DB15∕T 3147-2023 番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程

ICS65.020

CCSB16

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3147—2023

番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程

Technicalcodeofpracticeforidentifyingpathogenoffusarium

crownandrootrotintomato

2023-08-25发布2023-09-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T3147—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学。

本文件主要起草人：杨永青、刘燕、高婧、张磊、宋培玲、皇甫海燕、贺小勇、史志丹、孙琴霞、

张欣昕、李秀萍、莎娜。

I

DB15/T3147—2023

番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程

1范围

本文件规定了番茄颈腐根腐病样品采集分离和保存、病原菌的致病性测定、病原菌的鉴定方法、结

果判定的技术要求。

本文件适用于番茄颈腐根腐病病原菌的室内鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

SN/T2589植物病原真菌检测规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

番茄颈腐根腐病fusariumcrownandrootrot

由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型（Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici，FORL）引起

的一种土传病害，主要症状表现为在土壤与植株茎基部交接处、环绕茎基部有明显的深褐色病斑，染病植株

直立但长势明显缓慢且下部叶片出现变黄、萎蔫的症状，病株的主根、侧根严重褐变、腐烂脱落，维管束褐

变，被侵染的植株在3～5片叶的幼苗期从发病部位折倒而萎蔫死亡。

致病性pathogenicity

病原物所具有的损害寄主并引起病害的特性。

4鉴定依据

以番茄颈腐根腐病发病症状、病原菌形态学特征、PCR产物及测序结果等为鉴定依据。番茄染病植

株的发病症状及尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的形态学特征参见附录A。

5主要仪器和试剂

主要仪器

1

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高压灭菌锅、超纯水系统、恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜、高速冷冻离心机、PCR仪、电

泳仪、凝胶成像系统、旋涡振荡器、电子天平等。

主要试剂

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）、绿豆琼脂培养基（绿豆粉6g，

琼脂粉4g，溶于200mL蒸馏水）；真菌基因组提取试剂盒、2×PCRMix、琼脂糖、50×TAE电泳液、

DL2000DNAMarker，次氯酸钠、无水乙醇、硫酸链霉素等均为国产分析纯试剂。

6样品采集、分离和保存

样品采集及分离

在番茄种植地采集疑似病株，用于病原菌的分离，冷藏保存备用，同时记录采样地点和时间。

按照SN/T2589进行发病组织分离培养，将表面消毒的10个组织块置于PDA平板（含500μg/mL

硫酸链霉素），于25℃恒温培养。5d后待培养皿中组织块周围长出菌丝，从菌落边缘挑取少量菌丝体

和分生孢子置于无菌水中制成分生孢子悬浮液，取100μL涂布于PDA培养基，连续纯化2～3次获得

病原菌的纯培养物。以“年份-采样地-序号”进行编号，备用。

菌种保存

在长满菌丝的PDA培养基3/4处，用打孔器取直径为5mm的菌丝块，装入1.5mL的无菌离心管

或菌种保存管中（4～8个菌丝块/管），加入1.0mL～2.0mL已灭菌的40%甘油或20%二甲基亚砜，液

氮速冻后-80℃低温冰箱中保存6～12个月；或将病原菌的PDA平板用封口膜密封，保存于4℃～8℃

冷藏1～2个月。

7病原菌的致病性测定

种子处理及育苗

播种前，种子放入50℃～55℃的温水中浸种15min～20min,基质提前在105℃烘箱中干热处

理2h，使用灭菌基质在72孔穴盘中育苗。

病原菌回接

病原菌于PDA平板上活化培养5d，接种于马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，25℃、150r/min

振荡培养7d，4层无菌纱布过滤，用血球计数板计数并调节孢子液浓度至1×107个/mL；番茄幼苗长

至3～4叶期，每株幼苗根系周围灌入30mL孢子液，同一病原菌接种10株番茄幼苗，以接种无菌水的

5株幼苗为对照。置于20℃±2℃、16h光照/8h黑暗人工气候室中。接种30d后，观察并记录发

病情况。若植株发病症状与田间症状一致，需从发病植株上再次分离、鉴定病原菌。

8病原菌的鉴定方法

形态学鉴定

25℃恒温条件下培养7d，病原菌在PDA培养基或绿豆培养基上气生菌丝发达，菌丝呈白色绒毛

状、容易挑起，菌落圆形、背面产生紫色色素；PDB振荡培养条件下，病原菌产生卵圆形的小型分生孢

2

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子，无隔或1个隔膜；大型分生孢子呈镰刀型，多为1～2个隔膜；连续培养5d后可见顶生、间生或

