（正式版）DB6111∕T 149-2020 《猕猴桃花粉溃疡病菌活菌检测技术规程》

ICS65.020.20DB6111杨凌农业高新技术产业示范区地方标准DetectionofLivingPseudomonassyringaepv.actinidiaefromKiwifruitpoLLen杨凌示范区市场监督管理局发布IDB6111/T149—2020本文件是依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则起草。本文件由西北农林科技大学提出。本文件由杨凌农业标准化专业技术委员会归口。本文件起草单位：西北农林科技大学、陕西省猕猴桃工程技术研究中心、杨凌现代农业产业标准化研究推广服务中心。本文件主要起草人：黄丽丽、徐亮胜、雷玉山、高小宁、冯浩、王娜娜。本文件由西北农林科技大学负责解释。本文件为首次发布。单位：西北农林科技大学电话址：陕西省杨凌区邰成路西北农林科技大学邮编：712100DB6111/T149—20201猕猴桃花粉溃疡病菌活菌检测技术规程本文件规定了猕猴桃花粉中活性溃疡病菌（Pseudomonassyringaepv.Actinidiae，Psa）检测方法的原理、检测方法、检测样品与菌株保存、结果记录与资料保存的要求和内容。本文件适用于活性溃疡病菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T23621-2009农业植物检疫实验室基础条件SN/T0168-2015进出口食品中菌落总数计数方法SN/T0800.1-2016进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法3原理猕猴桃为雌雄异株植物，雌雄株之间必须通过授粉才能坐果，花粉中可以携带活性溃疡病菌。本文件利用常规生物学鉴定方法和菌落PCR检测方法对花粉中溃疡病菌进行检测，为阻止猕猴桃细菌性溃疡病菌的传播提供技术支撑。4检测方法4.1实验室要求猕猴桃细菌性溃疡病菌检测所用实验室的设置与管理符合GB/T23621—2009要求。除另有规定外，本标准中的所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB6682中一级水的规格。病原菌培养及鉴定所需试剂见附录B。4.2检验程序及鉴定方法猕猴桃花粉Psa活菌检验程序见图1。4.2.1操作步骤4.2.1.1检测样品抽取见SN/T0800.1-2016。4.2.1.2抽样数量2DB6111/T149—202010瓶（件）以下，逐瓶抽取，10瓶～100瓶，随机选10瓶抽取样品；100瓶以上，按照一批花粉总瓶数的平方根数抽取，见公式（1）。每瓶（件）抽取2g花粉。...................................................................................式中：N—一批花粉总瓶(件)数。n—应抽取瓶（件）数（取整数，小数部分向上约）。检检样稀释 平板接种总菌落计数PCR确认试验 检测报告图1猕猴桃花粉Psa活菌检验程序4.2.2抽样方法无菌条件下将装花粉的容器充分震荡，使容器内花粉充分混匀；容器表面用75%乙醇在包装口擦拭消毒，待10min～15min后，用无菌药匙取2g花粉于无菌的10mL离心管中，每瓶（件）花粉需换用1把药匙。-20℃~40℃保存备用。4.2.3样品制备4.2.3.1制备样品匀液无菌操作称取1g样品，加入装有9mL的灭菌双蒸水的和适量玻璃珠的50mL稀释瓶中，迅速振摇，将样品混匀，制成1:10的样品匀浆液。振摇时振幅为30cm，7s内振摇25次，也可以用机械振荡器振荡15s代替手摇。4.2.3.2稀释样品匀液无菌条件下取样品匀液1mL加到9mL稀释剂中，并以此类推，分别制成10-2、10-3、10-4连续稀释度或其它合适稀释度的样品匀液。4.2.4选择性培养基平板接种和培养DB6111/T149—202034.2.4.1无菌条件下各取1mL不同稀释度的样品匀液，均匀涂布在KBA+萘啶酮酸（终浓度为10μg/mL）平板培养基上。放入培养箱在25℃培养1h后，翻转培养皿，倒置培养47h。观察菌落形态和病原菌形态特征。猕猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征见附录A第A.6章，根据菌落特征选取可疑菌落做进一步鉴定。