重组禽流感病毒H5、H7二价疫苗对雉鸡免疫效果的研究

目录摘要……………………4关键词…………………41前言…………………51.1课题研究的意义…………………51.2国内外的研究现状………………51.3雉鸡感染禽流感的基本情况………72实验材料与方法……………….………..72.1实验动物和疫苗的选择………………72.2主要的实验设备及试剂………………82.3实验方法与步骤………………………83实验的实施…………………….………..83.1血清采集与分离……………………83.2抗体检测……………93.3判断标准……………104实验结果与分析…………….…………104.1实验雉血清中H5AIV(Re-8)抗体检测结果………104.2实验雉血清中H7AIV(H7N9)抗体检测结果………114.3实验雉血清中H5和H7亚型抗体检测结果………135实验小结……………………..…………14参考文献…………………14致谢………………………15摘要：近年来国内不断出现禽流感病毒感染家禽的疫情，给国家和人民带来了严重的经济和安全损失。就在今年2月1日，经国家禽流感参考实验室确诊，湖南省邵阳市双清区养殖户发生H5N1亚型高致病性禽流感疫情。H5N1可通过飞沫经空气传播，或经消化道感染传播给人类。严重影响了当地的经济贸易和人民的生活，对公共卫生产生严重的威胁。禽流感病毒根据它的外膜血凝素和神经氨酸酶蛋白抗原的差别，可以分为16个H型和9个N型。目前能感染人的禽流感病毒有H5N1，H9N2，H7N3，H7N2，H7N7等。所以为了更好的防治和处理禽流感疫情，必须能够及时研发出对应的流感病毒疫苗。研发疫苗就必须要了解和评估重组禽流感病毒H5、H7二价疫苗的免疫效果，于是我们做了有关H5、H7疫苗对雉鸡的免疫实验。本论文关于重组禽流感病毒H5、H7二价疫苗对雉鸡的免疫效果的研究就有着重要的作用。关键词：重组H5、H7流感病毒；二价疫苗；雉鸡；免疫效果Abstract：Inrecentyears,therehasbeenanepidemicofavianinfluenzavirusinfectionindomesticpoultry,whichhasbroughtseriouseconomicandsecuritylossestothecountryandpeople.OnFebruary1thisyear,thenationalavianinfluenzareferencelaboratoryconfirmedthatH5N1subtypeofhighlypathogenicavianinfluenzahadoccurredinfarmersinShuangqingDistrict,ShaoyangCity,HunanProvince.H5N1canbetransmittedtohumansthroughairbornedropletsorthroughdigestivetractinfections.Ithasseriouslyaffectedthelocaleconomy,tradeandpeople'slife,andhasaseriousthreattopublichealth.Accordingtothedifferencesofhemagglutininandneuraminidaseproteinantigens,avianinfluenzaviruscanbedividedinto16hand9ntypes.Atpresent,thereareH5N1,H9N2,H7N3,H7N2,H7N7andsoonthatcaninfecthuman.Therefore,inordertobettercontrolanddealwiththeavianinfluenzaepidemic,wemustbeabletodevelopthecorrespondinginfluenzavirusvaccineintime.Todevelopthevaccine,wemustunderstandandevaluatetheimmuneeffectofthesecond-ordervaccineofH5andH7oftherecombinantavianinfluenzavirus.Inthispaper,itisveryimportanttostudytheimmuneeffectofH5andH7second-ordervaccines.Keywords:KeywordsrecombinantH5andH7influenzavirus;secondordervaccine;pheasants;immuneeffect1前言课题研究的意义在21世纪的今天，人类社会科技高速发展，世界卫生安全水平得到了显著提升，但是还是有很多人畜共患病威胁着人类健康，其中禽流感病毒对动物和人类健康就有着严重威胁。