（正式版）DB6111∕T 133-2019 《谷子杂种快速鉴定技术规范》

DB6111杨凌农业高新技术产业示范区地方标准DB6111/T133—2019谷子杂种快速鉴定技术规范TechnicalSpecificationforRapidIdentificationofFoxtailMilletHybrids杨凌示范区市场监督管理局发布I1谷子杂种快速鉴定技术规范1范围2规范性引用文件33术语和定义杂种F1HybridF1一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组4鉴定步骤含量，用dO稀释到所需工作浓度(3QLng./试验所用试剂见附录A。4.2PCR扩增反应体系和程序2试验所用试剂见附录A。将反应体系混匀后进行PCR扩增：95℃预变性3min，95℃变性30s，50℃~65℃退火45s，72buffer，混合均匀，短时间内置于4℃保存，长时间内置于-20℃保存备用。扩增产物用8%聚丙烯酰封底：每板15ml8%聚丙烯酰胺，加入150μL10%过硫酸铵和15μL四甲基乙二胺，聚合1m待凝胶1h后，将与6×Loadingbuffer混合后的PCR扩增产物每个点样孔加入3μL。电泳缓冲液为银染：固定完成后，倒出固定液，加入银染液，振脱色：银染完成后，倒出银染液，加入ddH2O，振显影：脱色完成后，倒出ddH2O，加入300mL现配的显影液，待谱带清晰（以Marker为准）后照相用附录B中的SSR引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出亲本间差异性标记。结果记录见表1。3表2F1多态性检测结果记载表F₁基因型5鉴定结果汇总4实验相关试剂称取10gCTAB加入80mLddH2O，置于65°C水浴锅内加热至溶解，用ddH2O定容至1用100mL量筒量取氯仿96mL，加入4称取4.5g氢氧化钠，加入300,BLmld用醛，充分混匀(现配现用)。6退火温度(℃)F:CTGCTGCAAGCAGCGACTCCGR:CGAGGTTAGAGGCGATCCF:GCAAGCAACAGTCCATGGCCGAR:GCTGCGAGCTTGCGTGACCAAS8001F:ACCAGCACAAGCCACACGCAR:TGGCAACAACCAAATTAAGGGCF:TTATGCCAATGTCCCCGGCGGTR:CGCCGTTTCCGATCCAAGCAAS7051F:GCCCCGGACATAGTTGTTACTGR:TTGTCGCGTTAGCTTAGGATF:GCGTGGAGTCCTCTACCTTTTATR:TCCTCTTTTCTCCTTTTGF:GGCTCTCGAGTGTCCTCTCTR:AGCAGCAAGAAATGGTGTGTF:CGTAGCTACTTGTTCCACGAGR:CCGCGACTTCATCAGTGAATAF:CGTCTCCTGAACCAAGCCTAR:TCTCCTCCTCATCTTGGGTF:CGCATTGAAAATCCTCCTTCR:CCCAACCTAGCCAACCAGTCAAS6091F:CATAAAAATCTCAGCCCCAAR:GTAGCATCTCATGGCTTTF:CAGCAGTCATGGATAGTCTCGR:TACAGCATCCGGTTTCCF:ACCCCATCCCCATGTGTGTTTR:AGCAGGCCTCAACGGCCCCAAS5011F:TTGGAGCGTAGCGCATCAGR:AGCCCCTCCGTCTCTCTCACF:AAAGGTAGCCAGCTGCCCCGTGR:TGGTTCCATGTGGCCAGAAAAGAAAGC7引物编号退火温度(℃)F:TCGCTGCAACCAAAAGC1F:TACAGGCCGGTCACCAGF:TCAGCTCACCCCTCTCAF:TGCGTGTGGCGATGTGAOF:CGGCCGATCCAACCTCAF:TGGCTGTTGCTGAACCCR:GCAGATCAGCCACCACCCAAGAAGF:TTGGCCAGCACGTACGAF:TCGATTACGG