4.2.4.2KBA培养基的配制方法为：在培养基中加入蛋白胨20.0g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.5g、甘油10mL、琼脂粉15.0g，并用灭菌双蒸水补充至1000mL，将pH值调整到6.8～7.0。4.2.5菌落计数选择菌落数在25个～250个的平板进行计数，计数所有菌落形成单位（CFU），包括极微小的菌落。记录菌落数和稀释倍数。如果不能立即计数，平板在0℃~4℃存放时间不得超过24h。4.2.6PCR检测4.2.6.1从已计数的平板中挑取单菌落进行PCR确认试验平板菌落数小于30个，需全部进行PCR确认；菌落数介于31个～250个时，随机挑取30个菌落进行PCR确认试验。注：PCR实验室区的设置与管理符合GB/T4.2.6.2热裂解法制备DNA模板用无菌牙签挑取平板上培养36h～48h的单菌落，置于200μL的0.85%无菌生理盐水中，充分混匀；在13000r/min离心3min，弃掉上清液；再加入1mL灭菌双蒸水，充分混匀；置于100℃水浴或金属浴中10min；冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1:10的比例用灭菌双蒸水稀释上清液即为DNA模板；取2μLDNA模板进行PCR检测。所有DNA模板可直接用于PCR反应或在4℃保存1天。否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)。4.2.6.3阳性对照与阴性对照。用已知的Psa标准菌株（M228）作为阳性对照；用丁香假单胞杆菌番茄致病变种（Pst）或等效标准菌株作为阴性对照。灭菌双蒸水作为空白对照。PCR制样及检测方法见附录B的结果判定。4.2.7平板培养结果判定平板培养放置6d以上,如未发现疑似细菌菌落，判定为不带有Psa。如发现疑似细菌菌落，进行菌落计数，并做进一步PCR鉴定。4.2.8PCR结果判定若待测样品和阳性对照存在243bp条带，阴性对照和空白对照无此条带，则判定待测样品为阳性，其携带有Psa；否则为阴性。5样品与菌株保存备份样品及从样品中分离到并鉴定为Psa菌株，应妥善保存。备份样品菌株可接种于KBA培养基斜面上，25℃恒温培养2d～3d后置于4℃冰箱保存，或加入10%体积的甘油制成甘油菌液，置于-80℃冰DB6111/T149—20204箱长期保存。其它不需要保存的样品及检测过程中产生的废物、废水等应经高压灭菌后集中销毁，用具也应进行灭菌处理。6结果记录与资料保存实验记录应包括：样品来源、种类（品种）、采集时间、检测时间、地点和结果等，并要有检测人员、审核人员签字。PCR检测需要有电泳结果照片等，上述材料应归档并妥善保存。DB6111/T149—20205（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病菌（psa）相关资料A.1英文名称KiwifruitBacteriaLCankerA.2学名Pseudomonassyringaepv.actinidiaeA.3分布地区中国、日本、韩国、新西兰、意大利、美国、法国、葡萄牙、土尔其、西班牙、伊朗、希腊。A.4寄主范围该病原菌自然侵染的寄主主要为猕猴桃属（ActinidiaLindL）；人工接种可侵染桃（PrunusescuLentum）等。A.5病害症状A.5.1枝溃疡症状多从茎蔓幼芽、皮孔、叶痕、果柄痕及枝条分叉部位开始发病，初期呈水渍状，后扩大，颜色加深，皮层组织变软隆起，与木质部分离，后期病部皮层纵向线状龟裂，伤口、皮孔、芽眼、叶痕等部位流出白色黏液，伤流期与植株伤流液混合后变为红褐色或铁锈红色，剥开皮层后可见木质部呈黑褐色，韧皮部溃疡腐烂，病斑绕茎扩展到新梢后影响营养和水分的吸收与输送导致新梢枝叶萎蔫枯死。A.5.2叶斑症状新生叶片上呈现红色小点，后形成2mm～3mm不规则褐色或暗褐色病斑，病斑周围有2mm～5mm的明显水渍状黄色晕圈，潮湿条件下病斑扩大，导致整个叶片焦枯、卷曲。A.5.3花腐症状花蕾受害后严重的不能张开，变褐死后脱落；受害较轻的花蕾虽能开放，但开放速度慢或不能完全开放，这种花可能脱落也可能座果，通常果实较小，易落果或发育成畸形果。A.6病原菌形态特征及培养性状DB6111/T149—20206Psa为好氧细菌，病原菌菌体直杆状，有的稍弯曲，单细胞，菌体大小为（1.4μm～2.3μm）×（0.4μm～0.5μm），多数具1根极生鞭毛，少数为2根～3根。革兰氏染色阴性，不具荚膜，不产生芽孢。