DB35∕T 1993-2021 果蔗脱毒种苗质量与技术

ICS65.020

CCSB33

35

福建省地方标准

DB35/T1993—2021

果蔗脱毒种苗质量与技术

Qualityandtechnicalrequirementsforpathogen-freeplantofchewingcane

2021-08-17发布2021-11-17实施

福建省市场监督管理局发布

DB35/T1993—2021

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4种苗脱毒与繁殖.....................................................................2

5质量要求...........................................................................2

6有害生物检测对象...................................................................4

7检测方法...........................................................................5

8抽样...............................................................................9

9包装、标签、存储及运输.............................................................9

I

DB35/T1993—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由福建省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心、农业农村部甘蔗及制品质量监督检验

测试中心、福建省标准化研究院。

本文件主要起草人：高三基、傅华英、黄美婷、郑海梅、黄国强、王锦达、张慧丽、邓祖湖。

II

DB35/T1993—2021

果蔗脱毒种苗质量与技术

1范围

本文件规定了果蔗种苗脱毒与繁殖、质量要求、有害生物检测对象、检测方法、抽样和包装、标签、

存储及运输。

本文件适用于福建省内果蔗脱毒种苗的繁殖与质量检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

NY/T1488农作物种质资源鉴定技术规程甘蔗

NY/T1796甘蔗种苗

NY/T2724甘蔗脱毒种苗生产技术规程

NY/T3172甘蔗种苗脱毒技术规范

NY/T3754甘蔗品种真实性鉴定SSR分子标记法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

瓶苗bottleplantlet

将果蔗茎尖和腋芽的顶端分生组织作为外植体，在无菌操作条件下接种于无菌培养基上，并在一定

的光照和温度条件下进行培养，经过丛芽增殖和壮苗继代培养、诱导生根等过程，最终发育成根、茎、

叶俱全的果蔗植株种苗。

3.2

穴盘苗plugplantlet

将瓶苗假植于装有营养土的塑料穴盘或育苗袋中，并置于具有防虫网（适宜目数为40～60目）隔离

条件下的温室或网室内，经过水肥精细管理，培育成可供大田定植的果蔗植株种苗。

3.3

种茎seedcane

果蔗顶端生长点以下带有健康、可萌发芽的蔗茎或蔗茎段，可作为大田生产种植用的果蔗种苗（简

称蔗种）。

3.4

遗传变异株abnormalplantlet

在组织培养过程中果蔗植株的遗传特性发生了改变，其形态或DNA指纹图谱表现出有别于原品种特

征的植株。

1

DB35/T1993—2021

3.5

目标有害生物targetedpests

为害果蔗种苗的目标病原（病毒和细菌）、病原真菌和昆虫。

4种苗脱毒与繁殖

4.1无目标病原苗的获得

4.1.1茎尖培养脱毒苗

按照NY/T2724和NY/T3172的规定，经茎尖培养方法获得无目标病原的瓶苗、无琼脂苗和穴盘苗等。

4.1.2腋芽培养脱毒苗

蔗茎取回并清洗后，在52℃热水处理30min（内含25%多菌灵可湿性粉剂400倍液），然后在38℃～

42℃温度下催芽6d～10d后，取腋芽的茎尖培养、繁殖成苗。

4.1.3无毒苗圃组培苗

采用经检测不携带目标病原的种苗，在隔离网室的环境下长成的植株。

4.2脱毒种苗繁殖与管理

4.2.1繁殖基地选择

原种、基础种繁殖基地选择排灌方便、水旱轮作、自然隔离条件较好的基地。生产用种繁殖选择在

有一定灌溉条件和隔离条件的繁育基地。

4.2.2田间病原控制

无目标病原的脱毒种苗在6～9个月生长期间做好病虫害防治。在果蔗生长各生育期和采收前进行田

间巡查，发现有目标病原和其它病原侵染的病株及时清除。

5质量要求

5.1整体要求

种苗植株健壮、完整，叶色正常、根系发达，无污染、无病虫为害，无遗传变异。

5.2脱毒瓶苗

按照NY/T1796和NY/T2724的规定，要求根系有分叉，有主根及侧根，叶色浅绿，生长正常，无遗

传变异，无污染。脱毒瓶苗质量分为一级、二级两个等级，见表1。

表1果蔗脱毒瓶苗等级划分

项目指标

等级一级二级

假茎有（+）有（+）

2

DB35/T1993—2021

表1果蔗脱毒瓶苗等级划分（续）

项目指标

完全展开叶

≥4≥3，＜4

片

株高

≥5.0≥3.5，＜5.0

cm

1.0cm以上白色根

≥4≥2，＜4

条

目标病原检出率

不得检出不得检出

%

遗传变异率

不得检出不得检出

%

5.3脱毒穴盘苗

按照NY/T1796和NY/T2724的规定，要求植株健壮，叶色正常，根系生长良好，无病虫为害，无遗

