同型半胱氨酸特异性荧光探针构建

同型半胱氨酸特异性荧光探针构建摘要：同型半胱氨酸（Hcy）是生物体代谢中的一个重要的中间产物，其代谢异常常常会引发众多疾病例如高血压、心血管疾病等。因此，实时监测Hcy水平的波动对于疾病预防和发现十分重要。由于生物硫醇的结构相似、化学性质相近且在体内浓度差异，对Hcy荧光探针的开发造成了极大的挑战，当前Hcy荧光探针在特异性位点、荧光波长和生物相容性等方面仍然存在很大的不足。因此，Hcy荧光探针的进一步开发和研究仍迫在眉睫。在此，本文基于香豆素荧光团，通过连接对羟基吡啶及对巯基吡啶作用位点，设计并合成两种荧光探针P1和P2，并通过核磁、质谱对二者进行谱图解析，有望开发Hcy快速特异性荧光开启型探针。关键词：同型半胱氨酸荧光探针特异性ConstructionofhomocysteinespecificfluorescentprobesAbstract:Asanimportantmetaboliteofsulfur-containingaminoacids,homocysteine(Hcy)isconsideredasanindependentriskfactorforhypertension,diabetesandcardiovasculardiseases.Therefore,itisimportanttomonitorthefluctuationofHcylevelinrealtimefortheearlydiagnosisandtreatmentofthesediseases.Duetothesimilarstructure,similarchemicalpropertyanddifferentconcentrationsinvivo,thedevelopmentofHCYfluorescentprobesisagreatchallenge.Atpresent,theHcyfluorescenceprobestillhassomedeficienciesinthespecificsites,fluorescencewavelengthsandBiocompatibility.Therefore,thefurtherdevelopmentandresearchofHCYfluorescentprobeisstillurgent.Basedonthecoumarinfluorophores,twokindsoffluorescenceprobesP1andP2weredesignedandsynthesizedbylinkingtheinteractionsitesofP-hydroxypyridineandP-mercaptopyridine,itishopefultodevelopHcyfastspecificfluorescenceopenprobe.Keywords:Homocysteine,fluorescentprobes,specificity1前言1.1绪论近年来，科研工作者们经过不懈努力与深入研究，在分析化学领域和生命科学领域中不断取得突破性进展，并且日益意识到一些生物活性小分子在生命体系内的关键作用。许多生物活性小分子在生物体内发挥着细胞信号传递、代谢过程调控、基因表达等多个方面的至关作用。它们性质活泼，贯穿着核酸、蛋白质、脂类、糖类以及氨基酸等重要化合物的合成过程之中，积极参与生命过程的各个反应，从而维持了生物体的各项生命活动的正常进行。而其中的活性硫物种，包括：谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸、二氧化硫、硫化氢等，它们以游离状态或与蛋白质结合的形式存在与生物体中，通过生物合成和代谢过程互相转化、互相制约，其及代谢水平异常会引发各种各样的疾病ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kohl</Author><Year>2019</Year><RecNum>22</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1]</style></DisplayText><record><rec-number>22</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713009930">22</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kohl,J.B.</author><author>Mellis,A.T.</author><author>Schwarz,G.</author></authors></contributors><auth-address>InstituteofBiochemistry,DepartmentofChemistryandCenterforMolecularMedicineCologne,UniversityofCologne,Cologne,Germany.</auth-address><titles><title>Homeostaticimpactofsulfiteandhydrogensulfideoncysteinecatabolism</title><secondary-title>BrJPharmacol</secondary-title><alt-title>Britishjournalofpharmacology</alt-title></titles><periodical><full-title>BrJPharmacol</full-title><abbr-1>Britishjournalofpharmacology</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>BrJPharmacol</full-title><abbr-1>Britishjournalofpharmacology</abbr-1></alt-periodical><pages>554-570</pages><volume>176</volume><number>4</number><edition>2018/08/09</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>Cysteine/*metabolism</keyword><keyword>Homeostasis</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>HydrogenSulfide/*metabolism</keyword><keyword>Mitochondria/metabolism</keyword><keyword>Sulfites/*metabolism</keyword></keywords><dates><year>2019</year><pub-dates><date>Feb</date></pub-dates></dates><isbn>0007-1188(Print) 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1474-4422</isbn><accession-num>12849121</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/s1474-4422(03)00438-1</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[6]和骨质疏松ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]等疾病密切相关。