DB43-T 2816-2023 鱼类粘孢子虫检测方法

ICS65.020.30CCSB4443DetectionmethodsoffishmyxosporeanIDB43/T2816—2023前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14试剂与材料 15仪器与设备 16采样 27检查步骤 28结果判定 3附录A（规范性）试剂及其配制 4附录B（资料性）不同粘孢子虫感染症状及包囊形态 5附录C（资料性）几种常见粘孢子虫成熟孢子形态 6DB43/T2816—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南农业大学、湖南应用技术学院、资兴市水产良种场、中国科学院水生生物研本文件主要起草人：刘新华、任诗思、皮杰、李德亮、向建国、余建波、吕欣荣、刘志辉、叶少文。DB43/T2816—20231鱼类粘孢子虫检测方法本文件给出了湖泊鱼类粘孢子虫检测的试剂与材料、仪器和设备、采样、检查步骤与结果判定方法。本文件适用于鱼类粘孢子虫的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范SC/T7223.1黏孢子虫病诊断规程第1部分：洪湖碘泡虫SC/T7223.2黏孢子虫病诊断规程第2部分：吴李碘泡虫SC/T7223.3黏孢子虫病诊断规程第3部分：武汉单极虫SC/T7223.4黏孢子虫病诊断规程第4部分：吉陶单极虫SN/T2503淡水鱼中寄生虫检疫技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂与材料本标准所使用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水。4.1乙醇：70%乙醇。4.2溴酚蓝。4.310xPCRBufferMIX：-20℃保存，避免反复冻融。4.4引物序列上游引物：5’-GATTGACGAGGTCGTTCGTTTA-3’；下游引物：5’-AGTAGGCCCTTACCCTACTTAC-3’；本对引物扩增小核糖体小亚基rRNA基因（18SrDNA）的部分序列。4.5DNAmarker2000（bp）:2000、1000、750、500、250、100。5仪器与设备5.1解剖盘、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀。5.2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。5.3盖玻片、载玻片、培养皿、巴氏吸管。5.4恒温水浴锅（控温范围：RT-100℃±1℃)。2DB43/T2816—20235.5-20℃和-80℃冰箱。5.7PCR扩增仪。5.8离心管和PCR管。5.9高压灭菌锅。5.10超净工作台。5.11水平电泳系统。5.12紫外透射仪或凝胶成像系统。6采样样品的采集应符合SC/T7103、SC/T7223.1、SC/T7223.2、SC/T7223.3和SC/T7223.4中的相关要求，样品封存和运输应符合SC/T7103的相关规定。7检查步骤观察样品，检查顺序应符合SN/T2503中的相关要求，先检查体表部位是否有明显的白色包囊或似包囊状瘤状物，如体表皮肤、鳍、鼻腔、口腔、眼球等，随后解剖鱼体观察内脏是否出现白色包囊，包括体腔、脂肪组织、胃肠、肝、脾等。7.2镜检7.2.1当在7.1中发现疑似包囊状物时，用剪刀与镊子将单个或多个包囊分离，置于载玻片上。然后，再用解剖针戳破疑似包囊物，加入约20μL-30μL双蒸水，盖上盖玻片置于光学显微镜中观察是否存在成熟孢子。7.2.2当在鱼体组织中未发现疑似包囊状物时，用剪刀或镊子取少量组织或液体（胆汁、血液、尿液等）置于载玻片上，用镊子将组织分散，加入约20μL-30μL双蒸水，盖上盖玻片，稍加压平，置于光学显微镜中观察是否存在成熟孢子。7.3分子鉴定7.3.1检测样本固定将6.2中粘孢子虫感染的包囊或组织从宿主上分离，用浓度大于70%的乙醇固定于离心管中（参见附录A），低温（-20℃)保存，标识好标签并记录。7.3.2DNA提取将6.2固定的样品充分混匀，破碎后用磷酸盐缓冲液洗涤两次以去除残余酒精。将离心管置于-80℃冰箱快速冷冻5min，取出并立即置于80℃水浴锅中5min，重复三次后镜检观察孢子是否完全破碎，极丝是否挤出。破碎后利用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，提取样品基因组DNA。提取好的基因组DNA置于-20℃保存备用。7.3.3PCR扩增DB43/T2816—20233在50μL的PCR反应体系中，包含模板基因组DNA2μL、10×PCRBufferMIX（康为世纪）在PCR扩增仪中，反应程序为94℃预变性4min；94℃变性1min；46℃退火50s；65℃延伸1min,35个循环；65℃终延伸10min。PCR扩增时，应设置阴性对照和阳性对照。7.3.4PCR产物电泳与测序取5微升PCR扩增产物，用添加溴酚蓝指示剂的1.0%琼脂糖凝胶于TAE缓冲液（参见附录A）中电泳分离，同时设置DNA分子量标准作参照，紫外透射仪下检查是否存在大约900bp的目的条带。如果存在，则取PCR扩增产物测序，测序后通过GenBank进行BLAST比对。8结果判定当肉眼观察到明显白色包囊或白色囊状物（见附录B），可以怀疑为粘孢子虫感染，但需经8.2、8.3步骤检查后才能进一步确诊。8.2镜检8.2.1将经8.1步骤检查未观察到明显包囊的组织进一步置于解剖镜下，观察是否有肉眼不可见的白色包囊（见附录B），如观察到需将其从组织中分离，并经7.2.2进行观察后确诊。8.2.2将经8.1和8.2.1步骤观察的疑似包囊以及外观正常的少量组织进行压片，观察到明显的粘孢子虫成熟孢子即可确诊（见附录C）。8.3分子鉴定将所测定的18SrDNA序列（900bp左右）与GenBank数据库中粘孢子虫序列进行比对，如比对出来的种类均为粘孢子虫序列相似性在80%以上，亦可判定为粘孢子虫。DB43/T2816—20234试剂及其配制A.170%乙醇溶液70mL无水乙醇溶液，加30mLPBS缓冲液（0.01mol/L,pH7.4）。A.2磷酸盐缓冲液（0.01mol/L,pH7.4）称7.9gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4（or1.44gNa2HPO4）和1.8gK2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加双蒸水定容至1L，4℃冰箱保存。A.3TAE电泳缓冲液（50倍）称量242.0gTris碱、37.2gNa2EDTA·2H2O混合，然后加入800mL的去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1ml的冰乙酸，充分混匀，加去离子水定容至1L，室温保存。A.4溴酚蓝指示剂溶液取溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL,在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加双蒸水定容至50mL，加入氢氧化钠（NaOH）溶液1滴，调至蓝色。DB43/T2816—20235不同粘孢子虫感染症状及包囊形态图B.1不同粘孢子虫病感染症状(A)：普洛宁碘泡虫感染鲫鱼腹腔症状，靶尺=1cm；(B)：吉陶单极虫感染散鳞