传变异株。脱毒穴盘苗质量分为一级、二级两个等级，见表2。

表2果蔗脱毒穴盘苗等级划分

项目指标

等级一级二级

新出叶

≥6≥4，＜6

片

假茎株高

≥12.0≥8.0，＜12.0

cm

假茎茎粗

≥0.3≥0.2，＜0.3

cm

3.0cm以上白色根

≥4≥2，＜4

条

目标病原检出率

不得检出不得检出

%

遗传变异率

不得检出不得检出

%

5.4脱毒种茎

按照NY/T1796的规定，要求蔗茎新鲜、蔗芽饱满、蔗茎节上根点无萌发，大田种植后无遗传变异

株。脱毒种茎质量分为一级、二级两个等级，见表3。

3

DB35/T1993—2021

表3果蔗脱毒种茎等级划分

项目指标

等级一级二级

品种纯度

100100

%

夹杂物率

≤1.0≤1.0

%

种茎茎径

≥2.5≥2.0，＜2.5

cm

含水量

70～8070～80

%

发芽率

≥80.0≥75.0，＜80.0

%

螟害节率

≤1.0＞1.0，≤3.0

%

目标病原检出率

≤1.0＞1.0，≤3.0

%

其他主要病害发病株率

≤3.0＞3.0，≤5.0

%

注：其他主要病害指为害果蔗的黑穗病和梢腐病。

5.5不合格种苗处理

脱毒瓶苗、穴盘苗目标病原检测不合格的，脱毒瓶苗经121℃、101kPa高压灭菌20min～30min

后再废弃；穴盘苗采用焚烧或填埋方式处理。

6有害生物检测对象

6.1病毒

本文件检测病毒包括甘蔗花叶病毒（sugarcanemosaicvirus，SCMV）、高粱花叶病毒（sorghum

mosaicvirus，SrMV）、甘蔗条纹花叶病毒（sugarcanestreakmosaicvirus，SCSMV）和甘蔗黄叶病

毒（sugarcaneyellowleafvirus，SCYLV）。

6.2细菌

本文件检测细菌包括甘蔗宿根矮化病菌（Leifsoniaxylisubsp.Xyli，Lxx）和甘蔗白条病菌

（Xanthomonasalbilineans，Xa）。

6.3真菌

本文件诊断的真菌性病害包括由黑穗病菌（Sporisoriumscitamineum）引起的黑穗病和由梢腐病

菌（Fusariumspp.）引起的梢腐病。

4

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6.4昆虫

本文件鉴定的昆虫包括二点螟（ChiloinfuscatellusSnellen）、条螟（Chilosacchariphagus

Bojer）、黄螟（ArgyroploceschistaceanaSnellen）、红尾白螟（TryporyzaintactaSnellen）、

大螟（SesamiainferensWalker）、台湾稻螟（ChiloauriciliusDudgeno）等为害果蔗茎部的钻蛀

性害虫。

7检测方法

7.1形态指标测定

7.1.1瓶苗株高

用标尺测量脱毒瓶苗根基位置至最新完整展开叶肥厚带处，结果以平均值表示，精确到0.1cm。

7.1.2瓶苗白色根长

用标尺测量脱毒瓶苗白色根的长度，记录大于或等于1.0cm长的白色根条数。

7.1.3瓶苗完全展开叶片数

目测并统计脱毒瓶苗植株完全展开的叶片数。

7.1.4穴盘苗新出叶片数

目测并统计瓶苗移栽假植到穴盘期间新长出的完全展开绿叶数。

7.1.5穴盘苗假茎茎粗

用游标卡尺测量植株假茎中部直径，结果以平均值表示，精确到0.1cm。

7.1.6穴盘苗假茎株高

用标尺测量植株根基位置至最新完整展开叶肥厚带处，结果以平均值表示，精确到0.1cm。

7.1.7穴盘苗白色根长

用标尺测量植株白色根的长度，记录大于或等于3.0cm长的白色根条数。

7.1.8种茎品种纯度

按照NY/T1488的规定，观察果蔗茎形、节间形状、根点排列、芽形状、芽位、芽沟、叶鞘被（57

号）毛群、内外叶耳形状等品种植物学特征特性，依公式（1）计算品种纯度。

VP=N1/N0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（1）

式中：

VP——种茎品种纯度，%；

N1——正确无误的种茎数；

N0——种茎总数。

7.1.9种茎含水量

种茎切断后劈成4份，于105℃烘箱内烘干至恒重，依公式（2）计算含水量。

5

DB35/T1993—2021

W=(M0-M1)/M0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（2）

式中：

W——种茎含水量，%；

M0——烘干前重量，单位为克（g）；

M1——烘干后重量，单位为克（g）。

7.1.10种茎发芽率

脱毒种茎通过沙培，在28℃～30℃条件下催芽，依公式（3）计算发芽率。

B=B1/B0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（3）

式中：

B——种茎发芽率，%；

B1——萌芽数，单位为个；

B0——总芽数，单位为个。

7.1.11种茎茎径

用游标卡尺测量脱毒植株中部蔗茎节间的直径，结果以平均值表示，精确到0.1cm。

7.1.12种茎夹杂物率

随机采集以20～25根为一捆的脱毒种茎，称重后，依公式（4）计算夹杂物率。

T=W1/W0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（4）

式中：

T——种茎夹杂物率，%；

W1——夹杂物重量，单位为克（g）；

W0——种茎重量，单位为克（g）。

7.2病原物检测

7.2.1检测目标病原种类

本文件检测的目标病原包括甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗条纹花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、甘