当血浆中同型半胱氨酸的浓度达到或者超过10μmol/L时，就会被定义为高Hcy血症(HHcy)。在出现患者同时患有原发性高血压的情况时，就会被进一步被诊断为H型高血压。因此，为了能够得到Hcy的实时监测情况，开发并应用一种能够精确检测Hcy变化的方法颇具意义。相比于高效液相色谱法（HPLC）、酶促循环分析法（ECA）、酶免疫分析法（EIA）和荧光极性化免疫分析（FPIA）等分析检测手段ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8-10]。荧光探针具有可视化、非破坏性、原位检测等特点，能够为生命活性分子生理和病理过程的动态示踪提供独特的解决方案，实现分子信息认知到组织器官成像。ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wu</Author><Year>2022</Year><RecNum>32</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>32</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713011218">32</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wu,X.</author><author>Wang,R.</author><author>Kwon,N.</author><author>Ma,H.</author><author>Yoon,J.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofChemistryandNanoscience,EwhaWomansUniversity,Seoul03760,Korea.jyoon@ewha.ac.kr. BeijingNationalLaboratoryforMolecularSciences,KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLivingBiosystems,InstituteofChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China.mahm@.</auth-address><titles><title>Activatablefluorescentprobesforinsituimagingofenzymes</title><secondary-title>ChemSocRev</secondary-title><alt-title>ChemicalSocietyreviews</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></alt-periodical><pages>450-463</pages><volume>51</volume><number>2</number><edition>2021/12/25</edition><keywords><keyword>Biomarkers</keyword><keyword>*FluorescentDyes</keyword><keyword>*OpticalImaging</keyword></keywords><dates><year>2022</year><pub-dates><date>Jan24</date></pub-dates></dates><isbn>0306-0012</isbn><accession-num>34951429</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1039/d1cs00543j</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[11]因此，已经成为目前的重要检测手段之一。然而，在细胞中存在三种小分子生物硫醇即半胱氨酸（Cys），同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），它们结构相近、化学性质极其相似，每个化合物分子都具有一个巯基（-SH）和一个氨基（-NH2）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12-16]，并且同型半胱氨酸与半胱氨酸相比，只在巯基前包含一个亚甲基，大多数的生物硫醇检测荧光探针不能够区分它们，尤其是Cys和Hcy。此外，它们在生物体内具有浓度差异，GSH含量为0.5~10mmol，远高于Hcy(9~13μmol)和Cys(30~200μmol)的含量，且Hcy含量是最少的，这些都对Hcy的特异性荧光探针合成造成了极大的挑战。科学家们已经开发了许多能够检测生物硫醇的荧光探针，但是到目前为止所存在的荧光探针在识别硫醇时依旧存在合成步骤繁琐、识别时间长、受其他氨基酸影响大等缺点。1.2荧光探针1.2.1荧光探针的结构一般来说，荧光探针的结构由三部分组成，分别是含大π键、刚性平面、共轭体系、具备给电子能力的荧光团（Fluorophore），能够对检测物质进行特异性响应的识别基团（Acceptor）以及通过各种方式将二者连在一起的连接基团（Linker）。在识别基团与目标分析化合物发生反应结合后，会导致荧光强度或者发射波长等荧光信号改变ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lichtman</Author><Year>2005</Year><RecNum>38</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[17]</style></DisplayText><record><rec-number>38</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012194">38</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lichtman,J.W.</author><author>Conchello,J.A.