2025年2-3核受体课件

第二节受体的结构与功能一、核受体1965年，Toft首先发现大鼠子宫内有特异性吸附雌激素的物资，称之为雌激素受体（estrogenreceptor，ER）。1967年Jensen等建立了放射配体结合测定的方法，用该法首次证实在人的乳腺癌和子宫癌细胞的胞浆中证实ER的存在。

（一）nuclearreceptorsuperfamily的组成核受体超家族有近70个成员，可分为6－7个家族。1.甾体激素受体（steroidhormonereceptor，SHR）家族

糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR，)

盐皮质激素受体(mineralocorticoidreceptor,MR)

雌激素受体(estrogenreceptor,ER，)

孕激素受体(progesteronereceptorPRA，B)

雄激素受体(androgenreceptor,ARA,B)2.非甾体激素受体：

甲状腺激素受体(thyroidhormonereceptor,TR，)1,25(OH)2维生素D3受体(vitamineD3receptor,VDR)维甲酸受体(retinoidacidreceptor,RAR，，)

配体为全反式维甲酸维甲类X受体(retinoidXreceptor,RXR)，，

配体为9-顺式维甲酸

RXR可与多种非甾体激素的核受体形成异二聚体，调节基因表达。

3.其他核受体过氧化物酶体增殖因子激活受体(peroxisomeproliferator–activatedreceptor,PPAR),,

肝X受体(liverXreceptor,LXR),法尼醇X受体(farnesoidXrecptor,FXR)孕甾烷X受体(pregnaneXreceptor,PXR/SXR)组成型雄甾烷受体(constitutiveandrostanereceptor,CAR)它们的配体为多种脂质代谢产物（如脂肪酸、胆汁酸、氧类固醇等）和外源性化合物和药物。这类核受体与其配体结合后能调节参与脂质代谢和药物代谢酶系的表达，并参与其代谢调控。4.孤儿核受体(orphanreceptor)SF-1,LRH-1,DAX-1，SHP,TLX,PNR，NGFI-B,,

,ROR,,

,ERR,,

,RVR,,

，GCNF，TR-2,4,HNF-4,COUP-TF,,

.（二）核受体的结构配体结合区(ligandbindingdomain,LBD)DNA结合区(DNAbindingdomain,DBD)

两锌指结构转录激活区(transcriptionalactivationdomain,TAD)

NH3+转录调节DNA结合配体结合

HSP结合COO-HBD

TADDBDLBDA/BCDEFAF1AF2zincfinger结构（三）核受体转录调节的机制

早已发现，甾体激素对多种基因的表达有调节作用，如于原代培养的爪蟾肝细胞中加入雌激素，卵黄生成素基因的转录可提高数千倍，该基因mRNA的半衰期也明显延长，表明雌激素对卵黄生成素基因表达的促进作用既发生在转录水平，又发生于转录后水平。核受体作为为一类配体依赖性或非依赖性的的转录调节因子，能通过调节基因表达，调控有机体的生殖、生长发育和代谢，参与免疫、炎症反应和药物代谢，在维持机体的稳态中发挥重要作用。已证实它们的异常与多种疾病密切相关。

人类基因组DNA包含了大约30亿个碱基对，蕴含生物体的全部遗传信息。根据人类基因组作图与测序所确定的人类基因组含约3万多个基因。通常基因组中的大多数基因处于不表达的或转录效率极低的状态，基因表达是在一定的调节机制控制下进行的。基因表达具有时空性：时间：基因表达随生长发育的不同阶段而异；空间：不同组织细胞表达的基因类型不完全相同;基因表达受外界因素，如环境、气候、食物、药物、生活方式和心理等的调控。有机体的发育，稳态和对环境的适应依赖细胞外信号调节的基因表达。随着人类基因组计划已经完成，生命科学已全面进入功能基因组及蛋白质时代。今后要研究的问题是：基因的表达是如何调控的，它们表达产物的功能是什么，这些产物是如何发挥功能的。基因与疾病的关系参与基因的转录的成分1.基础转录机器(basictranscriptionmachinery)。

