杜氏藻的生态功能

杜氏藻的生态功能

杜先生是世界上高盐环境的主要制造商。已经发现了100多年，类型。杜氏藻为单细胞的

真核生物,双鞭毛，单核，没有细胞壁。新陈代谢旺盛，细胞纺锤形、椭圆形、卵圆形、侧卵

球形、球形。前端常为圆形或稍尖，后部为圆形。有时有尾，杯状叶绿体，淀粉粒和核一般

在前端,沿着有收缩性的两个液泡排列，色素在叶绿体周围。有时通过细胞分裂进行无性繁

殖,产生一个四集藻型阶段:有时细胞形成抱子,抱子萌发，形成4个〜8个游走抱子c由于

是最耐盐的真核生物,能在饱和的盐溶液中生长，因此,引起了生物科学家的广泛重视和深

入研究，新的种类不断发现。目前，有文献记载的有20余个种或类型。对杜氏藻研究的范

围和程度不断深入,研究手段不断改进:从形态观察、生理生化分析到分子生物学技术以及

现在的蛋白质组研究,为认识生物的耐盐机制提供了一个理想的方便的模式生物。杜氏藻

的研究价值主要体现在以下几个方面：（D由于杜氏藻是最耐盐的真核生物,是进行植物耐

盐生理研究理想的模式生物；（2）杜氏藻富含胡萝卜素及高蛋白，可以直接作为食品，或作为

精细化工生产胡萝卜素的原料；（3）是抗性基因的供体；（4）可以作为表达外源蛋白的新型生

物反应器；（5）杜氏藻是高盐环境的主要初级生产者,具有重要的生态意义。

随着分子生物学技术发展，科学家开始对其进行基因组学、蛋白质组学和系统生物学研究，

其中分类研究、培养技术、抗盐生理、基因工程研究仍是当前研究的热点。本文回顾了杜

氏藻研窕的历史,对研究进程中里程碑式的研究成果进行评述,并对今后的研究方向做一展

望。

1下鞭毛杜氏藻种

1838年,MichelFelixDunal在法国盐田中首次发现了该种藻类，他将观察到的生物称为

Haematococcussalinus和Protococcus。在19世纪，还有许多科学家在盐湖及高盐环境

中，发现了红色的双鞭毛的杜氏藻，并给出了不同的名称。如Geleznow和Butsc了nsky在

克里米亚盐湖、Blanchard在阿尔及利亚盐湖、Florentin在法国的盐湖、BujorP在罗马

尼亚盐湖中都发现了杜氏藻,分别给出了不同的名称Protococcussalinus,MonasDunali

I,DiselmisDunalii,ChlamydomonasDunalii,Sphaerellalacutrisvar.Dunalii利

Dunaliellasalina。其中，1905年Teodoresco命名的Dunalliellasalina被广泛接受。

2杜氏藻属分类

Teodoresco描述了两个种,Dunaliellasalina和DunaliellaviridisoLerche对罗马尼

亚和加利弗尼亚盐湖收集到的材料进行研究,认为以前的Dunaliellaviridis是混合种，

于是她将其细分为几个新种Dunaliellamedia,Dunaliellaeuchlora,Dunaliella

minuta,andDunaliellaparva«但这些种并不是与Dunaliellasalina和Dunaliella

viridis一样存在于高盐环境中，有些是典型的海洋种类,在高盐环境中从来没有发现过。

Massyuk在她的专著中将该属分为了两个亚属，Dunaliella有23个种,Pascheria5个种，这

5个种为淡水种。PreisigHR的研究发现,Massyuk的一理种可能是同一种的不同形态。

2000年以来,有些研究者尝试用分子生物学方法对杜氏藻进行分类研究。分子生物学研究

表明，过去一些品系可能命名有误,而且过去分类的一些种可能是不必要的。所采用的分子

生物学方法包括基于序列比较和RFLP分析的18SrRNA基因研究，以及18SrRNA基因内部

转录间隔区的研究。GonzalezMA的研究表明，对杜氏藻属内种的区分，分子数据和形态、

生理数据之间很少联系。OlmosJ(2000)的研究结果表明,Dunaliellasalina.