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMolecularandCellBiology,HarvardUniversity,7DivinityAvenue,Cambridge,Massachusetts02138,USA.jeff@</auth-address><titles><title>Fluorescencemicroscopy</title><secondary-title>NatMethods</secondary-title><alt-title>Naturemethods</alt-title></titles><periodical><full-title>NatMethods</full-title><abbr-1>Naturemethods</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>NatMethods</full-title><abbr-1>Naturemethods</abbr-1></alt-periodical><pages>910-9</pages><volume>2</volume><number>12</number><edition>2005/11/22</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>*FluorescentDyes</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Microscopy,Fluorescence/instrumentation/*methods</keyword></keywords><dates><year>2005</year><pub-dates><date>Dec</date></pub-dates></dates><isbn>1548-7091(Print) 1548-7091</isbn><accession-num>16299476</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1038/nmeth817</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[17]。但部分荧光探针即使不包含连接基团结构，也能够实现荧光的信号识别ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Qian</Author><Year>2015</Year><RecNum>39</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[18]</style></DisplayText><record><rec-number>39</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012251">39</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Qian,X.</author><author>Xu,Z.</author></authors></contributors><auth-address>ShanghaiKeyLaboratoryofChemicalBiology,StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,SchoolofPharmacy,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China.xhqian@.</auth-address><titles><title>Fluorescenceimagingofmetalionsimplicatedindiseases</title><secondary-title>ChemSocRev</secondary-title><alt-title>ChemicalSocietyreviews</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></alt-periodical><pages>4487-93</pages><volume>44</volume><number>14</number><edition>2015/01/06</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>CellLine</keyword><keyword>*FluorescentDyes</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>*Metals</keyword><keyword>Mice</keyword><keyword>Neoplasms/*pathology</keyword><keyword>OpticalImaging/*methods</keyword></keywords><dates><year>2015</year><pub-dates><date>Jul21</date></pub-dates></dates><isbn>0306-0012</isbn><accession-num>25556818</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1039/c4cs00292j</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[18]。据此分析，我们能够发现，荧光团承担着识别信号，并将信号通过荧光释放的功能。为了保证信号释放的顺利进行，其分子结构需要是吸电子结构，同时还需具有特定的激发波长的能量。此外，这些物质还要求荧光量子产率到达一定高值。吸收光的分子所具有荧光量子产率偏低，所释放出的荧光就会偏小，其中一个原因可能再于，当吸收特定激发波长的能量之后，这部分能量可能会被同类或者其他分子碰撞所消耗，最终以热能的形式被释放，因此不能够以荧光的形式被释放。通常情况下，当发现分子中存在着π共轭结构的时候，我们会发现该分子的荧光效率将随着共轭程度的增加而增加，从而在荧光光谱会表现为光谱向着波长增加的方向移动。因此，如果我们能够将分子与增强共轭的结构进行连接，便能够为分子在荧光效率增加或者荧光光谱向长波方向移动提供机会。1.2.2荧光探针的作用机制当电子跃迁到激发态时，对于大多数电子而言会进入到单重激发态。然而这种状态并不能维持很长的时间，这些电子会在非常快速的时间内向下跃迁到达S1能级。接着，此能级内的电子会向最低能级集中，在整个过程中的能量均会通过光来进行释放。对于这种光来说，它的半衰期非常短暂，以纳秒为单位，被称为荧光。对于那些半衰期超过纳秒的电子，通常会经由弛豫方式进入到三重激发态，之后再经由辐射跃迁的方式回到基态。由于这种方式所得到的三重态具有较长半衰期，因此经由的发射光也会具有较长的存在寿命，这种发射光我们称之为磷光。