而H5和H7亚型禽流感病毒是造成经济损失和危害公共安全最为严重的两种病毒。从上个世纪伊始，人类就已经开始了针对禽流感病毒的研究和疫苗的开发和研制。1997年，在中国香港首次出现了人类感染H5N1病毒并且造成人员死亡的案例。并且在之后的几年中，H5N1亚型病毒以很快的速度传播到了整个东南亚地区。而后又蔓延到了欧洲、非洲、俄罗斯、印度和中东等地区。当人类感染上H5N1亚型禽流感病毒时，造成人类死亡的机率可高达50%，并且还会有存在大面积传播的可能性。研究人员经过对香港大流感和亚洲流感的研究发现，这两个流感的发生都是由当时流行的人类流感和禽类流感病毒的基因重配产生的。因此我们必须要重视人类流感和禽流感的共同预防，这是预防人类和禽类流感大规模爆发和传染的关键。2013年3月，H7N9亚型禽流感在我国爆发，并且迅速蔓延。虽然经过研究表明，H7N9病毒中的弱毒株对家禽没有感染性，但是H7N9病毒给我国畜牧业造成了严重的经济损失和生态灾难，并且还造成了人员的感染和死亡的案例。严重威胁着我们的生命和财产安全，公共卫生安全难以得到保障。在随后的几年中，经过相关机构的主动检测，H7N9部分病毒已经发生突变，对家禽具有很高的致病性，对家禽的养殖产生了更大的威胁。2017年3月，湖南省永州安东县出现H7N9禽流感疫情，造成了大规模的养鸡死亡。此次高致病性的疫情受到了前所未有的关注，因此必须要研究和开发商品化的疫苗，对禽流感病毒进行预防。疫苗是选择预防禽流感的重要而且比较有效的手段。本论文用重组禽流感病毒H5、H7二价疫苗对雉鸡的研究，旨在为禽流感病毒的疫苗的免疫效果提供参考。国内外的研究现状现如今，疫苗是针对禽流感防疫的重要方法，世界上各个国家都在努力研究开发一些疫苗来防疫人类和家禽受到禽流感病毒感染。在此之前，大多数的H5N1疫苗是灭活的油乳佐剂疫苗。刚开始的H5N1疫苗只能免疫少数的禽流感病毒，包括有：A/chicken/Hidalgo(Mexico)/94(H5N2)(Mex/94)、A/turkey/England/N28/73(H5N3)、A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)、A/duck/Novosibirsk/02/05(H5N1)和A/Chicken/Legok/(Indonesia)/03(H5N1)[1]。在2006年，科学家通过利用反向遗传技术成功开发了表达A/goose/Gunagdong/1/96血凝素和神经氨酸酶基因的重组病毒Re-1。到2008年之前，该型重组病毒Re-1一直是主要的疫苗种子株，出口到越南、埃及、印尼等国家。但是之后随着禽流感病毒的变异，Re-1已经不能满足需求,新型Re-5成为主要的疫苗种子株。2012年Re-6(HA和NA来自A/duck/Guangdong/S1322/2010)代替Re-5，成为主要疫苗种子株。在重组禽流感病毒方面还研究和开发了Re-4(HA和NA来自于A/Chicken/Shanxi/2/2006)、Re-7(HA和NA来自于A/Chicken/Liaoning/S4092/2011)。所有的这些重组疫苗都是用RP8病毒作为骨架。此前已有大量的H5N1重组病毒载体疫苗的报道，比起灭活疫苗，载体疫苗有几个突出的优势，包括：不需要佐剂、所需要的抗原少、对复制病毒具有较好的免疫反应、能大规模运用等优点。NDV载体疫苗，可通过饮水或孵化器喷雾进行大规模的免疫；NDV也可在组织和器官中复制，较少的抗原就可以提供很好的免疫力。我国和墨西哥使用NDV（LaSota)载体疫苗防疫H5N1。但是NDV载体疫苗免疫过程中，母源抗体将影响主动免疫的发展，这限制了NDV载体疫苗的大规模应用。针对人类感染的禽流感病毒方面，已经研发和使用了流感减毒活疫苗（LAV）。减毒疫苗可在人体相关组织中复制，以此产生更好的免疫效果，其中包括可以诱导针对流感的细胞免疫，所以减毒疫苗能够大规模的应用。