在KBA培养基上菌落呈白色或浅黄色、表面光滑、有黄绿色荧光；在牛肉蛋白胨培养基上呈圆形、乳白色、表面光滑、全缘。病原菌生长最适温度为25℃~28℃,生长最高温度为35℃,生长最低温度为-12℃以下，致死温度为55℃、10min。A.7传播途径该病原菌的远距离传播主要靠带菌苗木、接穗、花粉和昆虫。在田间，该病原菌主要通过雨水、灌溉水、农具、昆虫等传播，由伤口、自然孔口等侵入寄主组织。DB6111/T149—20207（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病菌（psa）PCR检测方法B.1试剂及配制——TE缓冲液：10mMTris·HCL,1mMEDTA,pH8.0。——PCR试剂：特异引物对（10μmoL/L）、2×MasterMix、TempLate(0.1ng/mL～1ng/mL)——2000bpDNAMarker、5moL/LNaCL、70%乙醇、核酸染料——电泳缓冲液TBE（5×)（pH8.0）：每升溶液中含54gTris，27.5g硼酸，10mMEDTA。电泳时稀释成1×浓度使用。——琼脂糖凝胶（1%称取0.1g琼脂糖加入到10mL1×TBE溶液中，微波炉煮沸后加入1‰体积核酸染料，混匀后制胶。B.2PCR检测B.2.1PCR检测引物引物对1：Psa-F1/Psa-R1（引物序列为正向引物P0F:5`-CTGCAACAGGCGACGGCGAGGC-3`、反向引物P6R:5`-CATAGGCTTCTGGTTTTCTTCCTGATCC-3`，扩增片段长度为243bp），使用TE溶液（pH8.0）将合成的引物干粉稀释成10μmoL/L储存液。B.2.2PCR反应体系及扩增条件B.2.2.1PCR反应体系2×MasterMix10μL、TempLate(0.1ng/mL～1ng/mL)1μL、正反引物各1μL、补灭菌双蒸水至反应体系总体积为20μL。B.2.2.2PCR扩增条件将配制完成的反应管放入PCR仪中，启动反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸1min，35cycLes；72℃5min，4℃保温。在进行PCR检测时，需同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。B.3凝胶电泳称量2.0g琼脂糖，加入至200mL的1×TAE电泳缓冲液中，充分混匀。微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60℃左右时，加入GeLRed（胶体体积与染料体积比为20:1），充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于10cm，厚度为3mm～5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，如果有，则用一次性吸头小心排掉气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结后，轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔朝向阴极端。向电泳槽中加入1×TAEDB6111/T149—20208电泳缓冲液，液面高于胶面1mm～2mm。用微量移液器吸5μLPCR产物加入上样孔中；其中，第1个泳道中加入2μLDNAMarker，阳性对照的PCR反应产物加入到最后1个泳道。接通电源,根据公式:电压=电泳槽正负极间的距离(cm)×5V/cm计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关,电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准，电泳时间为30min～45min。B.4成像观察与记录电泳结束后，取出琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下，根据DNAMarker判断扩增产物条带的大小，记录结果，并将电子文件存档备查。B.5结果判定如果待测样品和阳性对照同时出现243bp大小的目的条带，而阴性对照、空白对照均没有该条带，则判定待测样品为阳性；如果阳性对照出现目的条带，而阴性对照、空白对照、待测样品中均未出现目的条带，则判定待测样品为阴性。B.6结果报告B.6.1数字修约参见SN/T0168