图1.1荧光产生示意图Figure1.1Schematicdiagramoffluorescencegeneration基于荧光探针的结构以及荧光发射机制，科研工作者们衍生出了多种机制，包括分子内电荷转移作用机制（IntramolecularChargeTransfer，ICT）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Nootem</Author><Year>2021</Year><RecNum>40</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[19]</style></DisplayText><record><rec-number>40</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012695">40</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Nootem,Jukkrit</author><author>Daengngern,Rathawat</author><author>Sattayanon,Chanchai</author><author>Wattanathana,Worawat</author><author>Wannapaiboon,Suttipong</author><author>Rashatasakhon,Paitoon</author><author>Chansaenpak,Kantapat</author></authors></contributors><titles><title>ThesynergyofCHEFandICTtowardfluorescence‘turn-on’probesbasedonpush-pullbenzothiazolesforselectivedetectionofCu2+inacetonitrile/watermixture</title><secondary-title>JournalofPhotochemistryandPhotobiologyA:Chemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofPhotochemistryandPhotobiologyA:Chemistry</full-title></periodical><volume>415</volume><section>113318</section><dates><year>2021</year></dates><isbn>10106030</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jphotochem.2021.113318</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[19]、光诱导电子转移作用机制（Photo-InducedElectronTransfer，PET）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wright</Author><Year>2020</Year><RecNum>41</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[20]</style></DisplayText><record><rec-number>41</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012769">41</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wright,G.D.</author><author>Yao,C.Y.</author><author>Moody,T.S.</author><author>deSilva,A.P.</author></authors></contributors><auth-address>SchoolofChemistryandChemicalEngineering,Queen'sUniversity,BelfastBT95AG,NorthernIreland,UK.a.desilva@qub.ac.uk. AlmacSciences,CraigavonBT635QD,NorthernIreland,UK.</auth-address><titles><title>Fluorescentmolecularlogicgatesbasedonphotoinducedelectrontransfer(PET)drivenbyacombinationofatomicandbiomolecularinputs</title><secondary-title>ChemCommun(Camb)</secondary-title><alt-title>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></alt-periodical><pages>6838-6841</pages><volume>56</volume><number>50</number><edition>2020/05/21</edition><keywords><keyword>ElectronTransport</keyword><keyword>Fluorescence</keyword><keyword>FungalProteins/*chemistry</keyword><keyword>Hydrogen/chemistry</keyword><keyword>Lipase/*chemistry</keyword><keyword>*Logic</keyword><keyword>Sodium/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2020</year><pub-dates><date>Jun23</date></pub-dates></dates><isbn>1359-7345</isbn><accession-num>32432237</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1039/d0cc00478b</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[20]、激发态分子内质子转移作用机制（Excited-StateIntramolecularProtonTransfer，ESIPT）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[21]、荧光共振能量转移作用机制（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[22]等。分子内电荷转移作用机制（ICT）分子内电荷转移作用机制（ICT）指的是经由一定波长的光激发，电荷在分子内部发生由供体向受体的转移过程。具体表述为，探针分子内的电荷经由提供电子的基团，在共轭体系的帮助下，移动到接受电子基团上面，形成了一个“推-拉”结构的电子共轭体系（D-π-A）。此过程中迁移的负电荷可来源于分子本身，也可来源于某些反应（与分析物之间的相互作用）。在这一基础上，如果使用提供电子的基团进行识别，进行识别的基团与分析物结合后会增强其提供电子的能力，时HOMO/LUMO能级之间的差值变小，在光谱上会造成引发和发射波长向长波长方向移动。