，人们对使用酱油的安全性并未有所怀疑，然而，近来的流行病学调查发现，酱油的摄入量与肝癌的发病率有密切联系，长期吃过量酱油，可能是癌症的重要诱因之一[11]。酱油是以脱脂大豆为主要原料,经曲霉长期发酵酿制而成，在酿造过程中，会产生仲胺等含氮化合物。酱油的致突变性可能与其可能含有的氯丙醇、亚硝胺等物质有关。国外的相关研究显示，各类食品都可能存在氯丙醇污染，但主要是酸水解植物蛋白(HVP)及含HVP的配制酱油氯丙醇污染最为严重[12]。而酱油中含有的仲胺能够与亚硝酸盐结合形成亚硝胺，亚硝胺是一种致癌物质。受试酱油在25%、50%、75%以及100%四个不同剂量上于未加入S9和加入S9两种条件下对测试菌株进行诱发回复突变。在100%剂量上诱发的回变菌落数大于溶剂对照两倍以上呈阳性结果，并且在75%和100%两个剂量上诱发的回变菌落数与溶剂对照组进行比较，差异具有统计学意义，实验组菌落数和溶剂对照组菌落数表现出剂量-反应关系。能够产生致突变性的物质对于人体是一种危害。酱油在发酵中可产生直接致变物甲基乙二醛[13]和至少三种的前致突变物。发酵法生产的酱油在亚硝化后,经试验后发现具有不同的致突变性，原因可能是酱油在发酵过程中不同微生物和不同的制作工艺导致的[14]。我们做出来未亚硝化鱼露与酱油有致突变性与先前研究结果不同[4]，考虑到是否鱼露酱油中组氨酸含量影响实验结果，导致出现“假阳性”[15]。我们利用非极性树脂XAD-2处理样品去除组氨酸，从结果中发现与未去除组氨酸试验结果相似，因此我们更多考虑致突变原因为为鱼露与酱油中含有的物质导致试验阳性。从以上试验结果我们初步判断，鱼露和酱油具有细菌回复突变性，其含有诱变物质会对人体产生危害，鱼露和酱油都是日常可见的调味品，因其致突变性可能引起的恶性后果不可小视。

结论在本次实验中，鱼露与酱油在未经过硝化的情况下,剂量组75%和100%具有致突变性。在近些年来的流行病学调查中，饮食因素已经是消化道癌症的首要因素之一。而鱼露和酱油作为日常调味品活跃在餐桌上，对于长期食用过量鱼露和酱油的人来说，虽然没有足够的证据显示该致突变性将会导致癌症的产生，但在长时间日积月累下来可能将会是致癌的重要因素之一。

致谢在论文完成之际，我要特别感谢我的指导老师钟礼云老师对我的淳淳教诲和无微不至的关怀。在论文的撰写过程中，钟礼云老师从论文的选题、任务书撰写、开题报告的提交、论文的构思分析、实验数据的收集、差异性分析方法的指导到最后的成文定稿，老师都给予了我莫大的帮助。老师具有十分渊博的学识、严谨的学术素养、负责任的教学精神以及一丝不苟的工作作风，都让我十分的敬佩。在论文的写作过程中，我还得到科室其他几位老师的鼎力支持，让我在一些困难面前能够继续前行。同样需要感谢为我提出宝贵建议的同学们，再此我一并致以真诚的感谢。感谢所有关心、支持、帮助我的老师同学们。最后，向在百忙之中抽出时间来对本论文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心的感谢。

参考文献[1]孙国勇,曾庆孝,江津津.鱼露中N-亚硝基化合物及其前体物的研究现状[J].中国酿造,2007(12):5-8.[2]蔡东联,印木泉,贺清玉,王静,陈耀富,毕洁,陆敦.40种酱油的致突性和不同浓度的亚硝酸盐对致突性的影响[J].第二军医大学学报,1990(05):424-427+491-492.[3]MAHJH,HANHK,OHYJ,etal.Biogenicaminesinjeotkals,Korean