《脐带间充质干细胞制剂放行技术规范》

ICS11.120

CCSC27

团体标准

T/LNBAXXXX—XXXX

脐带间充质干细胞制剂放行技术规范

Technicalspecificationforreleaseofumbilicalcordmesenchymal

stemcellpreparation

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

辽宁省生物技术协会  发布

T/LNBAXXXX—XXXX

脐带间充质干细胞制剂放行技术规范

1范围

本文件规定了脐带间充质干细胞制剂放行的要求、检验方法、检验规则和包装、贮存、运输。

本文件适用于脐带间充质干细胞制剂(以下简称干细胞制剂)的放行、检验。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T39729细胞纯度测定通用要求流式细胞测定法

GB/T39730细胞计数通用要求流式细胞测定法

WS273梅毒诊断

WS293艾滋病和艾滋病病毒感染诊断

《中华人民共和国药典》

《全国临床检验操作规程》

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

脐带间充质干细胞umbilicalcordmesenchymalstemcell

从人类脐带结缔组织中分离得到的，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。

[来源：《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》，有修改]

干细胞制剂stemcellpreparation

用于治疗疾病或改善健康状况的、以不同类型干细胞为主要成分、符合相应质量及安全标准，且具

有明确生物学效应的细胞制剂。

[来源：《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》]

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CD：细胞膜表面分化抗原簇（ClusterofDifferentiation）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