鸡在2周龄时免疫或者在鸡胚内18天接种，H5N1病毒攻击后都可以获得免疫，并且实验表明鸡胚内接种的免疫效果更好。在继灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程疫苗后，DNA疫苗现已成为第三代疫苗[4]。DNA疫苗具有免疫力持久、构建容易、可以诱导机体产生体液和细胞免疫，即克服了灭活疫苗和普通的疫苗缺点的同时，也避免了重组疫苗的免疫反应受到循环抗体、细胞免疫记忆、机体抗原的干扰和突变的风险等诸多明显的优势。此外，接种DNA疫苗的机体在免疫后迅速启动全面有效的免疫反应。但是DNA疫苗很容易被机体本身的核酸酶降解，导致疫苗的利用率降低，出现给药量大、蛋白表达水平低的缺点。目前抗原运用可降解的纳米生物材料作为疫苗抗原的运送载体，保护其完成运送，避免机体内的核酸酶降解，提高机体的免疫效果，实现疫苗抗原缓释和诱导粘膜免疫的策略受到了国内外的广发关注。因此DNA疫苗也具有更好的商业应用前景，并且该型疫苗还被广泛应用与相关疫苗模型的研究中。雉鸡感染禽流感的基本情况病因分析雉鸡感染禽流感的途径有很多，但是病因几乎都是由禽流感病毒引起，几乎所有的禽类都能成为禽流感的传染源。病禽于其排泄物、分泌物都是主要的传染源，而候鸟、水禽等都是主要的潜在传播者。禽流感病毒可以通过饲料、饮水、空气、周围环境等介质经消化道、呼吸道、粘膜感染雉鸡，也可经过蛋直接感染。病理变化及主要症状病鸡通常表现出精神状态差，体温升高，羽毛粗乱，蓬松炸毛，不愿走动，聚堆蜷缩。若病情继续恶化，则会出现食欲减少甚至绝食拒水，腹泻，拉水样稀粪或白绿色稀粪便。产蛋量下降，雉鸡的腿上和爪子会出现出血变色的情况[2]。还会出现流泪，脸颊肿胀，鸡冠紫黑色。部分雉鸡还会出现呼吸困难，鼻子有分泌物，较严重的会有尖叫声，打喷嚏，张嘴呼吸等。并伴随神经症状，麻痹抽搐，共济失调，偏头扭颈，失明等。雉鸡禽流感的诊断及防治措施可通过对雉鸡临床症状和解剖结果，比如胸肌心内外膜、胸膜、脂肪出现血点，腺胃黏膜、口腔、十二指肠出血等症状，即可做出诊断[3]。目前，还没有通用有效的药物或者疫苗，仅单阶和二价疫苗提供实验试用，而且使用必须谨慎。所以只有全面实施综合性的防治才是预防和控制禽流感的关键。主要的防治措施有：1减少避免雉鸡与其他禽类接触，不能从禽流感感染区采购雉鸡，防止病毒传播。2使用典力杀、菌毒杀和强力消毒灵对雉鸡和鸡舍进行消毒灭菌。3若出现疑似禽流感病例，应当立即将病例送到当地检测，以便快速确诊。4接种灭活油乳剂疫苗，注射禽流感高免蛋黄抗体。5使用“禽泰克”给雉鸡预防或早期的治疗。6适量使用抗应激、抗应激药物。2实验材料与方法2.1实验动物和疫苗的选择2.1.1疫苗重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1Re-8株和H7N9Re-1株），肇庆大华农生物药品有限公司生产，批号01721177，取自长沙市疫苗储备库。2.1.2实验动物浏阳市淳口镇某生态养殖场，禽流感病原学阴性未免疫禽流感疫苗的50日龄人工饲养雉鸡35羽。2.1.3血清经翅静脉采血后立即分离血清，血清样品每份不少于1.5ml，血清样品统一采用2ml离心管盛装。每份样品贴好标签，放置于事先准备好的含有冰块的保温箱内。2.2主要的实验设备及试剂2.2.1主要试剂禽流感病毒H5、H7亚型血凝抑制试验抗原与阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，禽流感病毒H5、H7亚型荧光RT-PCR检测试剂盒(双通道、单通道，试剂批号)购自中山大学达安基因股份有限公司。2.2.2主要仪器各种量程移液器德国Eppendorf公司多功能台式离心机5804R型德国Eppendorf公司医用冷冻冷藏冰箱YCD-DL259型中科美菱低温科技有限责任公司冰箱LC-158青岛海尔特种点冰箱电子d平TXB2201L岛津混匀器MS2IKAWorksGuang超纯水处理系统Mo1gene1821a摩尔公司其他耗材包括手套、口罩、量筒、烧杯、离心管、移液器枪头、签字笔、马克笔、封口袋、PBS缓冲液等均为国产。2.3试验方法与步骤选取禽流感病原学阴性未免疫禽流感疫苗的50日龄雉35羽，设置免疫组和对照组，免疫组25羽、对照组10羽，用脚环进行区分。