由通用转录因子(generaltranscriptionfactors,TFII)群和RNA聚合酶II组成。通用转录因子是所有基因表达时必需的转录因子群。组装时先由TFIID(TBP)先结合于TATA盒，之后TFIIA、B、E、F、H、J等有序地结合上去，与RNA聚合酶II一起，形成巨大的转录起始复合物，也称基础转录机器。转录起始复合物只有较低的转录活性。2.转录调节因子(regulatorytanscriptionfactors)(1)序列特异性的转录调节因子（sequence–specifictranscriptionfactors)：1)具有DNAbindingdomainandactivationdomain2)转录活性受细胞信号的调节。3)激活的转录因子一般结合在靶基因启动子附近的特定反应元件上(responseelement)，能够募集共调节因子。4)对特定靶基因转录有促进或抑制作用。核受体、STAT，NF-

B等都属于这类转录因子。(2)共调节因子(co-regulators)

位于细胞核内，不能和DNA结合，但能与转录因子作用，可在通用转录因子和转录调节因子间起架桥作用。根据共调节因子对转录激活作用的影响，可分为共激活因子和共抑制因子两大类：

1)共激活因子(co-activators)：

具有组蛋白乙酰化酶(histoneacetyltransferase,HAT)的活性或能与HAT结合，HAT能使组蛋白乙酰化，导致染色质重构和DNA模板裸露，使TF容易与DNA结合并形成转录起始复合物，从而促进转录。例如：

CBP/p300能参与多种转录因子（如核受体、NF-κB和AP-1等）的转录激活作用，能够同时对来自于细胞膜及核信号的转录调节起整合作用。

P/CAFCBP/p300连接因子，具有HAT活性。2)共抑制因子(co-repressors)

能与组蛋白脱乙酰化酶(histonedeacetylase,HDCA)结合,通过后者使组蛋白去乙酰化，从而抑制基因转录。

1.核受体的激活

甾体激素受体（SHR）与其配体结合后被激活（与它们的chaperone蛋白，如HSP解离，构象改变）,导致受体的DBD暴露，之后SHR以同源二聚体的形式转位入核，与靶基因中的增强子序列－激素反应元件(hormoneresponseelements,HREs)结合。

SHR的磷酸化可导致受体非配体依赖性激活。

GRHSPGCGRGCHSPGRGCGRERNApoly.CoANuclearCytoplasmNucleartranslocation核受体调节基因转录的机制GCGR非甾体激素核受体与配体结合前就位于核内，可能是以异源二聚体的形式结合在HRE上，其激活确切机制尚不清楚。非甾体激素受体与RXR形成异二聚体ERARPRGRMR

RXR

VDRVRE

ERERE

ER甾体激素受体同二聚体TRVDRRARLXRPPARFXRCARPXR/SXREcR

2.激素反应元件

(HREs)

HRE为靶基因启动子上的特定核苷酸序列，由15或13bp组成。通常位于启动子的上游，具有增强子(enhancer)或减弱子(dehancer)/静息子(silencer)的活性。甾体激素的HRE：完全或不完全回文结构GRE：5’-GGTACAnnnTGTTCA-3’ERE:5’-AGGTCAnnnTGACCT-3’非甾体激素核受体的HRE：直接重复结构：

RARE：5‘-AGGTCAnAGGTCA-3’VDRE:5‘-AGGTCAnnAGGTCA-3’TRE:5‘-AGGTCAnnnAGGTCA-3’染色质中的核小体结构具有抑制基因转录的作用，核受体与其配体结合后，能识别以核小体存在的非活性的启动子，并与其中的HRE结合，之后通过募集共激活因子，促使染色质结构改变，使染色质从非活性状态转为活性态，从而促进基因转录。

CoA的结构与核受体结合与其他CoA作用HAT区

LXXLLHAT3.核受体的共调节因子共激活因子(co-activators，CoA)

