DB43∕T 3133-2024 水稻核辐射靶向基因突变筛选技术规程

ICS65.020

CCSB30

43

湖南省地方标准

DB43/T3133—2024

水稻核辐射靶向基因突变筛选技术规程

Codefortargetedmutationgenescreeningtechniquesonricebynuclear-radiation

2024-12-31发布2025-03-31实施

湖南省市场监督管理局发布

DB43/T3133—2024

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5核辐射诱变源及材料.................................................................2

6仪器设备及试剂盒...................................................................2

7操作步骤...........................................................................2

8植株材料编号.......................................................................3

9突变体档案.........................................................................3

附录A（资料性）文库构建与突变体筛选的反应体系和程序.................................4

I

DB43/T3133—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由湖南省农业农村厅提出。

本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：湖南省核农学与航天育种研究所、华智生物技术有限公司。

本文件主要起草人：杨震、张莉、张逸妍、吕思维、张渊海、李文革、张勇、彭妙、彭选明、唐顺

学、吴云天、陈哲红。

II

DB43/T3133—2024

水稻核辐射靶向基因突变筛选技术规程

1范围

本文件规定了水稻核辐射靶向基因突变筛选技术的原理、诱变源及材料、仪器设备以及操作步骤等

内容。

本文件适用于采用核辐射诱变水稻种子获得靶向基因突变体。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T4404.1粮食作物种子第1部分：禾谷类

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

核辐射atomradiation

原子核从一种结构或一种能量状态转变为另一种结构或另一种能量状态过程中所释放出来的微观

粒子流。核辐射一般分为粒子辐射和电磁辐射两大类，包括α粒子、β粒子、γ射线、X射线、中子、

质子、电子、离子束等。

最适辐射剂量optimalradiationdosage

辐射当代幼苗期，苗高较对照降低50%时的辐射剂量。

诱变群体mutantpopulation

指通过物理或化学诱变剂处理，人为诱导基因突变所获得的生物群体。

靶向筛选targetedscreening

根据靶向基因序列设计分子探针，与基因组文库杂交捕获，对捕获片段PCR扩增，测序获得靶向基

因的突变位点信息。

4原理

采用物理诱变源辐射水稻干种子，将M2代群体制备成多个DNA混池，分别构建DNA文库；根据靶

向基因序列设计分子探针，将探针与DNA文库进行杂交；采用磁珠富集杂交后的产物，构建富集文库；

对富集文库进行鉴定分析，筛选出与靶向基因序列有差异的DNA混池；对混池内各单株进行靶向基因测

序，获得靶向基因突变单株。

1

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5核辐射诱变源及材料

诱变源

可采用α粒子、β粒子、γ射线、中子、质子、电子、离子束等物理诱变源。

主要材料

水稻干种子，质量应符合GB/T4404.1。

6仪器设备及试剂盒

仪器设备

主要包括组织研磨仪、高速冷冻离心机、核酸浓度测定仪、水浴锅、PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳

仪、水平电泳槽及制胶附件、凝胶成像系统、MiniSeq500测序仪、Serapure磁珠。

试剂盒

主要包括DNA提取试剂盒、文库构建试剂盒、扩增试剂盒、杂交试剂盒、测序试剂盒等。

7操作步骤

诱变材料的选择

选择综合性状优良、遗传稳定性好的纯系自交品种，针对育种目标性状进行靶向基因突变的筛选。

最适辐射剂量

γ射线300Gy～350Gy，12C+6离子束120Gy～150Gy，电子束是300Gy～350Gy，中子12Gy～

20Gy、质子150Gy～200Gy。

辐射诱变材料群体的获取与靶向变异筛选

7.3.1获取诱变群体

M1代多本粗插，混收获得M2代种子。M2代进行大田单本移栽或实验室水培。

7.3.2制备DNA混池

苗期M2群体以100个单株作为一组，每单株随机取一个叶片，每叶片采用直径为5mm～7mm的

打孔器取叶片进行混合，制备DNA混池。采用植物基因组提取试剂盒进行DNA提取。

7.3.3设计分子探针

在水稻基因组数据库中查找靶向基因DNA序列，利用引物设计软件设计覆盖该基因所有外显子、80

bp～130bp长度的分子探针。

7.3.4构建DNA文库

将各混池DNA进行片段化处理，加上A尾，连接测序接头并纯化，扩增得到DNA文库。反应体系见

附录A.1-A.3。

2

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7.3.5分子杂交

使用杂交洗脱试剂盒进行探针和文库的杂交。反应体系见附录A.4。

7.3.6富集靶向基因片段

采用磁珠对杂交后的产物进行富集。反应体系见附录A.5。

7.3.7扩增富集产物

采用PCR仪进行富集产物的扩增。反应体系见附录A.6。

7.3.8筛选突变混池

在MiniSeq500测序仪平台完成高通量测序，并对测序结果进行生物信息学分析，筛选出靶向基因

变异混池。

7.3.9获取突变单株

根据靶向基因变异位点设计特异性引物，对突变混池各单株进行扩增和一代测序，筛选靶向基因突

变单株。反应体系见附录A.7。

8植株材料编号

建立诱变种子株系编号：品种名-诱变种类-年月-世代-株系编号-世代-单株编号；例如xx-γ射线

-2023-Mx-xxxx-Mx

M2群体混池编号：A1.2.3.......。

靶向突变混池单株编号：A1-1.......。

9突变体档案

在田间或实验室进行水稻基因突变体综合农艺性状和突变基因表型特征考察情况，具体考查内容

及记载表格见表1。

表1突变体档案记录表格

突变基因突变基因

品种名诱变源种类编号播种期始穗期齐穗期成熟期

分子特征表型特征

3

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A

A

附录A

（资料性）

文库构建与突变体筛选的反应体系和程序

文库构建与突变体筛选的反应体系和程序如下。

表A.1DNA片段化/DNA片段加A尾

反应体系

组分每反应量（μL）

样本群DNAX（100ng～200ng）

10×FEAReactionBuffer5

5×FEAenzymeMix10

ddH2O35-X

反应程序

温度时间

热盖70℃On

4℃1min

32℃16min

65℃30min

4℃Hold

表A.2接头连接

反应体系

组分每反应量（μL）

反应产物50

5×Ligasebuffer20

TIANSeqDNALigase10

DNAAdapterX2.5

ddH2O17.5

反应程序

温度时间

热盖Off

20℃15min

4℃Hold

4

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表A.3DNA文库的扩增

反应体系

组分每反应量（μL）

KAPAHiFiHotStartReadyMix(2X)25

TruSeqPrimer1.01.5

TruSeqPrimer2.01.5

连接产物22

总量50

反应程序

步骤温度时间循环

初始变性95℃3min1

变性98℃20sec

退火60℃15sec4

延伸72℃15sec

终延伸72℃1min1

HOLD4℃∞1

表A.4探针和文库的杂交

Illumina®LTadapter–ligatedlibraries

DNA文库1000ng

Cot-1DNA5μg即5μL

xGen®UniversalBlockers-TSMix*2μL

试剂体积（μL）

Nuclease-FreeWater1.8

HybridizationBufferEnhancer2.7

2×HybridizationBuffer8.5

表A.5产物富集

组分Concentratedbuffer（μL）Nuclease-FreeWater（μL）

2×BeadWashBuffer250250

10×WashBufferI30270

10×WashBufferⅡ20180

10×WashBufferⅢ20180

10×StringentWashBuffer40360

缓冲液每反应量（μL）缓冲液温度

10065℃

10×WashBufferI

200室温（15℃～25℃）

StringentWashBuffer40065℃

5

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表A.6靶向基因扩增

反应体系

组分每反应量（μL）

KAPAHiFiHotStartReadyMix(2X)25

TruSeqPrimer1.01.5

TruSeqPrimer2.01.5

富集杂交产物的磁珠22

总量50

反应程序

步骤温度时间循环

初始变性95℃3min1

变性