中医药大学药理学实验手册

中医药大学药理学实验手册前言药理学实验是中医药理论与实践转化的核心纽带，旨在通过动物实验、体外模型、分子生物学技术等手段，探究中药（复方、单体）的药效学、药动学及作用机制，为中药新药研发、临床合理用药提供科学依据。本手册结合中医药特色，整合经典与现代药理学实验技术，突出“多成分、多靶点、整体调节”的研究特点，助力学生掌握实验设计、操作及数据分析能力，培养“理法方药”与“现代科学”融合的科研思维。第一章实验室安全与规范1.1实验室准入要求进入实验室需着实验服，长发束起，禁止穿拖鞋、短裤。首次实验前需参加安全培训，考核通过后方可独立操作。实验期间保持安静，禁止饮食、吸烟，避免试剂/样品污染。1.2试剂安全管理有毒试剂（如四氯化碳、链脲佐菌素）需双人双锁管理，使用时佩戴防毒面具、丁腈手套，在通风橱内操作。挥发性试剂（如乙醇、乙醚）远离明火，使用后及时密封，废液单独收集。中药提取物（如生物碱、苷类）需明确毒性（参考《中国药典》或文献），操作时避免皮肤直接接触，若不慎沾染需立即用肥皂水冲洗。1.3仪器操作安全生物信号采集系统：开机前检查电极连接，避免短路；实验后用蒸馏水冲洗换能器，干燥保存。离心机：样品需对称放置（重量差≤0.1g），转速/转子型号需匹配，启动前盖好盖子，结束后待转子停稳再开盖。水浴锅：加水至安全刻度（避免干烧），取放物品用镊子，防止烫伤；实验后排水、擦干，定期除垢。1.4应急处理烫伤：立即用冷水冲洗15分钟，轻度烫伤涂烫伤膏，重度者送医。化学灼伤：皮肤灼伤用对应中和液冲洗（酸灼伤→碳酸氢钠溶液，碱灼伤→硼酸溶液）；眼部灼伤用生理盐水冲洗15分钟后就医。动物咬伤：立即挤出污血，肥皂水冲洗，碘伏消毒，必要时注射疫苗（如狂犬病疫苗）。第二章常用实验仪器与操作2.1生物信号采集系统（以BL-420为例）原理：通过传感器采集动物（大鼠、家兔等）的电生理信号（心电、肌电）或机械信号（呼吸、肌张力），经放大、模数转换后实时显示、记录。操作步骤：1.连接传感器（如血压换能器、张力换能器）至对应通道，开机预热5分钟。2.软件中设置采样频率（心电→1kHz，血压→500Hz）、通道参数（增益、滤波）。3.固定动物，连接电极/传感器，观察信号波形，调整参数至清晰稳定。4.实验结束后，保存数据，关闭仪器，清理传感器（血压换能器需冲洗管路，晾干）。中药实验应用：观察“益气活血方”对心肌缺血大鼠的心电图影响，或“理气止痛方”对离体肠平滑肌张力的调节。2.2紫外-可见分光光度计（UV-2550）原理：基于物质对特定波长光的吸收特性，定量分析中药成分（如总黄酮、多糖）或酶活性（如SOD、MDA）。操作步骤：1.开机预热30分钟，设置测定波长（总黄酮→510nm，SOD→560nm）。2.以空白溶剂（如乙醇、蒸馏水）为参比，校准仪器（调零、调100%T）。3.测定样品：将样品溶液倒入比色皿（避免指纹污染），放入样品池，读取吸光度值。4.实验后，用蒸馏水冲洗比色皿，晾干；仪器关闭前再次调零，覆盖防尘罩。中药实验应用：测定不同提取工艺的“黄芪饮片”中总多糖含量，或“清热解毒方”干预后细胞培养液中NO的浓度。2.3低温高速离心机（H-1650R）原理：利用离心力分离样品中的固液组分（如血浆与血细胞）或不同密度组分（如中药提取物的沉淀）。操作步骤：1.平衡样品：将装有样品的离心管对称放置，重量差≤0.1g。2.设置参数：转速（如____rpm）、温度（如4℃，防止中药活性成分降解）、时间（如10min）。3.启动离心机，待转速稳定后离开；结束后待转子停稳，取出样品。4.维护：定期清理转子腔，检查转子是否有裂纹，离心管避免反复冻融。中药实验应用：分离大鼠血清以检测“丹参酮”代谢产物，或离心纯化“中药纳米粒”。第三章经典药理学实验项目3.1中药的镇痛作用实验（热板法+扭体法）3.1.1实验目的观察中药（如延胡索总碱、复方止痛方）对小鼠的镇痛效果，比较不同模型的敏感性，理解中药“活血止痛”“祛风止痛”的药效学基础。