Dunaliellaparva^Dunaliellabardawil的18SrRNA基因内分别含有1个、2个和3个

内含子。最近，有些研究者利用RAPD(随机扩增多态性)技术分析杜氏藻种间关系，从生物的

遗传本质DNA入手,为杜氏藻的鉴定与分类归属问题提供分子生物学借鉴。用30个10寡

核甘酸随机引物进行多态性扩增和筛选，其中23个引物(76.67%)可获得清晰的多态性条带。

选择其中清晰、重复性良好的18个引物共扩增产生15()条可区分的DNA条带。利用种间

Nei遗传相似系数计算分析，构建杜氏藻属部分中的聚类分析图。有关杜氏藻分子生物学系

统分类有待做更深入的研究。

3培养聚合物系最适生长时的培养基和合子的应用

杜氏藻进行着复杂的生命周期，除了进行无性细胞分裂外，还可进行有性繁殖。在19世纪

30年代,首次进行了盐度对不同杜氏藻分离物生长影响的实验。Baas-BeckingLG

M(1928)«观察到Dunaliellaviridis在1M〜4M(6%〜23%)NaCl,pH6〜9范围内生长良好。

他还发现,高浓度的钙、镁抑制杜氏藻的生长。Lerche3(1937)。利用不同的种类和品系

做了详细的报道,大多数的品系在2%〜8%盐度生长最好，在15%以上盐度生长缓慢,在最适

生长条件下，每天的分裂率是0.47〜1.22。不同品系对营养的需求,GiborA(1956)、

Johnsonetal(1968)、VanAuken(1973)等做了深入的研究,配置了能使藻最适生长的培

养基。最适的培养盐浓度随不同的品系而有所不同：Dunaliellaviridis6%,Dunaliella

salinal2%o大盐湖分离的品系最适盐浓度10%〜15%,有的甚至达到一般的趋势是，

这些研究中，实验室培养的最适盐浓度总是比分离这些品系的环境的实际盐浓度低。这个

结果可能很好地反映了这样一个事实:生物在某种环境中存在，并不意味着这种环境最适合

它的生长发育，但是,这种生物要比它的竞争者生长的更好。

两个大小相等的配子融合为一个合子，最早有许多文献报道。LercheW(1937),利用5个

种(Dunaliellasalina,Dunaliellaparva,Dunaliellapeircei,Dunaliellaeuchlora和

Dunaliellaminuta)研究了合子的形成过程。她报道，当盐度从10%降到3%时，首先是

Dunaliellasalina的鞭毛接触，然后两个细胞形成一个胞质桥和一个并合体。合子有一个

厚的外层,能在淡水中和干燥的环境中存活一段时间。合子萌发,释放达32个单倍体的子

细胞。她利用富含胡萝卜素的红色细胞和绿色细胞杂交，能观察到合子的形成过程(图1)。

4甘油在杜氏藻细胞的生长和渗透调节中的作用

杜氏藻细胞没有细胞壁，由一层富有弹性的质膜包裹，结果是细胞形态受渗透变化强烈影响。

MarrrieandSeretta(1959)o利用冰点来测量细胞质液体来判断盐藻胞内“盐”浓度，结

果表明，生长的细胞的盐浓度超过3.9M,当时推断,细胞膜在盐度升高时吸收了NaCl,随后

自由水流出来平衡胞内外的渗透势。但实际情况是，杜氏藻细胞内的盐浓度不能那么

高,Johnsonetal(1968)的酶学研究证实了这一结果。藻代谢的关键酶，比如果糖磷酸异

构酶、核糖磷酸碳酸酊酶、果糖-6-磷酸脱氢酶和磷酸异构酶受NaCl的强烈抑制。我们现

在已知道,杜氏藻胞内的浓度非常低,利用锂离子作为胞外水空间的标记来评估胞内的体积

及胞内Na离子浓度,在0.5M和4MNaCl生长的细胞一般不超过100mM(KatzA,1985).如

此低浓度的Na离子浓度是通过Na+/H+逆向转运蛋白活性(KatzA,1989)。以及电子转移与

Na+外排偶联(KalzA,2001)实现的。但较低的细胞内离子浓度和细胞内渗透平衡的需求之

间存在着明显的矛盾,这一矛盾是如何解决的呢?研究发现,细胞累积光合作用产物甘油可

作为渗透调节的“可溶性”溶质。非常有趣的是，甘油对杜氏藻作用效果的实验是由百年

前Teodoresco(1906)完成的，他验证了甘油和其他非离子化合物引起胞质收缩的效果。他

观察到，当杜氏盐藻细胞悬在50%甘油中时，暂时失去了游动性，当甘油浓度在潮湿的环境下

逐渐降低，乂逐渐恢复了游动,75%甘油浓度的效果极为相似。但在100%甘油浓度下，大部分

的细胞死亡，仅有很少的细胞存活。

