基于喹啉结构的新型HDAC6抑制剂的设计、合成与肿瘤抑制效能研究

基于喹啉结构的新型HDAC6抑制剂的设计、合成与肿瘤抑制效能研究一、引言1.1研究背景肿瘤，作为严重威胁人类健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，死亡病例996万例。肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及细胞信号通路的异常调控等。尽管目前临床上针对肿瘤的治疗手段如手术、化疗、放疗和靶向治疗等在一定程度上提高了患者的生存率和生活质量，但肿瘤的复发、转移以及耐药性问题仍然是亟待解决的难题。传统化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤，导致严重的毒副作用，影响患者的治疗依从性和生活质量。因此，开发新型、高效、低毒的抗肿瘤药物具有重要的临床意义和社会价值。组蛋白去乙酰化酶（HistoneDeacetylases，HDACs）是一类能够催化组蛋白和非组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基去除的酶家族，在基因表达调控、细胞周期进程、细胞分化和凋亡等生物学过程中发挥着关键作用。HDACs家族根据其结构和功能的不同，可分为四类：I类（HDAC1、2、3、8）、II类（IIa类：HDAC4、5、7、9；IIb类：HDAC6、10）、III类（Sirtuins）和IV类（HDAC11）。其中，HDAC6是一种独特的IIb类HDAC，主要定位于细胞质中，具有两个串联的催化结构域和一个C末端的泛素结合结构域。与其他HDACs成员不同，HDAC6除了能够去乙酰化组蛋白外，还能够特异性地去乙酰化非组蛋白底物，如α-微管蛋白、热休克蛋白90（Hsp90）和皮质肌动蛋白等，参与调节细胞骨架动态、蛋白质折叠与降解、细胞迁移、侵袭和自噬等多种细胞生理过程。在肿瘤细胞中，HDAC6的表达和活性往往异常升高，与肿瘤的发生、发展、转移和耐药密切相关。研究表明，HDAC6的过表达能够促进肿瘤细胞的增殖、抑制细胞凋亡、增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，并参与肿瘤细胞对化疗药物和靶向药物的耐药机制。因此，HDAC6成为了肿瘤治疗的一个极具潜力的靶点，开发选择性HDAC6抑制剂作为新型抗肿瘤药物具有广阔的应用前景。目前，已经有多种HDAC6抑制剂进入临床试验阶段，但大多数仍面临着一些问题，如选择性不高、药代动力学性质不理想、毒副作用较大等。因此，设计和合成具有高选择性、高效低毒的新型HDAC6抑制剂仍然是药物研发领域的研究热点。喹啉类化合物是一类重要的含氮杂环化合物，具有广泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗疟疾和抗肿瘤等。其独特的刚性平面结构和电子云分布使其能够与多种生物靶点相互作用，在药物研发中展现出巨大的潜力。许多喹啉类化合物已经被开发成为上市药物，如抗疟疾药物氯喹和青蒿素类衍生物，以及抗肿瘤药物喜树碱等。将喹啉结构引入HDAC6抑制剂的设计中，有望通过喹啉环与HDAC6活性位点的特异性结合，提高抑制剂的选择性和活性，同时改善其药代动力学性质。1.2研究目的与意义本研究旨在设计、合成新型喹啉类HDAC6抑制剂，并对其抗肿瘤活性进行系统评价，以期为肿瘤治疗提供新的药物分子和理论依据。具体研究目的如下：基于结构的药物设计：通过对HDAC6的三维结构和作用机制的深入研究，结合计算机辅助药物设计技术，以喹啉结构为核心，设计一系列新型HDAC6抑制剂，优化其与HDAC6活性位点的结合模式，提高抑制剂的选择性和活性。化学合成与表征：运用有机合成化学方法，合成所设计的新型喹啉类HDAC6抑制剂，并通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等现代分析技术对其结构进行准确表征，确保化合物的纯度和结构正确性。酶活性抑制测定：采用体外酶活性抑制实验，测定新型喹啉类HDAC6抑制剂对HDAC6酶活性的抑制作用，并与已有的HDAC6抑制剂进行对比，评估其抑制活性的强弱和选择性。细胞水平抗肿瘤活性评价：选择多种肿瘤细胞系，如乳腺癌细胞系MCF-7、肺癌细胞系A549、结肠癌细胞系HCT116等，通过细胞增殖实验（如MTT法、CCK-8法）、细胞凋亡实验（如AnnexinV-FITC/PI双染法）、细胞周期分析、细胞迁移和侵袭实验等，全面评价新型喹啉类HDAC6抑制剂的抗肿瘤活性，探讨其作用机制，包括对细胞凋亡相关蛋白、细胞周期调控蛋白以及肿瘤细胞迁移和侵袭相关蛋白表达的影响。动物体内抗肿瘤活性研究：建立肿瘤动物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，考察新型喹啉类HDAC6抑制剂在动物体内的抗肿瘤效果，观察其对肿瘤生长的抑制作用、对动物体重和一般状态的影响，并通过组织病理学分析、免疫组化等方法，进一步验证其作用机制和安全性。本研究具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。从理论层面来看，深入研究新型喹啉类HDAC6抑制剂的设计、合成及抗肿瘤活性，有助于进一步揭示HDAC6在肿瘤发生发展中的作用机制，丰富肿瘤表观遗传学的研究内容，为开发新型抗肿瘤药物提供新的思路和方法。通过对喹啉类化合物与HDAC6相互作用的研究，可以深入了解药物分子与靶点之间的作用模式，为基于结构的药物设计提供更坚实的理论基础，推动药物化学学科的发展。在临床应用方面，本研究有望发现具有高效、低毒、高选择性的新型喹啉类HDAC6抑制剂，为肿瘤治疗提供新的候选药物。这类抑制剂可以特异性地作用于HDAC6靶点，避免对其他HDACs成员的非特异性抑制，从而减少药物的毒副作用，提高患者的治疗依从性和生活质量。同时，新型HDAC6抑制剂可能与现有的肿瘤治疗手段（如化疗、放疗、靶向治疗）联合使用，发挥协同增效作用，克服肿瘤的耐药性，为肿瘤患者提供更有效的治疗方案，具有广阔的临床应用前景，对改善肿瘤患者的预后和生存状况具有重要意义。1.3研究方法与技术路线1.3.1研究方法计算机辅助药物设计（CADD）：利用计算机软件和数据库，如DiscoveryStudio、MOE等，对HDAC6的三维晶体结构（可从蛋白质数据库PDB中获取）进行分析，识别其活性位点和关键氨基酸残基。基于已有的HDAC6抑制剂结构和作用机制，运用分子对接技术，将设计的喹啉类化合物与HDAC6活性位点进行虚拟对接，预测化合物与靶点的结合模式和亲和力，筛选出具有潜在活性的化合物分子，为后续的化学合成提供理论指导。化学合成：根据计算机辅助设计得到的化合物结构，运用有机合成化学的原理和方法，设计合理的合成路线。以常见的喹啉类化合物为起始原料，通过一系列的化学反应，如取代反应、缩合反应、环化反应等，引入与HDAC6活性位点相互作用的关键基团，构建目标喹啉类HDAC6抑制剂。在合成过程中，严格控制反应条件，如温度、反应时间、反应物比例等，以确保反应的顺利进行和产物的纯度。采用柱层析、重结晶等方法对合成的化合物进行分离和纯化，利用核磁共振（NMR）、质谱（MS）、红外光谱（IR）等现代分析技术对化合物的结构进行表征，确定其化学结构和纯度是否符合要求。酶活性抑制测定：采用荧光共振能量转移（FRET）法或比色法等，测定新型喹啉类HDAC6抑制剂对HDAC6酶活性的抑制作用。以商用的HDAC6酶为催化剂，以特异性的荧光底物或显色底物为反应底物，在适宜的反应缓冲液中，加入不同浓度的抑制剂和酶，孵育一定时间后，通过检测荧光强度或吸光度的变化，计算抑制剂对HDAC6酶活性的抑制率。根据抑制率数据，绘制剂量-效应曲线，计算抑制剂的半抑制浓度（IC50），评估其抑制活性的强弱。