激活的核受体能够募集共激活因子，从而促进靶基因的转录。已知核受体的共激活因子有：(1)p160/SRC(steroidreceptorco-activator)家族有三种成员：SRC1SRC2/TIF2SRC3/ACTR/AIB1(2)CBP/p300(3)P/CAF

2.共抑制因子

(co-repressors，CoR)

起转录抑制作用其成员有核受体共抑制因子(

N-CoR)以及RAR和TR的静息介导子(SMRT)等。它们能与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)结合，通过后者使组蛋白的去乙酰化，从而介导转录抑制。4.核受体的作用模式HSP90HSP70

SRSRSR细胞浆细胞核

未活化的核受体-伴侣(HSP)复合物配体SRSRCoA甾体激素受体的作用模式受体-共激活因子

复合物转录HREHRE靶基因基因组DNA激素受体mRNA共激活因子TBPRNA聚合酶II蛋白质生理效应基础转录因子TATAboxRXR细胞核

配体非甾体激素核受体激活的作用模式(1)举例：大多数的

RXR异二聚体、孤儿受体、雌激素受体?未活化的核受体NSNSCoA活化的核受体－共激活因子复合物转录NSNSCoAHREHREHRENSRXRRXR

NR配体非甾体激素核受体激活的作用模式(2)细胞核举例:一些RXR异二聚体(TR,RAR)、孤儿受体

核受体－共抑制因子复合物NRCoA活化的核受体－共激活因子复合物转录

RXRCoACoR转录HREHREHRENR

RXR

RXR未活化的核受体复合物HSP90HSP70NRNRNRNRNRCoA配体非依赖性核受体的活化(

信号交互应答)

细胞浆细胞核核受体－共激活因子复合物举例:生长因子-MAPK-雌激素交互应答转录膜信号通路激活的蛋白激酶PPPPHRE

5.核受体的靶基因和生理及病理的研究(1)estrogenreceptor(ER)

ER

是第一个被证实的核受体。主要存在于子宫，乳腺，卵巢等。

ER1996年发现，分布广泛，包括生殖和非生殖系统组织，后者如骨骼，脑，心血管系统，前列腺等。ER

基因knockout小鼠表型(phenotype)：

幼稚性子宫和乳腺，无生育能力(雌雄)和性行为；有自身免疫性疾病表现等。ER

基因敲除小鼠表型

高血压，骨质疏松，变粗；部分脑区神经元减少；雄性小鼠前列腺上皮增殖；脾脏肿大，老年鼠的多种组织器官有淋巴细胞浸润。ER

基因敲除小鼠制备的技术路线：将小鼠胚胎干细胞（ES）的ER

基因的外显子3中插入一段核苷酸序列，使基因失活。插入的核苷酸序列被称为neocassette,后者能编码一种蛋白，使细胞能抵抗neomycin。

经筛选后获得整合稳定和表达的ES细胞，然后将这些细胞注射到小鼠胚泡腔中，使带有外源基因的ES细胞进入生殖系，形成嵌和体，这种嵌和体小鼠，最后经杂交育种就可得到纯合体。

ER

的发现使研制选择性ER的激动剂和拮抗剂成为可能。雌二醇能与ER

,

结合。植物雌激素，如genistein与ER

结合的亲和力比ER

大7~30倍。

用ER

激动剂治疗骨质疏松和更年期综合症更有针对性。

ER与乳腺癌

ER能介导雌激素促进乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞增殖的作用，这是因为ER能促进多种与乳腺细胞增殖相关的基因的表达：1.细胞生长因子：如TGF、EGF、bFGF等；2.受体和信号转导蛋白；3.多种核蛋白：如c-jun、c-fos、c-myc等；4.细胞周期蛋白：cyclinD1、cyclinB1和cyclinE。