第一个证明甘油在杜氏藻累积并作为渗透调节剂的是Craigie和Mrl"hlan(1964)发表的

简报，他们利用14co2和［:unaliellatertoilecta共培养,然后用酒精提取细胞,分离含有

溶质碳水化合物的中间相,利用离子交换程序的相关化合物及双向纸层析、放射自显影技

术分析其特征。当培养基盐浓度从0.025M增加100倍到2.5M时,在中间相中发现放射活

性增加了94倍。在0.025M、0.5M、2.5M浓度下共培养的细胞，甘油数量是中间相放射活

性的56%、76%和81%,其它可能是可溶性的多糖。在随后的研究中,Wegmann(197D证实,随

着盐浓度的增加，放射性标记的14co2转化为甘油增力山可达到2.8M。他推断,甘油的形成

是杜氏藻在高盐生境存活的保护机制。甘油在杜氏藻盐适应中的作用，由Ben-Amots和

Avron(1973)及Borow!tzka和Brown(1974)的研究做了进一步证实。由DuncanBrown创造

的“兼性溶质”这个名词表明，I」油这一溶质不仅能维持细胞渗透势，也维持的的活性，在

高盐度下，防活性很大程度上得益于甘油的功能。杜氏藻胞内甘油的浓度能达到很高，在4M

NaCl下生长的细胞,据报道含有7.8M的甘油，相当于71Bg/L的甘油水溶液(Brown

AD,1990)o维持如此高浓麦的甘油需要特殊的细胞膜特性。因为大部分细胞膜对甘油有透

性,而杜氏藻的膜对甘油有不寻常的低透性,能使甘油保持在细胞内。但目前杜氏藻对甘油

的低透性的机理还没有完全搞清楚。尽管利用杜氏藻生产甘油的技术从理论上将是可能的,

但由于经济效益低，目前还没有利用杜氏藻生产甘油的生物技术。

5-胡萝卜素的生物技术

杜氏盐藻中含有鲜红色的色素，早期认为是“血色素”，后来鉴定为胡萝卜素。这些鉴定工

作是由BlanchardR(1897)、TeodovescoEC(是06)、LercheW(是37)、RuinenJ(1938)

等完成的。根据色素在酒精和乙醛中的可溶性，以及在浓硫酸中形成兰色的特性，确定为胡

萝卜素。早期的Teodovesco和LabbeA(1921)认为,类胡萝卜素分布于整个细胞质中，但利

用电子显微镜显示，B-胡萝卜素位于细胞单一叶绿体类囊体之间的颗粒体中。胡萝卜

素是由D.salina和D.bardawi1积累的主要类胡萝卜素类型，是一种价值很高的化工产

品，作为天然食品色素具有大量的需求;作为维生素A的前提,是化妆品添加剂,而且是有益

健康的食物(BorowilzkaMA,1986)«一些杜氏藻的品系能大量累积B-胡萝卜素，如在澳

大利亚pinklake中的Dunaliella.salina,干物质中的13.8%的有机物为B-胡萝卜素;

某种品系的培养物中，胡萝卜素占干重的10%甚至更有，包括比例较大的9-顺式异构体

(Ben-AmotzA,1988)o因此，很早就有了利用杜氏藻来生产B-胡萝卜素的生物技术的研

究。第一个生产B-胡萝卜素的杜氏藻培养的工厂是1956年在前苏联建立的(MassyukN

P,1968;DrokovaIH,1961),目前，在全世界范围内，建立了大量的盐藻培养的生产工厂或

基地。生产杜氏藻的厂家及公司主要有十几家,产品主要有干藻粉及植物油浓缩物(表1)。

采用的技术有所不同，从泻湖的粗放培养,到可控制条件的高细胞密度的集约化培养。其中

一种诱导大量类胡萝卜素积累的生物技术是降低营养水平,减少生长率。细胞中的大量的

类胡萝卜素的产生可能是由于营养的限制和高强度的光照。LercheW(1937)报道，当出现

红色时,特别是在老的培养物中，相应地在培养条件中减少一种或多种化合物，当P或N营

养处于有限的数量，我们就能首先获得类胡萝卜素。

6杜氏藻类互补研究

6.1盐藻的遗传转化

开展盐藻分子生物学研究对深入了解盐藻的抗性机制和更好地开发利用具有重要的意义，

但目前研究基础还相当薄弱。迄今已从盐藻中克隆出2。多个基因,这些基因的功能见表2。

国内外已有多个实验室进行了盐藻遗传转化方面的尝试，取得了一定的进展。耿德贵等利

用电激法将GUS基因转入杜氏盐藻细胞内进行瞬时表达,研究了盐藻的生长状态和电激条

件对转化率的影响，并比较了5种启动子的转化效率。采用盐藻作为外源基因表达系统有

许多的优点：比如,盐藻没有细胞壁，比高等植物细胞有利于转化和破碎;盐藻具有游动能力,

培养时可以不需要摇床摇动；由于营养简单,能够进