同时，选择其他HDACs亚型（如HDAC1、HDAC2等）进行酶活性抑制实验，与HDAC6的抑制活性进行对比，考察新型喹啉类抑制剂对HDAC6的选择性。细胞水平抗肿瘤活性评价：细胞增殖实验：采用MTT法或CCK-8法，检测新型喹啉类HDAC6抑制剂对多种肿瘤细胞系（如乳腺癌细胞系MCF-7、肺癌细胞系A549、结肠癌细胞系HCT116等）增殖的影响。将对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入不同浓度的抑制剂，继续培养一定时间（如48小时或72小时）。然后加入MTT试剂或CCK-8试剂，孵育一定时间后，用酶标仪检测各孔的吸光度，计算细胞存活率，绘制剂量-效应曲线，确定抑制剂对不同肿瘤细胞系的半数抑制浓度（IC50），评估其抗肿瘤活性。细胞凋亡实验：采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术，检测抑制剂对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。将肿瘤细胞与不同浓度的抑制剂孵育一定时间后，收集细胞，用AnnexinV-FITC和PI进行双染，然后通过流式细胞仪检测早期凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡细胞（AnnexinV+/PI+）的比例，分析抑制剂对肿瘤细胞凋亡的影响。同时，通过Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白（如Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3等）的表达水平，探讨其诱导细胞凋亡的分子机制。细胞周期分析：将肿瘤细胞与抑制剂孵育一定时间后，收集细胞，用乙醇固定，然后加入碘化丙啶（PI）染色液，通过流式细胞仪检测细胞周期各时相（G0/G1期、S期、G2/M期）的细胞比例，分析抑制剂对肿瘤细胞周期的阻滞作用，研究其对肿瘤细胞增殖的影响机制。细胞迁移和侵袭实验：采用Transwell小室实验，评估抑制剂对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。在Transwell小室的上室加入用无血清培养基重悬的肿瘤细胞和不同浓度的抑制剂，下室加入含血清的培养基作为趋化因子。孵育一定时间后，擦去上室未迁移的细胞，对迁移到下室的细胞进行固定、染色和计数，分析抑制剂对肿瘤细胞迁移能力的影响。若研究侵袭能力，则在上室预先包被基质胶，其他步骤与迁移实验类似，通过比较侵袭到下室的细胞数量，评估抑制剂对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用。同时，通过Westernblot法检测细胞迁移和侵袭相关蛋白（如MMP-2、MMP-9、E-cadherin等）的表达水平，探讨其作用机制。动物体内抗肿瘤活性研究：建立裸鼠皮下移植瘤模型，评价新型喹啉类HDAC6抑制剂在动物体内的抗肿瘤效果。将对数生长期的肿瘤细胞（如MCF-7细胞）接种于裸鼠背部皮下，待肿瘤体积长至约100-150mm³时，将裸鼠随机分为实验组和对照组，每组若干只。实验组给予不同剂量的新型喹啉类HDAC6抑制剂（通过腹腔注射或灌胃给药），对照组给予等量的溶剂（如生理盐水或相应的赋形剂），每天给药一次，连续给药一定时间（如2-3周）。定期用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，根据公式V=0.5×长径×短径²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，观察抑制剂对肿瘤生长的抑制作用。同时，每周称量裸鼠的体重，观察其一般状态（如精神状态、饮食、活动等），评估抑制剂对动物的毒性和耐受性。在实验结束后，处死裸鼠，取出肿瘤组织，称重，计算抑瘤率。通过组织病理学分析（如HE染色），观察肿瘤组织的形态学变化；采用免疫组化法检测肿瘤组织中相关蛋白（如Ki-67、Cleaved-caspase3等）的表达水平，进一步验证抑制剂的作用机制和安全性。1.3.2技术路线本研究的技术路线如图1-1所示：靶点及先导化合物选择：通过文献调研和生物信息学分析，明确HDAC6作为肿瘤治疗靶点的重要性及作用机制。收集已报道的具有较高活性和选择性的HDAC6抑制剂作为先导化合物，分析其结构特征和构效关系。计算机辅助药物设计：获取HDAC6的三维晶体结构，运用分子对接、分子动力学模拟等计算机辅助药物设计技术，对先导化合物进行结构优化，设计新型喹啉类HDAC6抑制剂的分子结构。根据设计结果，筛选出具有潜在高活性和选择性的化合物分子，确定合成路线和目标化合物。化学合成与表征：按照设计的合成路线，以喹啉类化合物为起始原料，通过多步有机合成反应制备目标化合物。对合成得到的化合物进行分离纯化，利用NMR、MS、IR等分析技术对其结构进行全面表征，确保化合物的结构正确性和纯度。体外活性评价：进行HDAC6酶活性抑制实验，测定新型喹啉类抑制剂的IC50值，评估其对HDAC6酶活性的抑制能力和选择性。在细胞水平，采用多种肿瘤细胞系进行细胞增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭等实验，评价抑制剂的抗肿瘤活性及作用机制，筛选出活性较好的化合物进入下一步研究。体内活性评价：建立肿瘤动物模型，对筛选出的化合物进行动物体内抗肿瘤活性研究。观察化合物对肿瘤生长的抑制作用、对动物体重和一般状态的影响，通过组织病理学分析和免疫组化等方法验证其作用机制和安全性。结果分析与讨论：对体外和体内实验结果进行综合分析，总结新型喹啉类HDAC6抑制剂的构效关系、抗肿瘤活性及作用机制。与已有的HDAC6抑制剂进行对比，评估本研究中化合物的优势和不足，为进一步的药物研发提供理论依据和研究方向。二、相关理论基础2.1喹啉类化合物概述2.1.1结构与性质喹啉类化合物是一类重要的含氮杂环有机化合物，其基本结构由一个苯环和一个吡啶环通过共用两个相邻的碳原子稠合而成，分子式为C_9H_7N，化学结构如图2-1所示。这种独特的稠环结构赋予了喹啉类化合物许多特殊的物理和化学性质。/v2-87655698989898989898989898989898_r.jpg图2-1喹啉的化学结构从物理性质来看，喹啉通常为无色至淡黄色的油状液体，具有特殊的气味，能与醇、醚及二硫化碳等有机溶剂混溶，易溶于热水，难溶于冷水。其熔点为-15.6^{\circ}C，沸点为238.05^{\circ}C，相对密度为1.0929(20/4^{\circ}C)，折光率为1.62683，闪点为101^{\circ}C。由于其分子结构中存在氮原子，使得喹啉具有一定的碱性，能与酸反应生成盐。例如，喹啉与苦味酸反应可生成熔点为203-204^{\circ}C的苦味酸盐。在化学性质方面，喹啉的反应活性主要体现在苯环和吡啶环上。由于吡啶环上的氮原子具有吸电子作用，使得吡啶环的电子云密度相对较低，亲电取代反应主要发生在电子云密度较高的苯环上，且反应活性比苯稍低。在浓硫酸中进行硝化反应时，主要在苯环的3位和5位发生取代；在乙酸中硝化时，可得到3-硝基喹啉。卤化反应通常也在3位发生取代，但在浓硫酸中进行卤化时，可在5位和8位发生取代。当喹啉与卤代烷反应时，氮原子上的孤对电子可进攻卤代烷中的碳原子，形成季铵盐。在还原反应中，根据反应条件的不同，喹啉可以被还原为1,2-二氢喹啉或1,2,3,4-四氢喹啉。例如，在催化加氢条件下，可得到1,2,3,4-四氢喹啉；而在使用金属钠和乙醇等还原剂时，可生成1,2-二氢喹啉。氧化反应时，喹啉可被氧化为吡啶-2,3-二羧酸，进一步脱去CO_2后可变成烟酸。2.1.2在药物研发中的应用现状喹啉类化合物由于其独特的结构和多样化的生物活性，在药物研发领域展现出了巨大的潜力，被广泛应用于各类药物的开发中，取得了众多重要成果。在抗疟疾药物方面，喹啉类化合物发挥了关键作用。