串生的厚垣孢子，厚垣孢子多数呈球形，半透明。参见附录A。

PCR鉴定

8.2.1基因组DNA的提取

将20mLPDB装入50mL三角瓶，121℃高压灭菌15min，冷却后接种病原菌，25℃、150r/min

振荡培养3d～4d，收集菌丝，采用真菌基因组提取试剂盒提取DNA。1%琼脂糖电泳检测后，保存于

-20℃，备用。

8.2.2PCR检测鉴定

利用真菌核糖体基因转录间隔区ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增病原菌的rDNA-ITS区，同时采用翻译延长因子TEF-1α的扩增引物

ef1(5'-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3')和ef2(5'-GGAGGTACCAGTCATCATGTT-3')扩增TEF-1α序列，PCR扩

增的目的片段长度分别为530bp、750bp，测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，待测菌株扩

增片段的序列与尖孢镰刀菌的相应序列相似性均超过99%。PCR反应体系及扩增条件参见附录B。

再采用尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型特异性引物进行PCR扩增，根据目的条带将番茄颈腐根

腐病菌（FORL）和番茄枯萎病菌（FOL）的不同生理小种进行区分，引物序列及PCR扩增方法参见附录

B。

9结果判定

经形态学鉴定，与附录A描述的形态相似的分离物可初步判断为镰刀菌属；病原菌的ITS和TEF-1α

基因扩增产物与目的片段大小一致，且测序结果与数据库中尖孢镰刀菌的相似度超过99%，可判定为尖

孢镰刀菌；通过特异性引物PCR扩增，引物unif/unir和sprlf/sprlr分别扩增得670bp和947bp目的条

带，而sp13f/sp13r、sp23f/sp23r无条带，则判定为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型（FORL）。

3

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A

A

附录A

（资料性）

番茄颈腐根腐病的典型症状及病原菌形态学描述

番茄定植后出现植株直立但长势明显缓慢且下部叶片出现变黄、萎蔫的症状（红色虚线框内）见图

A.1中A。

植株主根、侧根严重褐变、腐烂脱落，不长新根（C图为B图红色框内区域放大）见图A.1中B、C。

图A.1番茄颈腐根腐病田间发病植株及症状

颈腐根腐病菌分离株在PDA培养基上的菌落正面（A）和反面（B）见图A.2。

图A.2颈腐根腐病菌分离株在PDA培养基上的菌落正面（A）和反面（B）

4

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PDB培养条件下厚垣孢子，间生、顶生或串生，圆形略透明见图A.3中A、D、E、F。

绿豆培养基上产生大量分生孢子，形状呈镰刀状；大型分生孢子多为1～2个隔膜，小型分生孢子呈

卵圆形，通常无隔或有1个隔膜；图B中标尺a表示50μm，其余均为20μm，如图C中标尺b所示，见图

A.3。

图A.3颈腐根腐病菌分离株的孢子形态

5

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B

B

附录B

（资料性）

PCR反应体系及扩增条件

PCR扩增病原菌ITS和EF-1α基因的PCR反应体系（25μL）为：2×PCRmasterMix12.5μL,正向

引物、反向引物（10μM）各0.5μL，DNA模板（50~100ng/µL）1.0μL，ddH2O10.5μL。PCR扩

增条件:94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃

延伸10min。

B.1尖孢镰刀菌专化型特异性引物见表B.1中所示：

表B.1

引物名称序列5’-3’片段长度

unifATCATCTTGTGCCAACTTCAG670～672bp

unirGTTTGTGATCTTTGAGTTGCCA

sp13fGTCAGTCCATTGGCTCTCTC445bp

sp13rTCCTTGACACCATCACAGAG

sp23fCCTCTTGTCTTTGTCTCACGA518bp

sp23rGCAACAGGTCGTGGGGAAAA

sprlfGATGGTGGAACGGTATGACC947bp

sprlrCCATCAC