参照农业部推荐免疫程序，并结合本次试验实际情况，对免疫组雉同时进行1头份（0.3mL）免疫，首次免疫21d后进行二次加强免疫，剂量为1头份（0.3mL）；对照组动物不免疫。在首次免疫后7d，每日都要对动物的状况观察记录，分别采集免疫前、首次免疫后14d、21d、28d、35d、49d、77d、105d、133d、161d、189d免疫组动物20羽（随机采集）、对照组动物10羽（全部采集）的血液样品。每份血液样品不少于1.5ml，离心取血清备用。3实验的实施3.1血清采集与分离翅静脉采血：采血需两人完成，一人负责保定，将采血部位适当拔毛，采血者左手食指和无名指夹住翅膀，中指处于翅膀中间，用大拇指和食指拨开干扰采血动作的羽毛，用碘酒擦拭血管部位（禽类血管较细，等找到确切位置再下针）。右手持注射器成20度角刺破皮肤，当出现血液回流现象时，平缓进针用手抵住注射器固定位置，匀速缓速抽血4ml左右，将针头拔出，将干棉花压在采血部位1min左右，注射器适当吸取空气，将血清上下颠倒3-5次，将血清放入离心管中。将装有血清的离心管放置于事先准备好的带有冰袋的保温箱内，适当放置一段时间后，将离心管置与离心机中，3000r/min离心三分钟，将离心后的血清转移至新的离心管中以备后用。3.2抗体检测11%红细胞悬液①PBS液配置将PBS结晶样品加入蒸馏水充分溶解，将配好的PBS缓冲液封瓶高压灭菌20min，放置于-4℃冰箱保存，已被后用。②1%鸡红细胞悬液将采集好的鸡血液放置于10ml离心管内，再加入一杯体积的PBS液，轻轻颠倒混合避免红细胞破裂，然后用0.01lmol/L的无菌PBS进行洗涤，放置于离心机中以1000r/min离心12min，洗涤3次，弃去上清液之后再空离一次。洗涤工作完成后，用微量移液器将红细胞表层上的白膜吸走并弃去，最后用PBS将洗好的红细胞定容成1%红细胞悬液，安全存放于4℃冰箱。2血凝（HA）试验①取出干净血凝板，在血凝板每空中加入25ulPBS；②取出冻融好的病毒抗原液，在血凝板第一列每空加入25ul，充分混匀；③从第一孔中吸取25ul，加入第二孔中（注意不要产生气泡），一次倍比稀释到第11孔，吸取25ul液体弃去；④每孔加入25ulPBS；⑤取出制备好的红细胞悬液，将粘在瓶底部的红细胞摇起，混匀之后，血凝板中每孔加入25ul；⑥混匀之后，在18℃~25℃条件下静置40min。⑦结果判定:第12孔为对照孔底若出现明显的纽扣状，说明此次试验1%鸡红细胞悬液浓度适宜配置成功，试验成立;将血凝板稍微倾起，观察红细胞的流淌状态，；完全凝集是不流淌的状态，完全凝集的病毒抗原最高稀释倍数表示1个血凝单位(HAV)。3抗原回滴抗原回滴又称抗原矫正试验，具体操作步骤如下：①在两排孔中均加入25ulPBS；②取出干净血凝板，在第1列孔和第2列孔中加入25ul抗原稀释液；③在第2列孔将抗原混匀好，取出25ul放入第3列孔中，依次倍比稀释至第4孔，吸取25ul弃去；④第2、3、4列孔中加入PBS25ul；⑤将1%鸡红细胞悬液底部的红细胞轻轻摇起，在两排孔中均加25ul，用震荡仪混匀，18℃~25℃室温条件下静置30min。⑥若1单位抗原出现100%凝集，表明4单位抗原配制准确；根据经验1单位原85%以上凝集，同时1/2单位抗原流下来，不流到底边，也可算作准确。4血凝抑制（HI）试验①在血凝板上第1到11列孔加25ulPBS，最后一列孔加50ulPBS;②取出试验血清回温至室温，试验血清分别加入到第1列孔中，采用震荡仪混匀之后，用微量移液器吸取25ul血清放置于第2列孔，依次倍比稀释至第10列孔，最后弃去25ul液体;③第1列孔到第11列孔加入配置好的抗原，在室温条件下静置30min；④将配置好的1%红细胞悬液轻轻混匀，确保底部的红细胞悬浮于液体中，18℃~25℃室温下静置35~40min;⑤结果判定:以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。血清抗体HI价小于4log2，判定为阴性(免疫不合格);HI价大于等于4log2为，判定为阳性(免疫合格)。3.3判断标准应用HA-HI[76]试验检测血清中的H5AIV（Re-8）、H7AIV（H7N9）抗体，结果依据《2018年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》（农医发[2018]17号）判断标准进行判断，即抗体效价≥4log2判定为抗体合格，抗体合格的样品数占同组样品总数的比率为合格率，合格率≥70%为群体免疫合格。