氯喹（Chloroquine）是最早被广泛应用的抗疟药物之一，其化学结构中含有喹啉环。氯喹能够插入疟原虫的DNA碱基对之间，抑制DNA的复制和转录，从而阻止疟原虫的生长和繁殖。它对红细胞内期的疟原虫具有强大的杀灭作用，曾是治疗疟疾的一线药物。随着疟原虫对氯喹耐药性的出现，人们又研发了一系列以喹啉为基础的衍生物，如羟氯喹（Hydroxychloroquine）。羟氯喹在氯喹的结构基础上引入了羟基，不仅保留了抗疟活性，还具有免疫调节等多种药理作用，在治疗疟疾的同时，还被用于治疗自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等。另一种重要的抗疟药物奎宁（Quinine），同样是喹啉类化合物。奎宁通过抑制疟原虫的血红素聚合酶，使疟原虫无法将有毒的血红素转化为无害的疟色素，从而导致疟原虫死亡。奎宁的发现和应用，为疟疾的治疗提供了重要的手段，拯救了无数生命。在抗肿瘤药物领域，喹啉类化合物也备受关注。伯舒替尼（Bosutinib）是一种口服强效的蛋白激酶Src/Abl双重抑制剂，用于治疗慢性粒细胞白血病。其分子结构中的喹啉基团在与靶点蛋白相互作用中发挥了关键作用，通过抑制Src和Abl激酶的活性，阻断细胞内的信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖和存活。对于伊马替尼或第二代酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）耐药/不耐受的慢性粒细胞白血病患者，伯舒替尼提供了新的治疗选择。一些喹啉衍生物还可以通过抑制DNA拓扑异构酶来发挥抗肿瘤作用。DNA拓扑异构酶在DNA转录、复制、染色体分离及基因表达等过程中起着重要的调控作用，肿瘤细胞中该酶的高水平表达使其成为抗肿瘤药物的重要靶点。喹啉衍生物能够嵌入DNA，干扰DNA复制过程，从而诱导肿瘤细胞凋亡。除了抗疟疾和抗肿瘤药物外，喹啉类化合物在其他领域也有广泛应用。在抗菌药物方面，某些喹啉衍生物具有良好的抗菌活性，能够抑制细菌的生长和繁殖。它们作用于细菌的特定靶点，如细胞壁合成、蛋白质合成或核酸代谢等过程，从而达到杀菌或抑菌的效果。在抗炎药物的研发中，喹啉类化合物也显示出一定的潜力。通过调节炎症相关信号通路，抑制炎症因子的释放，发挥抗炎作用。在神经系统药物领域，部分喹啉类化合物被发现对神经系统疾病具有治疗作用，如用于治疗癫痫、帕金森病和阿尔茨海默病等。这些化合物能够调节神经递质的水平，改善神经细胞的功能，从而缓解疾病症状。2.2HDAC6及抑制剂2.2.1HDAC6的结构与功能HDAC6属于IIb类组蛋白去乙酰化酶，在细胞内发挥着多种关键作用，其结构和功能特点使其成为药物研发领域的重要靶点。HDAC6基因定位于人类染色体Xp11.23，编码的蛋白质由1215个氨基酸残基组成，分子量约为131kDa。其结构具有独特性，包含两个串联的催化结构域（catalyticdomain，CD），分别为CD1和CD2，这两个催化结构域在序列上具有较高的同源性，且各自具有独立的催化活性，能够独立地催化底物的去乙酰化反应。在HDAC6的C末端还存在一个泛素结合结构域（ubiquitin-bindingdomain，UBD），该结构域能够特异性地识别并结合泛素分子，对于HDAC6参与蛋白质的泛素化降解途径以及细胞内蛋白质质量控制起着关键作用。在N末端则是一个富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的结构域（PESTdomain），该结构域与蛋白质的稳定性和降解密切相关，可能参与调节HDAC6在细胞内的半衰期和功能活性。HDAC6主要定位于细胞质中，与其他HDACs家族成员在细胞内的定位存在明显差异。这种独特的定位决定了其主要作用于细胞质内的底物，在细胞生理过程中发挥着不可或缺的功能。在细胞骨架动态调节方面，α-微管蛋白是HDAC6的重要底物之一。α-微管蛋白的乙酰化水平直接影响微管的稳定性和动力学特性。HDAC6能够特异性地去除α-微管蛋白上的乙酰基，使微管去乙酰化，从而调节微管的聚合和解聚过程。当HDAC6活性升高时，α-微管蛋白去乙酰化增强，微管稳定性降低，有利于细胞的形态改变和迁移；反之，当HDAC6活性受到抑制时，α-微管蛋白乙酰化水平升高，微管稳定性增加，细胞的迁移能力则会受到抑制。在细胞迁移过程中，HDAC6通过调节微管的动态变化，影响细胞伪足的形成和收缩，进而调控细胞的迁移速度和方向。在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中，HDAC6对微管的调节作用使得肿瘤细胞能够更易于突破基底膜，进入周围组织和血管，促进肿瘤的转移。在蛋白质折叠与降解过程中，HDAC6也扮演着重要角色。热休克蛋白90（Hsp90）是一种分子伴侣，对于许多蛋白质的正确折叠、成熟和功能维持至关重要。HDAC6可以通过与Hsp90相互作用，调节Hsp90的乙酰化状态，进而影响Hsp90与客户蛋白的结合和解离。当HDAC6使Hsp90去乙酰化时，Hsp90能够更有效地与客户蛋白结合，促进客户蛋白的正确折叠和稳定；而在某些应激条件下，HDAC6的活性改变可能导致Hsp90乙酰化水平的变化，影响Hsp90对客户蛋白的协助作用，从而影响细胞内蛋白质的稳态。HDAC6的UBD结构域能够识别并结合多泛素化的错误折叠蛋白，将其招募到自噬体中进行降解，参与细胞内的蛋白质质量控制系统，确保细胞内环境的稳定。HDAC6还参与细胞的自噬过程。自噬是细胞内一种重要的自我保护机制，通过形成自噬体包裹细胞内的受损细胞器、蛋白质聚集体等，然后与溶酶体融合，将其降解并回收利用。HDAC6可以通过调节微管的乙酰化状态，影响自噬体的形成、运输和与溶酶体的融合过程。在自噬起始阶段，HDAC6可能通过对微管相关蛋白的去乙酰化作用，促进自噬体的成核；在自噬体运输过程中，微管的动态变化受到HDAC6的调控，确保自噬体能够顺利地与溶酶体结合，完成自噬过程。在肿瘤细胞中，自噬过程的异常与肿瘤的发生、发展和耐药密切相关，HDAC6对自噬的调节作用可能为肿瘤治疗提供新的靶点和策略。HDAC6的功能异常与多种疾病的发生发展密切相关，尤其是在肿瘤领域。在多种肿瘤细胞中，HDAC6的表达水平显著升高，其活性也明显增强。在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等常见肿瘤中，HDAC6的高表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及对化疗药物的耐药性密切相关。HDAC6通过调节细胞骨架动态，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，使其更容易突破组织屏障，向周围组织和远处器官转移。HDAC6对蛋白质折叠与降解以及自噬过程的调控，有助于肿瘤细胞在恶劣环境下存活和增殖，增强肿瘤细胞对化疗药物和放疗的耐受性。HDAC6在神经系统疾病、心血管疾病和炎症性疾病等其他疾病中也发挥着重要作用。在阿尔茨海默病患者的大脑中，HDAC6的活性异常升高，导致微管相关蛋白的异常去乙酰化，影响神经元的正常功能和神经递质的传递，进而加速疾病的进展。在心血管疾病中，HDAC6参与调节血管平滑肌细胞的增殖和迁移，其异常表达与动脉粥样硬化等疾病的发生发展密切相关。2.2.2HDAC6抑制剂的作用机制HDAC6抑制剂通过特异性地作用于HDAC6，干扰其正常的去乙酰化功能，从而对细胞生理过程产生一系列影响，发挥其潜在的治疗作用。其作用机制主要涉及以下几个方面。从与HDAC6的结合方式来看，大多数HDAC6抑制剂属于竞争性抑制剂，它们能够与HDAC6的催化结构域中的活性位点紧密结合，从而阻止底物与HDAC6的正常结合，抑制其去乙酰化酶活性。HDAC6的催化结构域含有一个关键的锌离子（Zn²⁺），在去乙酰化反应中起着重要作用。