换言之，如果使用接受电子的基团进行识别，其与分析物作用后减弱了其吸电子能力，使HOMO/LUMO能级之间的差值变大，在光谱上会造成吸收和发射波长向短波长方向移动。光诱导电子转移作用机制(PET）光诱导电子转移作用机制（PET）指的是经由一定波长的光激发，利用非共轭连接基团将荧光团和识别基团结合在一起，引发分子内电子转移，导致荧光团荧光猝灭的机制。荧光探针的设计基于PET机制的原理，通过选择合适的荧光团和识别基团，并利用非共轭的基团将它们连接在一起，可以实现对目标分析物的特异性识别和检测。当目标分析物与识别基团结合时，PET过程被抑制，荧光恢复，从而实现对目标分析物的可视化检测。该机制的应用广泛，不仅在化学领域有着重要的地位，还在生物学、医学等领域中发挥着重要作用。荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移作用机制（FRET）具体指的是在与分析物作用前，对于受体的紫外吸收与供体的发射来说，几乎没有重叠发生。然而，当受体荧光团与目标分析物相互作用后，受体的紫外吸收会发生移动，然后与供体的发射出现重合，形成FRET体系。在设计探针时，我们需考虑以下几个因素：首先，给体与受体之间的距离，应该控制在10至100埃以内；其次，对于二者的发射光谱与吸收光谱来说，应该出现重叠现象；最后，在给体与受体之间，应该以柔性非共轭键连接。通过优化这些因素，我们可以提高FRET效率，从而实现更准确的生物分子相互作用研究和更灵敏的生物传感应用。在实际应用中，FRET技术可用于实时监测生物分子之间的相互作用，在药物筛选、基因表达和蛋白质功能研究等领域发挥着重要作用。激发态质子转移（ESIPT）激发态质子转移作用机制（ESIPT）是在一种在特定波长激发下，处于荧光探针分子内部的质子将从供体基团转移至受体原子，这将导致互变异构体过程的发生。一般而言，面对具有ESIPT特性的荧光团，通常在其结构内会存在着一些氢键供体、氢键受体以及两者经由分子内氢键组合而成的环状结构，这种结构通常很稳定。在未作用之前，提供质子的识别体通常不具备质子供应能力，只有在与特定物质相互作用被激发之后，才能让被提供的质子顺利转移到受体上面，从而导致互变异构体的形成。这种转变通常会影响探针的π共轭体系以及电子云密度，导致其发生变化，进而导致其荧光特性发生改变。与电子转移相比较而言，激发态质子的转移速度会更快，从而有助于降低光化学发生反应的概率，进一步增强探针的光稳定性。通常情况下，ESIPT过程对分子内质子供体与受体之间的距离会有所要求，即该距离不能超过0.2纳米，并该过程常常伴随着较大的斯托克斯位移。1.3Hcy荧光探针的发展现状目前，Hcy特异性荧光探针的开发仍是硫醇荧光探针开发领域的重点和难点，虽然取得了一些成果，但在位点的普适性、生理水平的选择性以及反应的速率等方面仍然面临着很大的问题。图1.2NPO-Pyr探针与Hcy的反应机理ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23]Figure1.2ProposedmechanismofNPO-PyrfluorescenceprobewithHcyDokyoungKim课题组ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23]设计合成了一种基于二环庚二烯（NBD）荧光团和4-羟基-吡啶的配位加成反应的新型Hcy荧光探针（NPO-Pyr）。NPO-Pyr探针通过将4-羟基-吡啶部分掺入NBD荧光团骨架中，使掺入的吡啶部分可以与Hcy上的\o"从ScienceDirect的AI生成的主题页面了解有关硫醇基团的更多信息"硫醇基团配位（吡啶-硫醇配位），然后进行胺加成反应（12kJ/mol）。因为Hcy分子链较Cys（4.17Å）更长（量子化学优化结构中胺和硫醇基团之间为5.25Å），因此认为4-羟基-吡啶（5.01Å）对Hcy具有选择性，而且Hcy内的这种吡啶-硫醇配位可以降低胺加成和氧裂解的过渡态（TS）能级。基于此原理，NPO-Pyr对Hcy做出响应，并表现出高选择性和灵敏度（LOD：0.084ppm）以及快速响应时间（＜5分钟）的开启特性。但在利用NPO-Pyr探针针对Hcy进行早期胶质母细胞瘤（GBM）进行细胞形成预测时，发现该荧光探针存在波长较短，生物毒性较大的缺点。这些问题限制了在需要长时间、高浓度使用的生物医学领域场景中的应用。图1.3硝基香豆素荧光探针的结构及反应机理ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yin</Author><Year>2023</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013165">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yin,G.</author><author>Gan,Y.</author><author>Jiang,H.</author><author>Yu,T.</author><author>Liu,M.</author><author>Zhang,Y.</author><author>Li,H.</author><author>Yin,P.</author><author>Yao,S.</author></authors></contributors><auth-address>KeyLaboratoryofChemicalBiologyandTraditionalChineseMedicineResearch(MinistryofEducation),CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China.</auth-address><titles><title>GeneralStrategyforSpecificFluorescenceImagingofHomocysteineinLivingCellsandInVivo</title><secondary-title>AnalChem</secondary-title><alt-title>Analyticalchemistry</alt-title></titles><periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></alt-periodical><pages>8932-8938</pages><volume>95</volume><number>23</number><edition>2023/05/31</edition><keywords><keyword>Humans</keyword><keyword>*DiabetesMellitus,Type2</keyword><keyword>Cysteine/chemistry</keyword><keyword>HeLaCells</keyword><keyword>OpticalImaging</keyword><keyword>FluorescentDyes/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