抗体制备工作流程

演讲人：日期:抗体制备工作流程CATALOGUE目录01抗原准备02动物免疫03细胞融合04杂交瘤筛选05抗体生产06质检与应用01抗原准备抗原设计与合成基于目标蛋白的免疫原性区域，通过生物信息学工具预测高抗原性表位，避免同源序列干扰，必要时进行密码子优化以提高表达效率。靶点选择与序列优化重组表达系统构建化学合成多肽抗原选择大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等表达系统，通过基因克隆技术将抗原基因插入表达载体，确保可溶性表达及正确折叠。针对线性表位设计短肽（通常15-20个氨基酸），采用固相合成法（SPPS）合成，并通过HPLC纯化以确保纯度＞95%。利用His标签、GST标签等亲和层析柱捕获目标蛋白，后续通过离子交换或分子筛层析去除杂质，获得高纯度抗原。抗原纯化与验证亲和层析纯化通过电泳检测抗原分子量及纯度，结合特异性抗体进行WesternBlot验证其免疫反应性。SDS与WesternBlot验证采用质谱分析确认抗原序列完整性，ELISA测定抗原浓度及批次间一致性，确保标准化制备。质谱与ELISA定量根据免疫目标选择弗氏佐剂（完全/不完全）、铝佐剂或新型佐剂（如CpGODNs），平衡免疫强度与不良反应风险。佐剂类型匹配将抗原与佐剂按比例混合，通过高速匀浆或超声乳化形成稳定乳剂，显微镜下观察乳滴均匀性（1-10μm）。油包水乳化工艺过滤除菌后检测内毒素水平（＜1EU/mg），4℃保存评估乳化稳定性，避免分层影响免疫效果。无菌与稳定性测试佐剂选择与乳化02动物免疫实验动物模型选择物种匹配性根据目标抗体的应用场景选择合适动物模型，如小鼠、兔子或山羊，需考虑抗原同源性、免疫系统响应强度及后续实验兼容性。遗传背景控制优先选择近交系或封闭群动物，确保遗传稳定性，减少个体差异对免疫应答的影响，提高抗体批次间一致性。健康状况评估筛选无特定病原体（SPF级）动物，排除潜在感染对免疫效果的干扰，并通过体重、活动度等指标监测基础健康状态。免疫方案设计与实施抗原剂量与佐剂优化依据抗原性质（如蛋白质、多肽或核酸）调整免疫剂量，搭配弗氏佐剂、铝佐剂等增强免疫原性，平衡刺激强度与动物耐受性。免疫周期与途径采用多轮次免疫策略（如基础免疫+加强免疫），通过皮下、腹腔或淋巴结注射等途径，最大化B细胞活化与抗体分泌。动态监测与调整定期采集微量血清进行预检测，评估免疫应答强度，灵活调整免疫间隔或抗原剂量以优化抗体效价。血清效价检测ELISA定量分析包被目标抗原，通过酶联免疫吸附试验测定血清中特异性抗体浓度，设置梯度稀释确定半数有效滴度（EC50）。功能性实验补充针对中和抗体或阻断抗体，设计细胞毒性抑制、受体结合竞争等实验，验证抗体的生物学活性与潜在应用价值。WesternBlot验证利用电泳分离抗原，转膜后与血清孵育，检测抗体对天然或变性抗原的结合能力，评估特异性与交叉反应风险。03细胞融合骨髓瘤细胞系培养细胞复苏与传代骨髓瘤细胞需在特定培养基中复苏，定期传代以维持其高增殖活性，确保细胞处于对数生长期以提高融合效率。培养基优化采用含胎牛血清、谷氨酰胺及抗生素的RPMI-1640培养基，定期检测细胞活力与污染情况，避免支原体或细菌污染影响后续实验。细胞状态监测通过台盼蓝染色或自动化细胞计数仪评估细胞存活率，确保融合前细胞存活率高于95%，且形态均一、无聚集现象。脾细胞分离与制备脾脏组织处理无菌条件下取出免疫后的小鼠脾脏，置于预冷的PBS中轻柔研磨，通过细胞筛过滤获得单细胞悬液，去除结缔组织与红细胞残留。淋巴细胞富集采用密度梯度离心法（如Ficoll分离液）纯化淋巴细胞，提高B细胞比例，确保后续融合时抗原特异性B细胞的丰度。细胞计数与活力检测使用血球计数板或流式细胞术精确计数，调整细胞浓度至1×10^7/mL，确保与骨髓瘤细胞比例达到最佳融合条件（通常为5:1至10:1）。PEG介导融合立即用无血清培养基稀释PEG，离心去除残余融合剂，重悬于HAT选择性培养基中，抑制未融合骨髓瘤细胞的生长。融合后处理杂交瘤筛选将融合细胞接种于96孔板，定期观察克隆形成情况，通过有限稀释法分离单克隆杂交瘤细胞，确保抗体分泌的单一性。