HLA-DR：人类白细胞抗原DR等位基因（HumanLeukocyteAntigenDR）

TP：梅毒螺旋体（TreponemaPallidum）

5要求

干细胞质量属性

5.1.1基本生物学属性

干细胞基本生物学属性要求见表 1 。

1

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表1干细胞基本生物学属性

项目要求

细胞形态细胞贴壁生长，亮度高，伸展呈长梭形，形态均一

细胞计数/（个/kga）≥1×106

细胞活率/（%）＞95

a受体体重。

5.1.2微生物安全性

干细胞微生物安全性要求见表 2 。

表2干细胞微生物安全性

项目要求

细菌阴性

真菌阴性

支原体阴性

内毒素/（EU/mL）≤0.5

病毒

阴性

（TP、HCV、HBV、HIV、新冠病毒）

5.1.3生物学有效性

干细胞生物学有效性要求见表 3 。

表3干细胞生物学有效性

项目要求

干性标志物（CD73、CD90和CD105）

＞95

阳性率/（%）

细胞表型

分化标志物（CD14、CD19、CD34、CD45

＜2

和HLA-DR）阳性率/（%）

第十代的脐带间充质干细胞，在体外条件培养基诱导培养下，具备分

三系分化能力

化成脂肪、骨和软骨细胞的能力。

干细胞制剂配制

干细胞制剂配制应符合附录A的规定。

6检验方法

基本生物学属性

6.1.1细胞形态

贴壁培养条件下，使用倒置显微镜，在物镜 10 倍或 20 倍下观察。

6.1.2细胞计数

按照GB/T39730规定的方法检测。

6.1.3细胞活率

按照《全国临床检验操作规程》白细胞计数的方法检测。

微生物安全性

6.2.1细菌

按照《中华人民共和国药典》四部，通则 1101 无菌检测法检测。

2

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6.2.2真菌

按照《中华人民共和国药典》四部，通则 1101 无菌检测法检测。

6.2.3支原体

按照《中华人民共和国药典》四部，通则 3301 支原体检查法检测。

6.2.4内毒素

按照《中华人民共和国药典》四部，通则 1143 细菌内毒素检查法检测。

6.2.5病毒

6.2.5.1TP

按照 WS 273 附录A.3规定的方法检测。

6.2.5.2HCV

按照《全国临床检验操作规程》核酸法检测。

6.2.5.3HBV

按照《全国临床检验操作规程》核酸法检测。

6.2.5.4HIV

按照 WS 293 附录B.3规定的方法检测。

6.2.5.5新冠病毒

参照《全国临床检验操作规程》病毒核酸法检测。

生物学有效性

6.3.1细胞表型

参照GB/T39729规定的方法检测。

6.3.2三系分化能力

参照附录 B 的方法检测。

7检验规则

放行检验

7.1.1产品出厂前，应由制备机构的质量检验部门按本标准规定对每个干细胞制剂产品进行检验，检

验合格，方可出厂。

7.1.2检验项目：干细胞基本生物学属性、微生物安全性和细胞表型。

型式检验

7.2.1检验项目：5.1全部要求。

7.2.2型式检验至少每年进行一次。有下列情况之一者，亦应进行：

——原辅材料有较大变化时；

——更换设备或停产后，重新恢复生产时；

——出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时；

——国家市场监督检验机构提出抽检要求时。

判定规则

3

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任何一项指标检验不合格时，判该产品为不合格。

8包装、贮存、运输

干细胞制剂应贮存于 -150 ℃及以下的气相或液相液氮中。

干细胞制剂运输和转运容器的材质应防漏、抗震、抗压力变化。

运输和转运容器应定期进行验证，并保持其处于有效运行状态。

干细胞制剂在不同运输时间条件下应符合以下要求：

——2h内常温运输；

——2h以上冷藏（2 ℃～8 ℃）运输；

——最长运输时间不得超过24 h。

4

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A

A

B

B

附录A

（规范性）

干细胞制剂配制要求

A.1用于配制干细胞制剂的中间细胞产品，代数应不少于四代，不超过六代。

A.2干细胞制剂重悬液应按照经批准的配方进行配制和灌装，其中白蛋白含量不得低于2 %。

5

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C

附录B

（资料性）

三系分化能力检验方法

B.1成脂分化检验（油红O染色法）

B.1.1仪器和设备

B.1.1.1二氧化碳培养箱。

B.1.1.2显微镜。

B.1.1.3血球计数板。

B.1.1.4离心机。

B.1.2试剂

B.1.2.1磷酸盐缓冲液：pH 7.4。

B.1.2.2消化酶。

B.1.2.3间质干细胞完全培养基。

B.1.2.4成脂诱导培养基。

B.1.2.5油红O染色液试剂盒。

B.1.3检测步骤

B.1.3.1细胞消化

将干细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养，至细胞融合度达到 80 % ～ 90 %。采用消化酶，根据

消化酶说明书消化细胞。收集消化后的干细胞使用血球计数板及显微镜进行细胞计数，按照 1×104个/cm2

的细胞密度接种在事先包被基质胶的 T 25 培养瓶中，加入适量完全培养基，继续培养至细胞融合度

 100%。

B.1.3.2细胞诱导

吸除培养瓶中的干细胞完全培养基，按照成脂诱导培养基说明书的使用方法及诱导时间，诱导分化

干细胞。

B.1.3.3脂滴染色

根据油红O染色液试剂盒说明书进行脂滴染色。

B.1.4结果分析

显微镜下可见橙红色的大小不等的脂滴。

B.2成骨分化检验（茜素红S染色法）

B.2.1仪器和设备

B.2.1.1二氧化碳培养箱。

B.2.1.2血球计数板。

B.2.1.3显微镜。

B.2.1.4离心机

B.2.2试剂

B.2.2.1磷酸盐缓冲液：pH 7.4。

B.2.2.2消化酶。

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B.2.2.3间质干细胞完全培养基。

B.2.2.4成骨诱导培养基。

B.2.2.5茜素红S染色液试剂盒。

B.2.3检测步骤

B.2.3.1细胞消化

将干细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养，至细胞融合度达到 80 %～90 %。采用消化酶，根据