临床用ER拮抗剂如tamoxifen治疗乳腺癌（内分泌治疗）。（2)糖皮质激素(GC)的抗炎作用

GC与其受体(GR)结合后，能通过调节基因表达，发挥抗炎和免疫抑制作用：1)促进膜联蛋白-1和IL-1受体拮抗剂等抗炎物质的表达，膜联蛋白-1能通过抑制PLA2的活性，抑制脂质炎症介质的生成。2)抑制多种参与免疫、炎症及纤维化的基因的表达。糖皮质激素具有抗炎症和免疫抑制功能，并能调节细胞的增殖分化，对多种肿瘤细胞有抑制作用。GR诱导的靶基因1.脂皮素-1(lipocortin)，脂皮素-1能通过抑制PLA2的活性，减少脂质炎症介质的生成。

2.IL-1R拮抗剂，为无功能的受体，能拮抗IL-1的作用。3.2肾上腺素受体一些核受体，如糖皮质激素受体(GR)等还能通过与负性HRE（nHRE）结合，或通过与其他转录因子，如AP-1或NF-κB的交互抑制或拮抗作用抑制靶基因的表达，从而发挥免疫抑制和抗炎作用。NF-κB调节的靶蛋白：NF-

B能促进多种参与免疫及炎症反应的基因的表达。如多种细胞因子(如TNF，IL-1等)，趋化因子，iNOS，胞浆PLA2，细胞粘附分子等。

膜信号对核受体和共激活因子的影响多种膜受体信号转导通路中激活的蛋白激酶可以导致核受体和共激活因子的磷酸化，使：核受体非配体依赖性的激活；2.共激活因子在不同细胞区室间的移位，增强它们的转录激活刺激功能，改变它们与多种DNA结合蛋白/核受体转录相互作用的优先性。

甾体激素受体抑制基因表达的可能机制：1.通过negativeresponseelement。2.通过在转录水平与其他转录因子的相互拮抗作用

GR在转录水平拮抗NF-

B和AP-1转录激活作用，如与NF-κB和AP-1竞争共激活因子CBP/p300，从而抑制多种炎症介质、细胞因子、趋化因子以及诱导性NO合酶的生成，从而产生强大的抗炎症抗免疫反应的作用。（三）核受体异常与疾病的关系核受体的异常可导致靶细胞对相应配体的不敏感（insensitivity)或抵抗（resistance),与之相应的疾病主要有：1.激素不敏感综合征或抵抗征：如雄激素不敏感综合征（AIS）、1,25(OH)2维生素D3受体抵抗性佝偻病、甲状腺激素抵抗征等。2.肿瘤:激素依赖性肿瘤，如乳腺癌和前列腺癌。雄激素受体（AR）病理学的研究研究对象：1.完全型雄激素不敏感综合征（AIS）或睾丸女性化综合征（TFM）。AIS为遗传性疾病，患者染色体核型为XY，但外生殖器为女性，无女性内生殖器，腹股沟可摸到睾丸。2.前列腺癌前列腺癌(PC)是雄激素依赖的肿瘤，已证明AR能通过调节靶基因(细胞因子、受体、信号转导蛋白，细胞周期调节蛋白等)的表达，促进前列腺癌细胞的增殖。内分泌治疗，去势和应用雄激素拮抗剂可抑制肿瘤生长并诱导癌细胞凋亡。但在治疗中发现，有些患者经一段时间内分泌治疗后，疗效逐渐下降，表现对抗雄激素治疗不敏感，有些患者用雄激素拮抗剂治疗后肿瘤的进展反而更快。提示AR在PC的进展中可能具有重要作用。问题：雄激素不敏感综合征和前列腺癌对雄激素不敏感或抵抗的原因是什么?研究什么

研究的内容和技术路线：靶组织细胞AR数量的检测；放射配体结合测定法:受体的数量和亲和力；

RT－PCR受体的mRNA；westernblot和免疫组织化学的方法:受体的蛋白质2.AR基因突变的检测抽提患者组织、细胞基因组DNA

对AR基因外显子A

H分别进行PCR扩增

对PCR产物分别进行SSCP分析

对有泳动变位的片段进行测序，确定突变的位点和性质

单链DNA构象多态性（SSCP）原理

PCR产物经变性后可产生两条互补的单链,各单链可根据自己的一级结构而形成不同的构象,如果某一片段发生突变,那么其单链的空间构象将随之变化,经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳后,不同构象的片段因具有不同的迁移率,在凝胶上显现不同的带型,从而确定野生型和突变型的基因。