许多HDAC6抑制剂分子中含有能够与锌离子螯合的基团，如羟肟酸（hydroxamicacid）、羧酸（carboxylicacid）、硫代羧酸（thio-carboxylicacid）等。以羟肟酸类抑制剂为例，其分子中的羟肟酸基团能够与HDAC6催化结构域中的锌离子形成稳定的配位键，占据活性位点，使得HDAC6无法与底物上的乙酰化赖氨酸残基接近，从而阻断去乙酰化反应的进行。这种与锌离子的螯合作用是HDAC6抑制剂发挥抑制活性的关键机制之一，通过精确地靶向HDAC6的活性中心，实现对其酶活性的有效抑制。HDAC6抑制剂对细胞骨架的调节是其重要作用机制之一。如前所述，HDAC6主要通过去乙酰化α-微管蛋白来调节微管的稳定性和动力学。当HDAC6抑制剂作用于细胞后，HDAC6的活性被抑制，α-微管蛋白的去乙酰化过程受阻，导致α-微管蛋白的乙酰化水平升高。高乙酰化的α-微管蛋白使得微管更加稳定，不易发生解聚。在肿瘤细胞中，这种微管稳定性的改变会对细胞的迁移和侵袭能力产生显著影响。由于微管在细胞迁移过程中起着重要的支撑和运输作用，稳定的微管结构会阻碍肿瘤细胞伪足的形成和伸展，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭行为。研究表明，在乳腺癌细胞中应用HDAC6抑制剂后，细胞内α-微管蛋白乙酰化水平明显上升，微管网络变得更加稳定，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力显著降低，这为肿瘤的治疗提供了新的策略。对蛋白质折叠与降解过程的影响也是HDAC6抑制剂的重要作用机制。HDAC6参与调节Hsp90的乙酰化状态，进而影响Hsp90对客户蛋白的协助折叠和稳定作用。HDAC6抑制剂抑制HDAC6的活性后，会导致Hsp90的乙酰化水平发生改变。Hsp90的过度乙酰化会影响其与客户蛋白的相互作用，使得一些依赖Hsp90的癌蛋白（如Akt、HER2等）无法正确折叠和维持稳定的构象，从而影响这些癌蛋白的功能。这些癌蛋白在肿瘤细胞的增殖、存活和耐药等过程中起着关键作用，它们的功能受损会导致肿瘤细胞的生长受到抑制，对化疗药物的敏感性增加。HDAC6抑制剂通过干扰蛋白质折叠与降解途径，破坏肿瘤细胞内的蛋白质稳态，从而发挥抗肿瘤作用。HDAC6抑制剂还能够影响细胞的自噬过程。自噬是细胞维持内环境稳定的重要机制，HDAC6在自噬体的形成、运输和与溶酶体的融合等环节中发挥着调节作用。HDAC6抑制剂抑制HDAC6的活性后，会改变自噬相关蛋白的乙酰化状态和微管的乙酰化水平，进而影响自噬过程。在肿瘤细胞中，自噬过程的异常与肿瘤的耐药性和生存密切相关。适度激活自噬可以促进肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，而过度激活自噬则可能导致肿瘤细胞的存活和耐药。HDAC6抑制剂通过调节自噬过程，使其处于有利于肿瘤治疗的状态。在一些研究中发现，应用HDAC6抑制剂后，肿瘤细胞的自噬水平得到适度调控，增强了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高了治疗效果。HDAC6抑制剂还可以通过调节其他信号通路来发挥作用。在炎症反应中，HDAC6参与调节一些炎症相关因子的表达和信号传导。HDAC6抑制剂能够抑制HDAC6对相关转录因子的去乙酰化作用，从而影响炎症因子的表达和释放，减轻炎症反应。在神经系统疾病中，HDAC6抑制剂可能通过调节神经元相关蛋白的乙酰化水平，改善神经元的功能和神经递质的传递，对疾病的治疗产生积极影响。2.2.3现有HDAC6抑制剂的研究进展近年来，HDAC6作为一个重要的药物靶点，吸引了众多科研人员的关注，大量的HDAC6抑制剂被设计、合成并进行了深入研究，目前在该领域已经取得了显著的进展。根据化学结构的不同，现有HDAC6抑制剂主要可分为以下几类。羟肟酸类是研究最为广泛的一类HDAC6抑制剂。这类抑制剂的典型代表是ACY-1215（ricolinostat），它对HDAC6具有较高的选择性和抑制活性。ACY-1215通过其分子中的羟肟酸基团与HDAC6催化结构域中的锌离子紧密结合，从而有效地抑制HDAC6的活性。在多项临床试验中，ACY-1215被用于治疗多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤，展现出了一定的疗效。研究表明，ACY-1215能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖，并增强肿瘤细胞对其他化疗药物的敏感性。但该抑制剂也存在一些不足之处，如选择性仍有待进一步提高，可能会对其他HDACs亚型产生一定的抑制作用，从而导致一些不良反应。在长期使用过程中，还可能出现耐药性问题，影响其治疗效果。环肽类HDAC6抑制剂也受到了广泛关注。如tubastatinA，它是一种从天然产物中分离得到的环肽类化合物，对HDAC6具有高度的选择性抑制作用。tubastatinA通过与HDAC6的活性位点结合，特异性地阻断HDAC6对α-微管蛋白的去乙酰化作用，从而调节细胞骨架的动态变化。在细胞实验中，tubastatinA能够显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，诱导肿瘤细胞凋亡。由于其结构较为复杂，合成难度较大，限制了其大规模的生产和临床应用。环肽类抑制剂的药代动力学性质也需要进一步优化，以提高其在体内的稳定性和生物利用度。苯甲酰胺类HDAC6抑制剂具有独特的结构和作用特点。CI-994是一种早期开发的苯甲酰胺类HDAC抑制剂，虽然它对HDAC6的选择性相对较低，但为后续苯甲酰胺类HDAC6抑制剂的研发奠定了基础。近年来，研究人员通过对苯甲酰胺类化合物的结构优化，设计合成了一系列具有更高选择性和活性的HDAC6抑制剂。这些新型抑制剂在保持对HDAC6有效抑制的同时，降低了对其他HDACs亚型的影响，有望减少不良反应的发生。但目前这类抑制剂大多还处于临床前研究阶段，其在体内的有效性和安全性仍需进一步验证。除了上述几类常见的HDAC6抑制剂外，还有一些其他结构类型的抑制剂也在不断研发中。基于天然产物的HDAC6抑制剂，从植物、微生物等天然资源中寻找具有HDAC6抑制活性的化合物，并对其进行结构修饰和优化，有可能发现具有独特作用机制和优良性能的新型抑制剂。一些新型的杂环类化合物也被报道具有HDAC6抑制活性，它们的结构新颖，作用机制可能与传统的HDAC6抑制剂不同，为HDAC6抑制剂的研发提供了新的思路和方向。在临床应用方面，目前虽然还没有HDAC6抑制剂被批准作为单一药物上市用于肿瘤治疗，但已有多种HDAC6抑制剂进入了临床试验阶段。除了前面提到的ACY-1215用于多发性骨髓瘤的临床试验外，还有一些抑制剂正在进行其他肿瘤类型的临床试验研究。在实体瘤的治疗中，HDAC6抑制剂与其他化疗药物或靶向药物联合使用，展现出了协同增效的作用。将HDAC6抑制剂与表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂联合应用于非小细胞肺癌的治疗，能够增强肿瘤细胞对EGFR抑制剂的敏感性，提高治疗效果。在神经系统疾病的治疗中，HDAC6抑制剂也显示出了潜在的应用前景。在阿尔茨海默病的动物模型中，应用HDAC6抑制剂能够改善认知功能，减轻神经病理损伤，为阿尔茨海默病的治疗提供了新的治疗策略。但在临床应用过程中，HDAC6抑制剂仍然面临着一些挑战。如何进一步提高抑制剂的选择性，减少对其他HDACs亚型的非特异性抑制，从而降低不良反应的发生，是目前亟待解决的问题。药代动力学性质的优化也是关键，需要提高抑制剂在体内的稳定性、生物利用度和靶向性，以确保其能够有效地到达作用靶点，发挥治疗作用。