消化酶说明书消化细胞。收集消化后的干细胞使用血球计数板及显微镜进行细胞计数，按照 1×105个/cm2

的细胞密度接种在事先包被基质胶的 T 25 培养瓶中，加入适量完全培养基，继续培养至细胞融合度

60 %～70 %。

B.2.3.2细胞诱导

吸除培养瓶中的干细胞完全培养基，按照成骨诱导培养基说明书的使用方法及诱导时间，诱导分化

干细胞。

B.2.3.3钙结节染色

根据茜素红S染色液试剂盒说明书进行钙结节染色。

B.2.4结果分析

显微镜下可见散在大量橘红色的钙结节。

B.3成软骨分化检验（阿尔新蓝染色法）

B.3.1仪器和设备

B.3.1.1二氧化碳培养箱。

B.3.1.2血球计数板。

B.3.1.3显微镜。

B.3.1.4离心机。

B.3.2试剂

B.3.2.1磷酸盐缓冲液：pH 7.4。

B.3.2.2消化酶。

B.3.2.3成软骨诱导培养基。

B.3.2.4阿尔新蓝染色液试剂盒。

B.3.3检测步骤

B.3.3.1细胞消化

采用消化酶，根据消化酶说明书消化细胞。收集消化后的干细胞使用血球计数板及显微镜进行细胞

计数，取 4×105个细胞，用磷酸盐缓冲液清洗重悬 2次～3次。

B.3.3.2细胞诱导

按照成软骨诱导培养基说明书的使用方法及诱导时间，诱导分化干细胞。

B.3.3.3软骨染色

根据阿尔新蓝染色液试剂盒说明书进行软骨染色。

B.3.4结果分析

显微镜下可见深蓝色的软骨细胞胞外基质。

7

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参考文献

［1］国家食品药品监督管理总局关于印发《干细胞临床研究管理办法（试行）》的通知（国卫科

教发〔2015〕48号）

［2］国家卫生计生委办公厅国家食品药品监管总局办公厅关于印发《干细胞制剂质量控制及临床

前研究指导原则(试行)》的通知（国卫办科教发〔2015〕46号）

［3］国家食品药品监督管理总局关于实施《药品生产质量管理规范（2010年修订）》有关事宜的

公告（2011年第19号）

［4］国家药监局关于发布《药品生产质量管理规范（2010年修订）》生物制品附录修订稿的公告

（2020年第58号）

［5］国家食品药品监督管理总局关于发布《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》的通告（2017

年第216号）

［6］袁宝珠.干细胞的“法规—监管—指导原则”体系[J].生命科学,2016,28(08):949-957

［7］袁宝珠.治疗性干细胞产品的相关风险因素[J].中国生物制品学杂志,2013,26(05):736-739

［8］张可华，纳涛，韩晓燕，袁宝珠.人间充质干细胞生物学有效性的质量评价[J].中国新药杂

志,2018,27(21):2511-2518

［9］张可华，纳涛，韩晓燕，袁宝珠.基于免疫调控功能的间充质干细胞生物学有效性质量评价策

略[J].中国新药杂志,2016,25(03):283-290+296

［10］樊金萍，袁宝珠.用于鉴别猴源细胞及其交叉污染短串联重复序列图谱分析方法的建立[M].