3.1.2实验原理热板法：小鼠足底接触高温（55℃±0.5℃）金属板，产生舔足、跳跃等痛反应，镇痛药可延长痛阈值（舔足潜伏期）。扭体法：醋酸刺激腹腔黏膜，小鼠产生扭体（腹部内凹、躯干扭转、后肢伸展）反应，镇痛药可减少扭体次数。3.1.3实验材料动物：ICR小鼠，体重18-22g，雌雄各半。试剂：中药提取物（如延胡索醇提物，浓度100mg/kg）、0.6%醋酸溶液、生理盐水。仪器：热板仪、电子秤、注射器、计时器。3.1.4实验方法1.热板法预筛选：将小鼠置于热板仪，记录舔足潜伏期（s），剔除潜伏期<5s或>30s的小鼠（避免个体差异）。2.分组给药：将合格小鼠随机分为3组（模型组、中药低剂量组、中药高剂量组），每组10只，分别腹腔注射生理盐水、中药低剂量（50mg/kg）、中药高剂量（100mg/kg）。3.热板法测定：给药后30min、60min、90min，再次测定舔足潜伏期（若超过60s，停止计时，避免烫伤），记录数据。4.扭体法验证：另取小鼠分组给药，30min后腹腔注射0.6%醋酸（0.2ml/只），记录15min内扭体次数。3.1.5注意事项热板仪需预热至稳定温度，每次实验后用酒精擦拭板面。扭体法中醋酸浓度需准确，注射部位避免损伤内脏。中药提取物需现配现用，避免沉淀或降解。3.1.6结果分析热板法：计算各组不同时间点的痛阈值（均值±标准差），采用重复测量方差分析比较组间差异。扭体法：统计扭体次数，采用t检验比较中药组与模型组的差异，结合“通则不痛”理论（如改善微循环、抑制炎症介质）分析机制。3.2中药的抗炎作用实验（二甲苯致小鼠耳肿胀法）3.2.1实验目的探究中药（如黄芩苷、清热抗炎方）对急性炎症的抑制作用，理解中药“清热解毒”“消肿散结”的药效学特点。3.2.2实验原理二甲苯刺激小鼠耳廓，引起毛细血管扩张、通透性增加，导致耳肿胀；抗炎药可减轻肿胀程度（以耳片重量差衡量炎症渗出）。3.2.3实验材料动物：昆明小鼠，体重20-24g，雄性。试剂：中药水煎液（如黄芩苷溶液，浓度200mg/kg）、二甲苯、生理盐水。仪器：电子天平、打孔器（直径8mm）、注射器、手术剪。3.2.4实验方法1.分组给药：小鼠随机分为3组（模型组、中药组、阳性对照组），每组10只，中药组灌胃给药（0.2ml/10g），模型组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃吲哚美辛（10mg/kg）。2.造模：给药后1h，将二甲苯（0.03ml/只）滴于小鼠右耳耳廓内外侧，左耳作为对照。3.取材：造模后1h，脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基部剪下双耳，用打孔器在同一位置打下耳片，称重（右耳片重-左耳片重为肿胀度）。3.2.5注意事项打孔器需垂直于耳廓，确保耳片厚度一致。二甲苯易燃，需远离明火，操作时戴手套。中药水煎液需过滤，避免颗粒堵塞注射器。3.2.6结果分析计算各组肿胀度（均值±标准差），采用单因素方差分析比较组间差异，结合中药化学成分（如黄酮类、皂苷类）分析抗炎机制（如抑制COX-2、减少PGE₂生成）。3.3中药对离体心脏的影响（Langendorff灌流法）3.3.1实验目的观察中药提取物（如人参皂苷、丹参酮）对大鼠离体心脏的心率、冠脉流量、心肌收缩力的影响，探究中药“益气活血”“强心通脉”的作用机制。3.3.2实验原理Langendorff灌流系统以氧合K-H液逆行灌注心脏，维持心肌细胞存活；通过生物信号采集系统记录心脏功能指标（心率、冠脉流量、心肌收缩力），中药灌流后观察指标变化。3.3.3实验材料动物：SD大鼠，体重____g，雄性。试剂：K-H液（NaCl118mmol/L、KCl4.7mmol/L等）、中药提取物（如人参皂苷Rg₁，浓度10μmol/L）、肝素钠。