变性中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

部分患者

AR基因外显子GSSCP分析结果CTFM7TFM8

TFM9↙TFM3AR基因外显子E测序结果TFM患者AR基因SSCP分析及测序结果患者外显子突变分析TMF3EGly743ArgTMF5G

Val866MetTMF6EArg752GlnTMF7GT2919缺失

TMF10GG2881缺失

TMF12GArg831Gln

：为新发现的突变3.突变AR功能研究运用体外人工致突变的方法，将突变位点引入AR表达载体中

AR功能分析（放射配体结合、转录激活功能分析）AR突变体的构建和表达磷酸钙瞬时转染Westernblot和放射配体结合测定COS7PCMV5-AR*Fig.4磷酸钙瞬时转染COS7细胞放射配体结合测定法基本原理放射配体结合测定法是通过检测与受体特异结合的放射性配体的多少来确定受体的数量和结合的亲和性。(1)放射配体

3H-L甾体激素等小分子配体；

125I–L蛋白质和肽类配体(2)测试样本：完整细胞，从组织和细胞中分离的膜或胞液(cytosol)制备

(3)将标记配体与样本在一定温度下共同温育(受体和配体结合)，去除未结合的游离的标记配体。从测得的总放射性中减去与杂蛋白结合的非特异结合的放射性，就得到受体特异结合的放射性(cpm)。

通过单个浓度分析，可得出单位组织或每个细胞上的受体数目。

通过饱和曲线和Scatchard分析可求得受体的两个基本参数：1.最大结合容量(Bmax值)，用fmol/mg蛋白或特异结合位点数/细胞表示。2.平衡解离常数(Kd)值

该法不能检测无结合活性的受体。SaturationplotofwtARandARmutants01234024681012Free3H-R1881(nmol/L)Bound(fmol/10X6cell)wtARTFM7TFM10Scatchardblot我们构建了两个从雄激素抵抗征患者中发现的突变AR的表达载体，转染入无内源性AR表达的细胞中，并用Westernblot证实细胞能有效表达AR。

放射配体结合测定法证实，突变AR不能与雄激素结合。

我们从50余例的前列腺癌的组织标本中，发现了4例患者AR存在突变（G142V、D221H、E872Q、M886I），这些突变分别位于AR的转录激活区AF-1和AF-2中实验证实这些突变受体与雄激素结合的亲和力及最大结合容量无明显异常。我们对突变AR的转录激活功能进行了研究。

荧光素酶(luciferase，LUC)报告基因的检测

luciferase能使底物氧化而发出光子，用LuciferaseAssaySystem进行检测，根据发出光子的强度，判断报告基因表达的多少。（1）构建AR的报告基因LUCMMTV-LUC，MMTV中含ARE

（2）将突变AR表达载体与报告基因MMTV-LUC一起共转染入无内源性AR表达的CV-1细胞中，进行AR的转录激活功能研究。MMTVlucCV-1脂质体瞬时转染DHT,CPA,雌二醇,孕激素,luc活性测定PCMV5-AR*

DHT对AR突变体转录激活功能的影响从图可以看出，在DHT作用下，发生于TAD的两个突变体（G142V和D221H）转录激活功能明显增强（P<0.01）050100150200wtARG142VD221HM886IE872Q%ofwtARtranscription

1.79

1.69

1.07

1.09

DHT对AR突变体转录激活功能的影响从图可以看出，在DHT作用下，发生于TAD的两个突变体（G142V和D221H）转录激活功能明显增强（P<0.01）

P<0.01从图可以看出，在CPA作用下，突变ARE872Q转录激活功能明显增强（P<0.01）我们还研究了共激活因子TIF-2、CBP及P300对AR突变体转