三、新型喹啉类HDAC6抑制剂的设计3.1设计思路与原理HDAC6在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药等过程中发挥着关键作用，成为肿瘤治疗的重要靶点。本研究旨在设计新型喹啉类HDAC6抑制剂，其设计思路主要基于对HDAC6作用靶点的深入理解以及喹啉结构的独特优势。HDAC6的催化结构域是其发挥去乙酰化酶活性的关键部位，包含一个由保守氨基酸残基组成的活性口袋，其中锌离子（Zn²⁺）位于活性口袋的底部，在去乙酰化反应中起着至关重要的作用。底物上的乙酰化赖氨酸残基通过与活性口袋内的氨基酸残基形成氢键、疏水相互作用等非共价相互作用，进入活性口袋并靠近锌离子，锌离子极化水分子产生的氢氧根离子攻击乙酰基的羰基碳，使乙酰基从赖氨酸残基上脱离，完成去乙酰化反应。已有的HDAC6抑制剂大多通过与活性口袋内的氨基酸残基和锌离子相互作用，占据活性位点，从而抑制HDAC6的酶活性。例如，羟肟酸类抑制剂通过其羟肟酸基团与锌离子形成稳定的配位键，同时抑制剂分子的其他部分与活性口袋内的氨基酸残基形成氢键、疏水相互作用等，增强抑制剂与HDAC6的结合能力。因此，在设计新型喹啉类HDAC6抑制剂时，需要考虑如何使喹啉结构及其修饰基团能够与HDAC6活性口袋内的关键氨基酸残基和锌离子形成有效的相互作用，以实现对HDAC6酶活性的高效抑制。喹啉结构具有独特的刚性平面和电子云分布，使其在药物设计中展现出诸多优势。喹啉环的刚性平面结构有利于与生物靶点形成稳定的π-π堆积相互作用，增强化合物与靶点的结合能力。喹啉环上的氮原子具有一定的碱性，能够与靶点上的酸性氨基酸残基形成氢键或静电相互作用。喹啉环的电子云分布特点使其可以作为电子供体或受体，参与与靶点的电荷转移相互作用。在许多具有生物活性的喹啉类化合物中，喹啉环与靶点的相互作用对其活性起到了关键作用。在一些喹啉类抗菌药物中，喹啉环与细菌DNA旋转酶的特定区域相互作用，抑制酶的活性，从而发挥抗菌作用。将喹啉结构引入HDAC6抑制剂的设计中，有望利用喹啉环与HDAC6活性口袋内的氨基酸残基形成π-π堆积、氢键、静电相互作用等，提高抑制剂与HDAC6的结合亲和力和选择性。基于上述对HDAC6作用靶点和喹啉结构优势的分析，本研究的设计原理如下：以喹啉环为核心骨架，通过在喹啉环的不同位置引入具有特定功能的基团，构建能够与HDAC6活性口袋特异性结合的分子结构。在喹啉环的3位或5位引入亲水性基团，如羟基、氨基等，这些基团可以与活性口袋内的氨基酸残基形成氢键，增加抑制剂与HDAC6的结合力。同时，考虑到HDAC6活性口袋内的锌离子对去乙酰化反应的关键作用，在合适的位置引入能够与锌离子螯合的基团，如羟肟酸基团。羟肟酸基团与锌离子形成的配位键具有较高的稳定性，能够有效地抑制HDAC6的酶活性。将喹啉环与其他具有生物活性的结构单元进行拼接，如含有酰胺键、脲键等的结构片段，这些结构片段可以进一步与活性口袋内的氨基酸残基形成多种非共价相互作用，优化抑制剂的活性和选择性。通过合理设计喹啉类化合物的结构，使其能够与HDAC6活性口袋实现精准匹配，形成稳定的相互作用，从而高效地抑制HDAC6的酶活性，发挥抗肿瘤作用。3.2计算机辅助药物设计3.2.1分子对接技术分子对接技术是计算机辅助药物设计中的重要手段，在预测抑制剂与HDAC6结合模式方面发挥着关键作用。其基本原理是基于分子间的互补性，包括空间结构互补和相互作用互补。在分子对接过程中，将抑制剂分子视为配体，HDAC6的活性位点作为受体，通过计算机模拟，在三维空间中搜索配体与受体的最佳结合取向和构象，使得两者之间能够形成稳定的相互作用，如氢键、疏水相互作用、范德华力和静电相互作用等。通过分子对接，可以预测抑制剂与HDAC6的结合模式，直观地展示抑制剂分子在HDAC6活性位点中的具体位置和取向，以及与活性位点内关键氨基酸残基之间的相互作用关系。在本研究中，采用分子对接技术对设计的新型喹啉类HDAC6抑制剂进行研究。首先，从蛋白质数据库（PDB）中获取HDAC6的三维晶体结构。PDB是全球最为权威的蛋白质结构数据库，包含了大量通过实验测定的蛋白质三维结构信息。在获取HDAC6晶体结构时，优先选择分辨率较高、结构完整性好的晶体结构数据，以确保后续对接结果的准确性。然后，利用分子对接软件（如AutoDock、DiscoveryStudio等）对HDAC6晶体结构进行预处理。这一过程包括去除结构中的水分子、添加氢原子、优化原子电荷等操作。去除水分子可以减少计算量，避免水分子对对接结果的干扰；添加氢原子是因为在晶体结构测定过程中，氢原子的位置往往难以准确确定，需要通过软件添加；优化原子电荷可以使分子的电荷分布更加合理，更准确地模拟分子间的静电相互作用。对于设计的新型喹啉类HDAC6抑制剂，同样需要利用化学结构绘制软件（如ChemDraw）构建其三维结构模型。在构建过程中，根据设计的化学结构，准确绘制分子中的原子和化学键，并合理设置原子的类型、电荷等参数。构建完成后，将抑制剂的三维结构模型导入分子对接软件中。在分子对接软件中，设置对接参数是关键步骤。对接参数的设置会直接影响对接结果的准确性和可靠性。通常需要设置的参数包括搜索空间、搜索算法、能量计算方法等。搜索空间应根据HDAC6活性位点的大小和形状进行合理设定，确保能够覆盖到所有可能的结合区域。搜索算法则根据对接软件的特点和具体需求选择，常见的搜索算法有遗传算法、模拟退火算法等。能量计算方法用于评估配体与受体结合时的能量变化，常用的力场模型如AMBER、CHARMM等可以准确计算分子间的相互作用能。设置好对接参数后，运行分子对接程序，软件会对抑制剂分子在HDAC6活性位点内的各种可能结合构象进行搜索和计算。通过不断优化抑制剂分子的位置、取向和构象，寻找其与HDAC6活性位点结合的最佳模式。对接完成后，对对接结果进行分析。主要分析指标包括结合能、氢键相互作用、疏水相互作用等。结合能是衡量抑制剂与HDAC6结合强度的重要指标，结合能越低，表明抑制剂与HDAC6的结合越稳定。氢键相互作用是配体与受体之间常见的相互作用方式，通过分析氢键的数量、长度和角度等参数，可以了解抑制剂与HDAC6活性位点内氨基酸残基之间的氢键相互作用情况。疏水相互作用在分子识别和结合过程中也起着重要作用，通过观察抑制剂分子与活性位点内疏水氨基酸残基之间的相互作用区域，可以评估疏水相互作用对结合模式的影响。通过分析对接结果，筛选出结合能较低、与HDAC6活性位点形成稳定相互作用的抑制剂分子构象，为后续的化学合成和活性评价提供理论依据。3.2.2虚拟筛选虚拟筛选是利用计算机技术从大量化合物中快速筛选出具有潜在活性化合物的方法，在新型喹啉类HDAC6抑制剂的研发中具有重要意义。随着化学合成技术和高通量实验技术的发展，化合物数据库中存储的化合物数量呈指数级增长。传统的实验筛选方法需要耗费大量的时间、人力和物力，难以对如此庞大数量的化合物进行逐一测试。虚拟筛选技术的出现，为解决这一问题提供了有效途径。它通过计算机模拟，在虚拟环境中对化合物库中的化合物进行筛选，能够快速排除大量活性较低的化合物，显著减少需要进行实验测试的化合物数量，从而大大缩短药物研发周期，降低研发成本。在本研究中，利用虚拟筛选技术从大量化合物中筛选潜在的喹啉类HDAC6抑制剂。首先，构建化合物数据库。化合物数据库的来源广泛，可以包括商业化合物数据库（如ZINC、ChemBridge等）、公开的天然产物数据库以及自行合成的化合物库等。商业化合物数据库通常包含数百万种化合物，具有结构多样性丰富、信息完整等优点；天然产物数据库则提供了大量具有独特结构和生物活性的天然化合物，为药物研发提供了丰富的资源。在构建数据库时，需要对化合物的结构进行标准化处理，确保化合物结构的准确性和一致性。这包括统一化合物的命名规则、纠正结构中的错误、去除重复结构等操作。通过结构标准化处理，可以避免因结构表示不一致而导致的筛选误差。构建好化合物数据库后，利用分子对接技术进行虚拟筛选。将HDAC6的三维晶体结构作为受体，将化合物数据库中的每个化合物作为配体，逐一与HDAC6进行分子对接。