2023</year><pub-dates><date>Jun13</date></pub-dates></dates><isbn>0003-2700</isbn><accession-num>37256919</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/acs.analchem.3c00799</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[24]Figure1.3Structureandreactionmechanismoffluorescenceprobecontainingnitrogroup尹鹏课题组结合之前的工作ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[25,26]，针对高选择性的Hcy的检测，设计了一种构建含硝基荧光探针合成的通用策略ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yin</Author><Year>2023</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013165">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yin,G.</author><author>Gan,Y.</author><author>Jiang,H.</author><author>Yu,T.</author><author>Liu,M.</author><author>Zhang,Y.</author><author>Li,H.</author><author>Yin,P.</author><author>Yao,S.</author></authors></contributors><auth-address>KeyLaboratoryofChemicalBiologyandTraditionalChineseMedicineResearch(MinistryofEducation),CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China.</auth-address><titles><title>GeneralStrategyforSpecificFluorescenceImagingofHomocysteineinLivingCellsandInVivo</title><secondary-title>AnalChem</secondary-title><alt-title>Analyticalchemistry</alt-title></titles><periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></alt-periodical><pages>8932-8938</pages><volume>95</volume><number>23</number><edition>2023/05/31</edition><keywords><keyword>Humans</keyword><keyword>*DiabetesMellitus,Type2</keyword><keyword>Cysteine/chemistry</keyword><keyword>HeLaCells</keyword><keyword>OpticalImaging</keyword><keyword>FluorescentDyes/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2023</year><pub-dates><date>Jun13</date></pub-dates></dates><isbn>0003-2700</isbn><accession-num>37256919</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/acs.analchem.3c00799</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[24]。而且通过在7-二乙氨基香豆素荧光团的6位直接引入一个硝基结合双结合位点，开发了一系列荧光探针，能对Hcy具有荧光开启响应，具有良好的灵敏度、远红/近红外荧光发射和快速响应能力。还实现了活细胞和体内内源性Hcy动力学的荧光成像。这一技术为Ⅱ型糖尿病和阿尔茨海默病中内源性Hcy的增加提供了直接确凿的证据，极大地促进对Hcy代谢级联与Hcy相关疾病的根本原因之间的联系与发展。然而，尽管这些荧光探针在Hcy检测方面取得了显著成果，但其在生理选择性方面仍存在不足。这意味着这些探针在复杂生物样本中可能无法特异性地识别Hcy，容易受到其他物质的干扰。图1.4RH-2荧光探针的结构及反应机理ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27]Figure1.4StructureandreactionmechanismofRH-2fluorescenceprobe孟祥明课题组ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27]开发了一种基于咔唑骨架的新型双光子（TP）荧光探针（RH-2），该探针采用氢键辅助策略特异性检测Cys和GSH上的Hcy。RH-2能够在活细胞和组织中完成对Hcy的实时、特异性成像。目前，科研人员已经成功将其应用于动脉粥样硬化模型小鼠中Hcy异常水平的双光子可视化中，为更深入理解这一疾病的发病机制提供了有力支撑。RH-2因其具有的实时成像的能力，能够作为一种高效、方便的成像工具被科研人员使用，为进一步探索Hcy在动脉粥样硬化中的作用提供可能。然而，尽管RH-2探针在Hcy检测方面展现出了巨大的潜力，但其反应速率过慢的问题仍需解决。图1.5TCF-SBD与Hcy和Cys反应机理ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yang</Author><Year>2022</Year><RecNum>49</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[28]</style></DisplayText><record><rec-number>49</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013445">49</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yang,Linlin</author><author>Gu,Pengli</author><author>Li,Beining</author><author>Li,Junwan</author><author>Fu,Aoxiang</author><author>Gong,Xianyu