蔗宿根矮化病菌和甘蔗白条病菌，依公式（5）计算目标病原检出率。

P=P1/P0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（5）

式中：

P——目标病原检出率，%；

P1——检测出病毒或病菌的株数，单位为株；

P0——总检测株数，单位为株。

7.2.2病原检测方法

7.2.2.1核酸提取

样品叶片总核糖核酸（RNA）、总脱氧核糖核酸（DNA）提取分别采用异硫氰酸胍/酚法（Trizol法）

和十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide，简称CTAB）法。

6

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7.2.2.2RNA病毒互补脱氧核糖核酸链（cDNA）合成

cDNA合成反应体系和程序参照常规实验方法或试剂盒说明书完成。

7.2.2.3检测引物

目标病原的聚合酶链式反应（PCR）检测引物序列见表4。

表4果蔗脱毒种苗病原检测引物序列

引物序列目的条带大小

病原名称

5'→3'bp

SCMV-F4:GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC

SCMV900

SCMV-R3:AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC

SrMV-F:ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC

SrMV850

SrMV-R:CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC

SCSMV-CPF2:TCATMTCTTCATCRGCCGC

SCSMV572

SCSMV-CPR2:ATCTTCYCTACGCAGGTCCG

YLS111:TCTCACTTTCACGGTTGACG

SCYLV352

YLS462:GTCTCCATTCCCTTTGTACAGC

Lxx-F1:CCGAAGTGAGCAGATTGACCAATGAT

Lxx439

Lxx-R1:ACCCTGTGTTGTTTTCAACGCAGAG

XAF1:CCTGGTGATGACGCTGGGTT

Xa608

XAR1:CGATCAGCGATGCACGCAGT

注：M=A/C，R=A/G，W=T/A，Y=C/T。

7.2.2.4PCR反应

PCR反应体系参数见表5，反应总体为25µL。PCR反应程序参数见表6，实验操作参照常规实验方法

或试剂盒说明书完成。反应设置阳性对照、阴性对照和空白对照，空白对照为用无菌水替代样品模板进

行PCR扩增反应。

表5果蔗脱毒种苗病原检测PCR反应体系

单位：微升（µL）

脱氧核糖核苷三磷

上游引物下游引物TaqDNA聚合酶

病原名称10×PCR缓冲液酸混合液（dNTPs）样品模板无菌水

10µmol/L10µmol/L5U/µL

2.5mmol/L

SCMV2.52.51.01.00.1251.016.875

SrMV2.52.51.01.00.1251.016.875

SCSMV2.52.51.01.00.1251.016.875

SCYLV2.52.51.01.00.1251.016.875

Lxx2.52.01.01.00.2501.017.250

Xa2.52.51.01.00.1251.016.875

7

DB35/T1993—2021

表6果蔗脱毒种苗病原检测PCR反应程序

病原名称PCR反应程序

SCMV94℃预热2min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，35次扩增循环；再72℃延伸10min

SrMV94℃预热2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35次扩增循环；再72℃延伸10min

SCSMV94℃预热2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35次扩增循环；再72℃延伸10min

SCYLV94℃预热2min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35次扩增循环；再72℃延伸10min

Lxx94℃预热3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，35次扩增循环；再72℃延伸10min

Xa94℃预热1min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸30s，35次扩增循环；再72℃延伸5min

7.3真菌性病害调查

根据典型病害症状对甘蔗黑穗病和甘蔗梢腐病进行鉴定，依公式（6）计算病害发病株率。

D=D1/D0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（6）

式中：

D——病害发病株率，%；

D1——发生病害株数，单位为株；

D0——总调查株数，单位为株。

7.4螟害节率调查

在果蔗生长中后期螟虫幼虫入侵蔗茎，造成螟害节，依公式（7）计算螟害节率。

S=S1/S0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（7）

式中：

S——螟害节率，%；

S1——种茎螟害节数，单位为节；

S0——种茎总节数，单位为节。

7.5遗传变异率检测

7.5.1检测引物及检测方法

按照NY/T3754中规定的检测引物和检测方法检测果蔗脱毒种苗遗传变异率。

7.5.2结果判定

通过扩增条带数量及其分子量大小计算等位基因频率，若供检样品和标准样品出现相同的指纹图谱，

则判定为无遗传变异；否则，判定为有遗传变异。依公式（8）计算遗传变异率。

G=G1/G0×100%⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（8）

式中：

G—