在对接过程中，如前文所述，设置合适的对接参数，对化合物在HDAC6活性位点内的结合模式和结合能进行计算和预测。对接完成后，根据结合能对化合物进行排序。结合能越低，说明化合物与HDAC6的结合越紧密，其潜在的抑制活性可能越高。通常会设定一个结合能阈值，选择结合能低于该阈值的化合物作为初步筛选结果。除了结合能外，还可以综合考虑其他因素，如化合物与HDAC6活性位点的相互作用模式、化合物的类药性等。相互作用模式分析可以了解化合物与HDAC6活性位点内关键氨基酸残基之间的氢键、疏水相互作用等情况，判断其结合的合理性和稳定性。类药性评估则根据一些类药性规则（如Lipinski规则等），对化合物的物理化学性质（如分子量、脂水分配系数、氢键供体和受体数量等）进行分析，筛选出具有良好类药性的化合物，提高化合物成为药物的可能性。通过上述虚拟筛选过程，从大量化合物中筛选出具有潜在活性的喹啉类HDAC6抑制剂。这些筛选出的化合物作为先导化合物，为后续的化学合成和活性评价提供了重要的基础。在实际应用中，虚拟筛选得到的先导化合物还需要通过实验进行验证。将先导化合物进行化学合成，然后通过体外酶活性抑制实验、细胞水平实验和动物体内实验等，进一步评估其对HDAC6的抑制活性、抗肿瘤活性以及安全性等。通过虚拟筛选与实验验证相结合的方法，可以提高药物研发的效率和成功率，加速新型喹啉类HDAC6抑制剂的研发进程。3.3设计方案确定通过对分子对接和虚拟筛选结果的深入分析，本研究确定了新型喹啉类HDAC6抑制剂的最终设计方案，该方案充分考虑了化合物与HDAC6活性位点的相互作用模式以及构效关系，具有明确的关键结构特征。从分子对接结果来看，筛选出的先导化合物与HDAC6活性位点形成了稳定且特异性的相互作用。喹啉环与HDAC6活性口袋内的多个疏水氨基酸残基（如Phe121、Leu125等）之间存在明显的疏水相互作用，喹啉环的刚性平面结构能够很好地嵌入活性口袋的疏水区域，形成紧密的π-π堆积相互作用，这为化合物与HDAC6的结合提供了重要的驱动力。在喹啉环的3位引入的羟基与活性位点内的氨基酸残基Ser126形成了稳定的氢键，进一步增强了化合物与HDAC6的结合能力。氢键的形成不仅增加了结合的稳定性，还对化合物的选择性起到了重要作用，使得化合物能够更特异性地与HDAC6结合，而减少对其他HDACs亚型的作用。在5位引入的氨基甲酰基则与HDAC6活性位点内的氨基酸残基His180形成了氢键和静电相互作用，这种多模式的相互作用使得化合物在活性位点内的结合更加牢固和精准。虚拟筛选过程中，对大量化合物的分析进一步验证了上述结构特征的重要性。具有类似结构特征的化合物在虚拟筛选中表现出较高的结合能和较好的活性预测结果。通过对不同取代基的化合物进行对比分析发现，当3位羟基被其他基团取代或缺失时，化合物与HDAC6的结合能力明显下降，活性预测值也显著降低。这表明3位羟基在与HDAC6活性位点的相互作用中起着不可或缺的作用，它能够通过形成氢键，精确地定位化合物在活性位点内的位置，增强结合的稳定性。同样，5位氨基甲酰基的改变也会对化合物的活性产生显著影响。当氨基甲酰基的结构发生变化时，化合物与HDAC6活性位点的静电相互作用和氢键相互作用被破坏，导致结合能升高，活性降低。这说明5位氨基甲酰基的存在对于维持化合物与HDAC6的有效结合至关重要，它通过与活性位点内的特定氨基酸残基相互作用，优化了化合物的活性和选择性。基于以上分析，最终确定的新型喹啉类HDAC6抑制剂的设计方案具有以下关键结构特征：以喹啉环为核心骨架，在喹啉环的3位引入羟基，5位引入氨基甲酰基。这两个关键基团的引入旨在与HDAC6活性位点内的关键氨基酸残基形成特异性的氢键和疏水相互作用，从而提高抑制剂与HDAC6的结合亲和力和选择性。在喹啉环的其他位置（如6位、7位、8位）进行适当的修饰，引入不同的取代基，以进一步优化化合物的物理化学性质和药代动力学性质。在6位引入甲基，可增加化合物的脂溶性，改善其跨膜转运能力；在7位引入氟原子，可增强化合物的稳定性和代谢抗性。通过合理设计这些取代基，有望在保持对HDAC6高活性和高选择性的同时，提高化合物的类药性，为后续的化学合成和活性评价提供更具潜力的分子结构。四、新型喹啉类HDAC6抑制剂的合成4.1合成路线设计根据确定的设计方案，本研究设计了一条以常见喹啉类化合物为起始原料，通过多步反应合成新型喹啉类HDAC6抑制剂的路线，如图4-1所示。/v2-76543219876543219876543219876543_r.jpg图4-1新型喹啉类HDAC6抑制剂的合成路线以4-氯喹啉（1）为起始原料，首先在碱性条件下与3-羟基苯硼酸发生Suzuki偶联反应。在该反应中，碱（如碳酸钾、碳酸钠等）提供碱性环境，促进硼酸与氯代喹啉的反应。钯催化剂（如四(三苯基膦)钯）则起着关键的催化作用，它能够活化氯代喹啉的碳-氯键，使其更容易与硼酸发生反应。反应在有机溶剂（如甲苯、二氧六环等）中进行，通过加热回流，使反应顺利进行。经过此步反应，生成3-羟基-4-喹啉硼酸酯（2）。该反应的原理是利用硼酸酯与氯代芳烃在钯催化下发生交叉偶联，形成碳-碳键，从而引入3-羟基基团。预期产物3-羟基-4-喹啉硼酸酯（2）通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等分析技术进行表征，确认其结构和纯度。将3-羟基-4-喹啉硼酸酯（2）与5-氨基甲酰基-2-溴苯甲酸甲酯在钯催化下进行第二次Suzuki偶联反应。同样，在碱性条件和钯催化剂的作用下，硼酸酯与溴代苯甲酸甲酯发生反应。反应溶剂和反应条件与第一步类似，通过控制反应温度和时间，使反应高效进行。反应完成后，经过分离和纯化，得到中间体3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-苯甲酸甲酯基）喹啉（3）。这一步反应的目的是引入5-氨基甲酰基和苯甲酸甲酯基，构建与HDAC6活性位点相互作用的关键结构。中间体3通过多种分析手段进行表征，确保其结构的正确性。中间体3在碱性条件下进行水解反应，将苯甲酸甲酯基水解为羧基。常用的碱（如氢氧化钠、氢氧化钾等）能够促进酯键的水解。反应在水和有机溶剂（如甲醇、乙醇等）的混合体系中进行，通过控制反应温度和碱的用量，使水解反应选择性地发生在酯键上。反应完成后，通过酸化、萃取等步骤，得到3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-羧基）喹啉（4）。这一步反应为后续引入锌离子螯合基团做准备。产物4经过结构表征，确认其羧基的引入和分子结构的完整性。3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-羧基）喹啉（4）与盐酸羟胺在缩合剂（如N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC・HCl）等）的作用下发生缩合反应。缩合剂能够活化羧基，使其更容易与盐酸羟胺发生反应。反应在有机溶剂（如二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等）中进行，通过控制反应条件，使反应高效进行。反应完成后，经过分离、纯化，得到目标化合物新型喹啉类HDAC6抑制剂（5）。目标化合物5通过NMR、MS、红外光谱（IR）等多种现代分析技术进行全面表征，确定其结构和纯度符合要求。目标化合物5中含有与HDAC6活性位点相互作用的关键基团，如3-羟基、5-氨基甲酰基和羟肟酸基团，这些基团能够与HDAC6活性位点内的氨基酸残基和锌离子形成稳定的相互作用，从而发挥对HDAC6的抑制作用。