将脾细胞与骨髓瘤细胞混合后，缓慢加入50%聚乙二醇（PEG-1500）溶液，温和搅拌促进细胞膜融合，严格控制作用时间以避免细胞毒性。融合剂介导杂交04杂交瘤筛选阳性孔初步检测ELISA筛选采用酶联免疫吸附试验检测杂交瘤上清液中抗体分泌情况，通过显色反应判断阳性孔，需设置空白对照和阴性对照以排除非特异性结合干扰。免疫荧光验证利用靶抗原标记的细胞或组织切片与杂交瘤上清孵育，通过荧光显微镜观察结合信号，筛选出与目标抗原特异性结合的候选克隆。WesternBlot辅助分析进一步验证抗体与变性或非变性抗原的结合能力，确保筛选出的抗体适用于多种实验条件，提高后续应用的可靠性。单克隆化亚克隆有限稀释法将阳性孔细胞稀释至每孔0.5-1个细胞密度，培养后通过显微镜观察单克隆生长情况，确保后续扩增的细胞群来源于单一祖细胞。半固体培养基克隆通过荧光标记靶抗原与杂交瘤细胞结合，利用流式细胞仪分选单个抗体分泌细胞，实现高精度单克隆化。采用甲基纤维素或琼脂糖培养基分离单个细胞，避免细胞迁移造成的交叉污染，提高单克隆纯化效率。流式分选技术特异性抗体验证功能学实验验证在细胞中和实验、免疫沉淀或体内模型中测试抗体的功能性，如阻断病原体感染或激活信号通路，确认其实际应用价值。亲和力测定通过表面等离子共振（SPR）或生物膜干涉技术（BLI）定量分析抗体-抗原结合动力学参数（如KD值），评估抗体的结合强度与稳定性。交叉反应性测试将抗体与结构相似的蛋白或组织样本孵育，检测非特异性结合信号，确保抗体仅识别目标抗原表位。05抗体生产03大规模细胞培养02生物反应器参数控制精确调控温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，确保细胞处于最佳生长状态，同时采用灌注或分批补料策略延长培养周期并提高抗体滴度。培养基设计与成分优化开发无血清或化学成分限定的培养基，补充必需氨基酸、维生素及生长因子，减少批次间差异并降低宿主蛋白污染风险。01细胞系选择与优化根据抗体表达需求筛选高产量、稳定性强的细胞系（如CHO、HEK293），并通过基因编辑技术优化细胞生长特性与抗体分泌能力。腹水制备与收集通过多次免疫注射抗原激活小鼠B细胞，与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，筛选高特异性单克隆抗体细胞株。动物免疫与杂交瘤诱导将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，利用腹水微环境促进细胞增殖和抗体分泌，定期监测腹水体积及抗体浓度。腹水产生与扩增采用无菌穿刺技术收集腹水，离心去除细胞碎片，添加蛋白酶抑制剂防止抗体降解，低温保存备用。腹水采集与预处理抗体纯化工艺亲和层析技术使用ProteinA/G或抗原偶联层析柱特异性捕获抗体，通过pH梯度洗脱获得高纯度产物，优化缓冲液配方以提高回收率。离子交换与疏水层析超滤与透析处理次级纯化步骤中，利用电荷或疏水性差异去除宿主DNA、内毒素及聚合体，确保抗体单体含量超过95%。采用切向流超滤浓缩抗体溶液，置换缓冲体系至PBS或其他储存条件，并通过0.22μm滤膜除菌分装。12306质检与应用效价与纯度检测ELISA效价测定通过酶联免疫吸附试验定量分析抗体与抗原的结合能力，确保抗体达到预期效价标准，需优化包被抗原浓度和稀释梯度以提高检测灵敏度。SDS纯度分析采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳评估抗体纯度，观察重链与轻条带是否清晰单一，排除杂蛋白或降解片段干扰。高效液相色谱（HPLC）检测利用分子排阻色谱或反相色谱进一步验证抗体单体含量，检测聚集体或片段比例，确保纯度高于95%以上。功能性验证实验03免疫组化/免疫荧光应用测试在组织切片或固定细胞中检测抗体定位准确性，优化染色条件以平衡信号强度与背景噪音。02流式细胞术结合验证通过标记抗体与靶细胞表面抗原结合，分析荧光信号强度与特异性，排除非特异性结合或交叉反应。01中和活性实验在细胞模型或动物模型中验证抗体阻断病原体感染或抑制靶蛋白活性的能力，需设置阳性对照和阴性对照以量化中和效率。