仪器：Langendorff灌流装置、恒温循环水浴、生物信号采集系统、手术器械。3.3.4实验方法1.心脏摘取：大鼠腹腔注射肝素钠（1000U/kg）抗凝，10min后断头处死，迅速开胸摘取心脏，置于4℃氧合K-H液中，剪去心房及大血管，保留主动脉根部。2.灌流装置连接：将主动脉套在灌流针上，固定，启动灌流（流速8-10ml/min，温度37℃±0.5℃），K-H液持续氧合（95%O₂+5%CO₂）。3.稳定与记录：心脏复跳后稳定30min，记录基础心率（HR）、左心室发展压（LVDP）（通过球囊测压）、冠脉流量（CF）（收集流出液体积）。4.中药干预：将中药提取物加入灌流液（终浓度10μmol/L），持续灌流30min，记录各指标变化。3.3.5注意事项心脏摘取需迅速（<30s），避免心肌缺血损伤。灌流液需现配现用，严格控制温度、氧合，定期更换。球囊充液量需适中，避免过度扩张损伤心肌。3.3.6结果分析绘制HR、LVDP、CF随时间变化的曲线，计算中药干预前后的百分比变化，采用配对t检验分析差异，结合“补气”“活血”理论，探讨其对心肌能量代谢、血管舒张的影响。第四章实验数据处理与报告撰写4.1数据记录与管理原始记录：实验过程中及时记录动物体重、给药量、实验时间、仪器参数、观察指标（如痛阈值、肿胀度、心率），使用实验记录本，字迹清晰，注明日期、实验者。数据整理：实验结束后，将原始数据录入Excel，检查异常值（如离群点需核实是否为操作失误），分组计算均值、标准差。4.2统计分析方法计量资料（如痛阈值、肿胀度）：正态分布采用t检验（两组比较）或方差分析（多组比较），非正态分布采用秩和检验。计数资料（如扭体次数、死亡率）：采用χ²检验。重复测量数据（如不同时间点的痛阈值）：采用重复测量方差分析。中药实验拓展：考虑中药多成分的协同作用，可结合主成分分析或网络药理学，关联实验数据探讨机制。4.3实验报告结构与要求4.3.1标题简明扼要，体现实验核心内容（如“延胡索总碱对小鼠镇痛作用的实验研究”）。4.3.2摘要简述实验目的、方法、主要结果、结论（200字左右）。4.3.3引言阐述实验背景（中药镇痛的研究现状）、目的（验证延胡索的镇痛作用，为临床应用提供依据），结合中医药理论（如“通则不痛”“治风先治血”）。4.3.4材料与方法材料：动物种属、体重、数量；试剂名称、浓度、来源；仪器型号、厂家。方法：详细描述实验步骤（如分组、给药、造模、检测），确保可重复。4.3.5结果文字描述：简明总结实验发现（如“中药高剂量组小鼠热板痛阈值显著延长，扭体次数显著减少”）。图表呈现：绘制柱状图（组间比较）、折线图（时间-效应关系），图表需标注清晰（标题、坐标轴、图例），附统计显著性标记（*P<0.05，**P<0.01）。4.3.6讨论分析结果：结合中医药理论（如延胡索“活血行气止痛”的功效与实验结果的关联），对比西药（如吗啡、吲哚美辛）的作用特点，探讨中药多靶点作用（如同时抑制中枢、外周痛觉传导）。存在问题：实验局限性（如样本量小、造模时间短），改进方向（如延长观察时间、增加给药途径）。4.3.7结论总结实验核心发现，明确中药的药效学特点及应用前景。4.3.8参考文献引用近5年的中英文文献，格式规范（如[1]张三,李四.中药镇痛的研究进展[J].中国中药杂志,2023,48(10):____.）。附录附录1常用试剂配制1.1生理盐水（0.9%NaCl）称取9gNaCl，溶于1L蒸馏水中，高压灭菌（121℃，20min），4℃保存。1.2K-H液（Krebs-Henseleit液）成分：NaCl118mmol/L、KCl4.7mmol/L、CaCl₂2.5mmol/L、MgSO₄·7H₂O1.2mmol/L、KH₂PO₄1.2mmol/L、NaHCO₃25mmol/L、葡萄糖11.1mmol/L。配制：依次溶解各成分于蒸馏水中，定容至1L，通