4实验结果与分析4.1试验雉血清中H5AIV(Re-8)抗体检测结果H5亚型HI抗体效价检测结果见表2-1，免疫合格率见表2-2和图2-1，变异系数统计结果见表2-3。表2-1H5AIV（Re-8）抗体效价检测结果Table2-1AntibodytitertestresultsofH5AIV(Re-8)组别Group免疫后d数timeafterimmunization(day)0d14d21d28d35d49d77d105d133d161d189d免疫组0.07±1.087.8±2.407.09±1.97.55±1.58.04±1.56.3±0.874.81±1.23.9±1.593.76±0.83.61±09空白0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0表2-2H5AIV（Re-8）抗体合格率结果Table2-2AntibodyyieldresultofH5AIV(Re-8)组别Group免疫后d数timeafterimmunization(day)0d14d21d28d35d49d77d105d133d161d189d免疫组0.0%100%92.30%95.40%100%100%100%81.80%57.89%57.1%61.9%空白0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%.图2-1H5AIV（Re-8）抗体合格率Figure2-1AntibodypassrateofH5AIV(Re-8)注：抗体合格率为抗体效价≥4log2的样品数与样品总数的比率。Note：Qualifiedrateofantibodyistheratioofnumberofsamplesandsamplesforantibodytitergreaterthanorequalto4log2.表2-3H5AIV（Re-8）抗体效价变异系数Table2-3CoefficientofvariationofH5AIV(Re-8)antibodytiter组别免疫后d数timeafterimmunization(day)平均值generalaverageGroup0d14d21d28d35d49d77d105d133d161d189d免疫组0.00.150.310.270.190.180.140.250.410.200.250.26空白0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.04.2试验雉血清中H7AIV(H7N9)抗体检测结果免疫前后血清H7AIV(Re-1)HI抗体效价检测结果见表2-4，合格率结果见表2-5和图2-2，变异系数统计结果见表2-6。结果显示，表2-4H7AIV（Re-1）抗体效价检测结果Table2-4AntibodytitertestresultsofH7AIV(Re-1)组别Group免疫后d数timeafterimmunization(day)0d14d21d28d35d49d77d105d133d161d189d免疫组0.07.07±1.97.8±2.407.72±1.38.45±1.89.20±1.68.13±1.05.04±1.35.31±1.75.19±1.05.66±1.2空白0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0表2-5H7AIV（Re-1）抗体合格率结果Table2-5AntibodyyieldresultofH7AIV(Re-1)组别Group免疫后d数timeafterimmunization(day)0d14d21d28d35d49d77d105d133d161d189d免疫组0.0%96.40%93.30%95.40%100%100%100%95.40%94.73%95.2%100%空白0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%0.0%图2-2H7AIV（Re-1）抗体合格率Figure2-2AntibodypassrateofH7AIV(Re-1)表2-6H7AIV（Re-1）抗体效价变异系数Table2-6CoefficientofvariationofH7AIV(Re-1)antibodytiter组别免疫后d数timeafterimmunization(day)平均值generalaverageGroup0d14d21d28d35d49d77d105d133d161d189d免疫组0.00.270.380.120.270.33空白0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.04.3实验雉血清中H5和H7亚型抗体检测结果免疫前后血清H5AIV(Re-8)与H7AIV(Re-1)HI抗体效价检测结果见图2-3。