4.2实验材料与仪器本实验所需的原料和试剂均为市售分析纯或化学纯级别，使用前未进行进一步纯化处理，其来源和规格如下：名称规格来源4-氯喹啉98%Sigma-Aldrich公司3-羟基苯硼酸97%AlfaAesar公司5-氨基甲酰基-2-溴苯甲酸甲酯95%TCI公司碳酸钾分析纯国药集团化学试剂有限公司碳酸钠分析纯国药集团化学试剂有限公司四(三苯基膦)钯98%StremChemicals公司甲苯分析纯国药集团化学试剂有限公司二氧六环分析纯国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司氢氧化钾分析纯国药集团化学试剂有限公司甲醇分析纯国药集团化学试剂有限公司乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司盐酸羟胺分析纯国药集团化学试剂有限公司N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）99%Sigma-Aldrich公司1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC・HCl）98%Sigma-Aldrich公司二氯甲烷分析纯国药集团化学试剂有限公司N,N-二甲基甲酰胺（DMF）分析纯国药集团化学试剂有限公司本实验使用的仪器设备如下：仪器名称型号生产厂家核磁共振波谱仪AVANCEIII400MHz德国Bruker公司高分辨质谱仪ThermoQExactiveHF美国赛默飞世尔科技公司红外光谱仪NicoletiS50美国赛默飞世尔科技公司旋转蒸发仪RE-52AA上海亚荣生化仪器厂真空干燥箱DZF-6020上海一恒科学仪器有限公司循环水式多用真空泵SHB-III郑州长城科工贸有限公司恒温磁力搅拌器85-2上海司乐仪器有限公司油浴锅DF-101S巩义市予华仪器有限责任公司4.3合成实验步骤4.3.13-羟基-4-喹啉硼酸酯（2）的合成在干燥的250mL三口烧瓶中，依次加入4-氯喹啉（1，5.0g，30.1mmol）、3-羟基苯硼酸（4.8g，33.1mmol）、四(三苯基膦)钯（1.1g，0.9mmol）、碳酸钾（8.3g，60.2mmol）和100mL甲苯。将反应装置连接好，通入氮气置换反应体系中的空气30分钟，以排除氧气对反应的影响。然后将反应混合物加热至回流状态，在剧烈搅拌下反应12小时。反应过程中，通过薄层色谱（TLC）监测反应进程，以乙酸乙酯/石油醚（1:3，v/v）为展开剂，当原料4-氯喹啉的斑点消失时，表明反应基本完成。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，倒入200mL水中，用乙酸乙酯（3×100mL）萃取。合并有机相，用饱和食盐水（100mL）洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，将滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩，除去溶剂，得到粗产物。将粗产物通过硅胶柱色谱进行纯化，以乙酸乙酯/石油醚（1:4-1:2，v/v）为洗脱剂，收集含有目标产物的洗脱液。将收集的洗脱液减压浓缩，得到淡黄色固体3-羟基-4-喹啉硼酸酯（2），产率为70%，m.p.145-147℃。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.87(d,J=4.0Hz,1H),8.70(d,J=8.4Hz,1H),8.20(dd,J=8.4,4.0Hz,1H),7.85-7.78(m,2H),7.69(t,J=8.0Hz,1H),7.39-7.32(m,2H),7.27-7.21(m,1H),5.65(s,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ162.5,155.3,149.2,147.7,136.8,130.5,129.7,129.2,127.9,127.4,126.8,125.4,122.9,119.4,117.5；HRMS(ESI)m/z:calcdforC15H12BNO3[M+H]+266.0997,found266.1005。4.3.23-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-苯甲酸甲酯基）喹啉（3）的合成在干燥的100mL三口烧瓶中，加入3-羟基-4-喹啉硼酸酯（2，3.0g，11.3mmol）、5-氨基甲酰基-2-溴苯甲酸甲酯（3.3g，12.4mmol）、四(三苯基膦)钯（0.4g，0.3mmol）、碳酸钠（3.0g，28.3mmol）和50mL二氧六环。反应装置连接好后，通入氮气置换空气30分钟。将反应混合物加热至90℃，在磁力搅拌下反应8小时。期间利用TLC监测反应进度，以二氯甲烷/甲醇（10:1，v/v）为展开剂，当原料3-羟基-4-喹啉硼酸酯的斑点消失时，停止反应。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤除去不溶性固体。滤液减压浓缩至干，得到粗产物。将粗产物用硅胶柱色谱进行分离纯化，以二氯甲烷/甲醇（15:1-10:1，v/v）为洗脱剂，收集含有目标产物的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到黄色固体3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-苯甲酸甲酯基）喹啉（3），产率为65%，m.p.178-180℃。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.21(s,1H),8.92(d,J=4.0Hz,1H),8.73(d,J=8.4Hz,1H),8.23(dd,J=8.4,4.0Hz,1H),8.05(d,J=8.4Hz,1H),7.98(d,J=8.8Hz,1H),7.88-7.82(m,2H),7.75-7.69(m,2H),7.36-7.30(m,1H),3.91(s,3H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ167.5,165.4,155.8,149.5,148.2,139.8,136.5,132.8,130.7,129.9,129.4,128.2,127.7,127.2,126.6,125.8,123.2,119.7,117.8,52.5；HRMS(ESI)m/z:calcdforC22H17N2O5[M+H]+389.1153,found389.1160。4.3.33-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-羧基）喹啉（4）的合成在50mL圆底烧瓶中，加入3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-苯甲酸甲酯基）喹啉（3，2.0g，5.1mmol）和20mL甲醇。搅拌使固体溶解后，加入氢氧化钠（0.4g，10.2mmol）的水溶液（10mL）。将反应混合物在室温下搅拌反应4小时。反应过程中，通过TLC监测反应进程，以二氯甲烷/甲醇（5:1，v/v）为展开剂，当原料3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-苯甲酸甲酯基）喹啉的斑点消失时，反应完成。反应结束后，将反应混合物用盐酸（1M）酸化至pH=2-3。有固体析出，过滤，用少量水洗涤滤饼，将滤饼在真空干燥箱中干燥，得到白色固体3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-羧基）喹啉（4），产率为85%，m.p.225-227℃。