</author><author>Huang,Yanmei</author><author>Xie,Lixia</author><author>Ji,Liguo</author><author>Ma,Nana</author><author>Li,Lili</author><author>He,Guangjie</author></authors></contributors><titles><title>Ahomocysteine-selectivefluorescentprobeforcellimagingbasedonsubstitution-rearrangementprocess</title><secondary-title>DyesandPigments</secondary-title></titles><periodical><full-title>DyesandPigments</full-title></periodical><volume>207</volume><section>110802</section><dates><year>2022</year></dates><isbn>01437208</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.dyepig.2022.110802</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[28]Figure1.5ProposedmechanismforthereactionofTCF-SBDwithHcyandCysYang等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yang</Author><Year>2022</Year><RecNum>49</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[28]</style></DisplayText><record><rec-number>49</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013445">49</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yang,Linlin</author><author>Gu,Pengli</author><author>Li,Beining</author><author>Li,Junwan</author><author>Fu,Aoxiang</author><author>Gong,Xianyu</author><author>Huang,Yanmei</author><author>Xie,Lixia</author><author>Ji,Liguo</author><author>Ma,Nana</author><author>Li,Lili</author><author>He,Guangjie</author></authors></contributors><titles><title>Ahomocysteine-selectivefluorescentprobeforcellimagingbasedonsubstitution-rearrangementprocess</title><secondary-title>DyesandPigments</secondary-title></titles><periodical><full-title>DyesandPigments</full-title></periodical><volume>207</volume><section>110802</section><dates><year>2022</year></dates><isbn>01437208</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.dyepig.2022.110802</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[28]团队构建了一种基于三环喃荧光团和SBD反应位点，利用取代重排原理构成了一种新型荧光探针TCF-SBD。该探针能在存在众多竞争分析物，如氨基酸、活性硫和ROS等存在的环境中呈现出对Hcy的高选择性，尤其在Cys/GSH存在的情况下，该探针依然能够准确识别Hcy，显示出优异的选择性。值得一提的是，TCF-SBD探针不仅具有高灵敏度，还在实际应用中能够实时、选择性地反映活细胞内Hcy的分布情况。目前，该探针已在不同活细胞的Hcy成像中得到了成功应用，为荧光探针在生物硫醇鉴别领域的研究提供了新的视角和工具。但是，尽管TCF-SBD探针在Hcy检测方面取得了显著成果，但仍对Cys及GSH表现出一定程度的响应。图1.6P-Hcy-1和P-Hcy-2的结构ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lee</Author><Year>2014</Year><RecNum>50</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[29]</style></DisplayText><record><rec-number>50</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013496">50</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lee,H.Y.</author><author>Choi,Y.P.</author><author>Kim,S.</author><author>Yoon,T.</author><author>Guo,Z.</author><author>Lee,S.</author><author>Swamy,K.M.</author><author>Kim,G.</author><author>Lee,J.Y.</author><author>Shin,I.</author><author>Yoon,J.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofChemistryandNanoScience,EwhaWomansUniversity,Seoul120-750,Korea.jyoon@ewha.ac.kr.</auth-address><titles><title>Selectivehomocysteineturn-onfluorescentprobesandtheirbioimagingapplications</title><secondary-title>ChemCommun(Camb)</secondary-title><alt-title>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></alt-periodical><pages>6967-9