中国生物制品学杂志,2018.31(8):874-881

［11］刘晶，徐英辉，邹伟，任晓春.干细胞临床研究质控体系的建立[M].北京:人民卫生出版社，

2017

［12］韩忠朝，李宗金，韩之波.间充质干细胞基础与临床[M].北京:科学出版社，2013

［13］T/CSCB0001―2020干细胞通用要求

［14］T/CSB0001―2023人脐带间充质干细胞检测技术规范

8

《脐带间充质干细胞制剂放行技术规范》团体标准

编制说明（征求意见稿）

一、工作简况

（一）任务来源

2024年3月，经辽宁省生物技术协会理事会研究决定，批准辽

宁省生物技术协会团体标准《脐带间充质干细胞放行标准》立项，由

辽宁省生物技术协会牵头负责组织起草工作。

（二）主要工作过程

为了确保标准起草工作的顺利完成，项目牵头起草单位成立了标

准起草工作组，拟定了标准起草工作方案，明确了目标任务、人员分

工和工作时限。

2024年3月至5月，成立标准起草工作组，就干细胞制剂放行

质量要求及检验方法广泛查阅了相关标准、技术指导文件等资料，搭

建标准框架。

2024年6月至12月，标准起草工作组对相关干细胞制备机构进

行调研，了解掌握干细胞制剂放行、检验实际情况，编制标准文本，

并经起草组讨论将标准名称修改为:《脐带间充质干细胞制剂放行技

术规范》，形成标准工作组讨论稿。经过与业内专家多次沟通、讨论、

修改，完成标准征求意见稿。

二、标准编制主要技术内容的论据

（一）标准编制原则

1.规范性

本标准的结构、编写规则和技术内容要素的确定是严格按照GB/T

1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规

则》的要求和规定进行编制。

2.适用性

本标准具有科学性、实用性和可操作性，充分考虑了行业内脐带

间充质干细胞制剂技术发展的实际情况，可有效规范干细胞制剂产品

质量，促进干细胞产业发展。

3.协调性和统一性

本标准遵循国家相关法律法规、政策性文件，与有关国家标准、

行业标准相一致，并在此基础上，根据协会各成员单位脐带间充质干

细胞放行质量控制及检验方法等要求制定编写。

（二）标准的主要内容

《脐带间充质干细胞制剂放行技术规范》包括范围、规范性引用

文件、术语和定义、缩略语、要求、检验方法、检验规则和包装、贮

存、运输，共8个部分。

（三）主要技术内容及技术依据

1.范围

本文件规定了脐带间充质干细胞制剂放行的要求、检验方法、检

验规则和包装、贮存、运输。

本文件适用于脐带间充质干细胞制剂(以下简称干细胞制剂)的

放行、检验。

2.规范性引用文件

本标准引用文件包括：GB/T39729《细胞纯度测定通用要求流

式细胞测定法》、GB/T39730《细胞计数通用要求流式细胞测定法》、

WS273《梅毒诊断》、WS293《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》、《中

华人民共和国药典》、《全国临床检验操作规程》。所引用的均为现行

有效标准。

3.术语和定义

3.1脐带间充质干细胞umbilicalcordmesenchymalstemcell

从人类脐带结缔组织中分离得到的，具有多向分化潜力，非造血

干细胞的成体干细胞。

[来源：《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》，

有修改]

3.2干细胞制剂stemcellpreparation

用于治疗疾病或改善健康状况的、以不同类型干细胞为主要成

分、符合相应质量及安全标准，且具有明确生物学效应的细胞制剂。

[来源：《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》]

4.缩略语

本标准涉及缩略语共6个，归集在一起列于“缩略语”一章。

5.要求

5.1干细胞质量属性

干细胞质量属性是由干细胞的科学属性和干细胞产品整个制备

过程中所涉及的各种风险因素综合考虑而确定的，决定干细胞产品临

床应用的安全性和有效性的所有质量要素的总和。干细胞质量属性可

归纳为基本生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性和生物学有

效性。结合调研实际，干细胞制剂质量控制应进行的检验项目至少包

括细胞形态、细胞计数、细菌、真菌、支原体、内毒素、病毒、细胞

表型和三系分化能力，具体要求如下。

（1）根据国际细胞疗法协会(ISCT)制定的间充质干细胞基本鉴

定标准及实际要求确定显微镜下细胞形态；

（2）根据脐带间充质干细胞制剂的生物学活性特点，要求细胞

活率＞95%；

（3）根据脐带间充质干细胞制剂的质量及保存要求，本产品应

无菌（细菌、真菌均不得检出）；

（4）根据脐带间充质干细胞产品的生物学安全性特点要求支原

体不得检出，内毒素≤0.5EU/mL，病毒（TP、HCV、HBV、HIV、新冠

病毒核酸）检测结果为阴性；

（5）根据脐带间充质干细胞产品的生物学有效性要求干性标志

物(CD73、CD90和CD105)阳性率＞95%，分化标志物（CD45、CD34、

CD14、CD19和HLA-DR）阳性率＜2%，第十代的脐带间充质干细胞可

以在体外条件培养基诱导培养下，分化成脂肪、骨和软骨细胞。

5.2制剂配置

为保证干细胞制剂产品质量，要求“用于配制干细胞制剂的中间

细胞产品，代数应不少于四代，不超过六代。”为保障干细胞制剂保

存稳定性，增加干细胞活力，要求“重悬液白蛋白含量不得低于2 %”。

考虑到标准结构，将本节要求放于附录A中。

6.检验方法

标准第6章，根据干细胞制剂生产机构实际操作检验依据及方

法，将干细胞质量属性检验方法归结于本章。其中，三系分化能力没

有国标/行标等检验依据，结合机构实际将检验方法归结于附录B中。

7.检验规则

结合调研结果，将检验分为放行检验和型式检验，并分别做出要

求。为保证每个干细胞制剂质量，要求任何一项指标检验不合格时，

判该产品为不合格。

8.包装、贮存、运输

标准第8章根据行业内企业实际要求，对干细胞制剂的贮存、转

运温度、运输转运容器的材质和状态做出了明确规定。

9.附录

附录A（规范性附录）干细胞制剂配制要求

附录B（资料性附录）三系分化能力检验方法