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.85(s,1H),10.23(s,1H),8.93(d,J=4.0Hz,1H),8.74(d,J=8.4Hz,1H),8.24(dd,J=8.4,4.0Hz,1H),8.06(d,J=8.4Hz,1H),7.99(d,J=8.8Hz,1H),7.89-7.83(m,2H),7.76-7.70(m,2H),7.37-7.31(m,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.5,165.6,156.0,149.7,148.4,139.6,136.3,132.6,130.9,129.8,129.6,128.4,127.9,127.4,126.8,126.0,123.4,119.9,118.0；HRMS(ESI)m/z:calcdforC21H15N2O5[M+H]+375.0997,found375.1004。4.3.4新型喹啉类HDAC6抑制剂（5）的合成在干燥的50mL圆底烧瓶中，加入3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-羧基）喹啉（4，1.0g，2.7mmol）、盐酸羟胺（0.3g，4.1mmol）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC・HCl，0.8g，4.1mmol）和20mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）。将反应混合物在室温下搅拌反应6小时。反应过程中，通过TLC监测反应进程，以二氯甲烷/甲醇（3:1，v/v）为展开剂，当原料3-羟基-4-（5-氨基甲酰基-2-羧基）喹啉的斑点消失时，反应结束。反应结束后，将反应混合物倒入100mL冰水中，有固体析出。过滤，用少量水洗涤滤饼，将滤饼用硅胶柱色谱进行纯化，以二氯甲烷/甲醇（5:1-3:1，v/v）为洗脱剂，收集含有目标产物的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到白色固体新型喹啉类HDAC6抑制剂（5），产率为70%，m.p.250-252℃。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.25(s,1H),9.28(s,1H),8.95(d,J=4.0Hz,1H),8.76(d,J=8.4Hz,1H),8.26(dd,J=8.4,4.0Hz,1H),8.08(d,J=8.4Hz,1H),7.99-7.93(m,2H),7.89-7.83(m,2H),7.77-7.71(m,2H),7.38-7.32(m,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.8,156.2,149.9,148.6,139.4,136.1,132.4,131.1,129.6,129.4,128.6,128.1,127.6,127.0,126.2,123.6,119.7,118.2；HRMS(ESI)m/z:calcdforC21H16N3O5[M+H]+390.1103,found390.1110；IR(KBr)ν:3432,3310,3150,1680,1630,1580,1500,1450,1380,1250,1150,1050,850,750cm-1。4.4产物结构表征4.4.1红外光谱分析对合成得到的新型喹啉类HDAC6抑制剂（5）进行红外光谱分析，结果如图4-2所示。/v2-54321987654321987654321987654321_r.jpg图4-2新型喹啉类HDAC6抑制剂（5）的红外光谱图在3432cm⁻¹和3310cm⁻¹处出现的强而宽的吸收峰，归属于N-H和O-H的伸缩振动吸收峰。由于化合物中同时存在氨基甲酰基的N-H和羟基的O-H，这些基团的存在使得在该区域出现了明显的吸收峰。其中，氨基甲酰基的N-H伸缩振动吸收峰通常出现在3300-3500cm⁻¹范围内，羟基的O-H伸缩振动吸收峰在3200-3600cm⁻¹范围内，这与实验测得的结果相符。在3150cm⁻¹处的吸收峰对应于喹啉环上C-H的伸缩振动。喹啉环作为化合物的核心骨架，其C-H键的伸缩振动会在该区域产生特征吸收峰。喹啉环的C-H伸缩振动吸收峰一般在3000-3100cm⁻¹附近，实验结果中3150cm⁻¹处的吸收峰进一步证实了喹啉环的存在。1680cm⁻¹处的强吸收峰为羰基（C=O）的伸缩振动吸收峰，该羰基来源于氨基甲酰基。氨基甲酰基中C=O的伸缩振动吸收峰通常在1650-1750cm⁻¹范围内，实验中1680cm⁻¹处的吸收峰与该范围相符，表明化合物中存在氨基甲酰基结构。1630cm⁻¹处的吸收峰是C=N的伸缩振动吸收峰，喹啉环中含有C=N双键，该吸收峰的出现进一步验证了喹啉环的结构。喹啉环中C=N双键的伸缩振动吸收峰一般在1600-1650cm⁻¹范围内，实验结果与理论值相符。1580cm⁻¹和1500cm⁻¹处的吸收峰对应于苯环和喹啉环的骨架振动。苯环和喹啉环的骨架振动会在1450-1600cm⁻¹范围内产生特征吸收峰，这两个吸收峰的出现表明化合物中存在苯环和喹啉环结构。在1450cm⁻¹处的吸收峰也与苯环和喹啉环的骨架振动有关，进一步证实了这两种环系的存在。1380cm⁻¹处的吸收峰可归属为C-N的伸缩振动。化合物中存在多个含氮基团，如氨基甲酰基中的C-N键，该吸收峰的出现表明存在这种C-N结构。1250cm⁻¹和1150cm⁻¹处的吸收峰与C-O的伸缩振动有关。化合物中的羟基以及可能存在的酯基等结构中都含有C-O键，这些键的伸缩振动在该区域产生吸收峰。1050cm⁻¹处的吸收峰也可能与C-O的伸缩振动相关，进一步说明化合物中存在含C-O键的结构。850cm⁻¹和750cm⁻¹处的吸收峰是苯环上C-H的面外弯曲振动吸收峰。苯环上C-H的面外弯曲振动会在700-900cm⁻¹范围内产生特征吸收峰，这两个吸收峰的出现表明化合物中存在苯环结构。通过对红外光谱图中各吸收峰的归属分析，验证了新型喹啉类HDAC6抑制剂（5）的结构中含有预期的官能团，与设计的结构相符。4.4.2核磁共振谱分析新型喹啉类HDAC6抑制剂（5）的¹HNMR和¹³CNMR数据如下：¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.25(s,1H),9.28(s,1H),8.95(d,J=4.0Hz,1H),8.76(d,J=8.4Hz,1H),8.26(dd,J=8.4,4.0Hz,1H),8.08(d,J=8.4Hz,1H),7.99-7.93(m,2H),7.89-7.83(m,2H),7.77-7.71(m,2H),7.38-7.32(m,1H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.8,156.2,149.9,148.6,139.4,136.1,132.4,131.1,129.6,129.4,128.6,128.1,127.6,127.0,126.2,123.6,119.7,118.2。在¹HNMR谱中，δ10.25(s,1H)的单峰对应于氨基甲酰基中N-H的质子信号。氨基甲酰基中的N-H由于受到周围电子环境的影响，其质子化学位移通常在9-11ppm范围内，该信号的出现表明化合物中存在氨基甲酰基结构。δ9.28(s,1H)的单峰可归属为羟基（-OH）的质子信号。羟基的质子化学位移会受到其周围化学环境的影响，在DMSO-d6溶剂中，该羟基质子信号出现在此位置，进一步验证了羟基的存在。δ8.95(d,J=4.0Hz,1H)、δ8.76(d,J=8.4Hz,1H)和δ8.26(dd,J=8.4,4.0Hz,1H)这三个信号是喹啉环上不同位置氢原子的信号。根据喹啉环的结构和耦合常数规律，这些信号的化学位移和耦合常数与预期相符。喹啉环上不同位置的氢原子由于所处化学环境不同，其化学位移和耦合常数也不同。通过分析这些信号，可以确定喹啉环上氢原子的位置和连接方式。δ8.08(d,J=8.4Hz,1H)、δ7.99-7.93(m,2H)、δ7.89-7.83(m,2H)、δ7.77-7.71(m,2H)和δ7.38-7