图2-3H5亚型与H7亚型抗体效价曲线图Figure2-3AntibodytiterofH5subtypeandH7subtype从试验结果来看，试验疫苗免疫雉后，两种亚型的抗体消长规律都是先升后降的趋势，均在试验开始后49d达到顶峰，同一时间点的H7亚型抗体效价要高于H5亚型。5实验小结为了抑制H5和H7病毒在雉鸡以及家禽中的传播，禽流感疫苗起到了至关重要的作用。根据本次实验结果，重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1Re-8株和H7N9Re-1株）能够在雉鸡群产生较好的免疫效果，抗体水平较高，能够达到农业部的免疫规范水平。由于随机抽取浏阳市淳口镇某生态养殖场雉鸡，抽样采血随机进行的，有可能因为雉鸡个体的差异以及其他的原因造成实验的误差，故此次实验数据只做为实验评估数据。该种方法是基层的工作中常用的免疫评估方法，通过本次实验也可以得出该种免疫评估方法对于基层工作有一定的科学性和可行性，在一定程度上可以实现基层免疫效果评价的要求。参考文献[1]高鹏,杨起贺,杨浩,荣富龙,李叔伟.冬季禽流感的防控[J].兽医导刊,2020(07):19.[2]陈晓涵,吴姣姣,潘舒心,刘艳晶,施建忠,邓国华,包红梅,陈化兰,曾显营,田国彬.2株H7N9亚型重组禽流感病毒的生物学特性和免疫原性研究[J/OL].中国预防兽医学报:1-6[2020-05-02]./kcms/detail/23.1417.S.20200412.1935.002.html.[3]田亚娜,刘广喜,谢梅,李建强,张培训.跨省调运活禽H7N9亚型流感抗体监测与分析[J].今日畜牧兽医,2020,36(03):9-10.[4]钱景富,贺永明,杨柏松,王晶,王雅华.抗新城疫-禽流感二联卵黄抗体冻干粉剂的制备及应用[J].辽宁农业职业技术学院学报,2020,22(02):1-3.[5]杨锦昌.鸡禽流感流行特点与防治措施[J].当代畜禽养殖业,2020(02):40-41.[6]张熙艳.禽流感的流行特点及防控对策[J].畜牧兽医科技信息,2020(01):158.[7]龙李.肉鸡致病性禽流感防治[J].畜牧兽医科学(电子版),2020(01):134-135.[8]肖拉拉,杨立强,王燚,陈肖潇,苏芹松.重组禽流感H5+H7二价灭活疫苗的免疫效果评估与分析[J].贵州畜牧兽医,2019,43(06):9-10.[9]石伟,孙英伟,王璐璐,孙海波,姚文清.人感染H7N9禽流感的流行和生物学研究进展[J].上海预防医学,2019,31(12):999-1005.[10]杨文明.禽流感疫苗免疫效力降低的因素分析[J].畜牧兽医科技信息,2019(11):152.[11]PuchengChen,LeileiDing,YongpingJiang.新型水禽用禽流感载体疫苗可有效阻断H5亚型禽流感病毒的复制和扩散[J].中国预防兽医学报,2019,41(11):1190.[12]张雪花,陆吉虎,华涛,卢宇,侯继波,梅梅.通用型H5亚型禽流感病毒亚单位疫苗抗原表达和免疫效力研究[J].病毒学报,2019,35(06):864-872.[13]周赛赛,贡嘎,钱雯娴,王一飞,索朗斯珠.禽流感病毒疫苗研究进展[J].甘肃畜牧兽医,2019,49(10):17-22.[14]何世成,王昌建,翟旺,唐小明,林源,鲁杏华,王卫国,彭志.重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5+H7）对鸸鹋免疫效果的研究[J].中国家禽,2019,41(20):66-68.[15]张济培,曹梦蕊,张溢珊,李荣旭,刘佑明,刘敏芳,陈济铛,陈建红.H7N9亚型禽流感油乳灭活疫苗诱导鸡鸭鹅产生