免疫学试验做法

免疫学试验做法一、免疫学试验概述

免疫学试验是研究机体免疫系统功能、结构和代谢等的实验方法，广泛应用于医学、生物学、食品科学等领域。本指南将介绍免疫学试验的基本原则、常用方法和操作步骤，帮助实验人员规范操作，确保试验结果的准确性和可靠性。

二、免疫学试验的基本原则

（一）试验设计

1.明确试验目的：确定要研究的免疫学问题，如抗体生成、细胞增殖、细胞凋亡等。

2.选择合适的试验模型：根据研究目的选择合适的实验动物或细胞模型。

3.设置对照组：设立阴性对照和阳性对照，以排除干扰因素。

（二）试剂和材料准备

1.试剂选择：选用高质量、低批间差异的试剂，如抗体、细胞因子、酶标试剂等。

2.试剂配制：严格按照说明书配制，确保浓度准确。

3.材料准备：准备好实验所需的容器、器械、培养基等。

（三）实验操作规范

1.无菌操作：所有实验过程需在无菌条件下进行，防止污染。

2.标记清晰：所有试剂和样品需标记清楚，避免混淆。

3.记录详细：详细记录实验步骤、观察结果和数据处理过程。

三、常用免疫学试验方法

（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.固定抗原：将抗原包被在酶标板孔中，4℃过夜。

2.封闭非特异性结合位点：用封闭液封闭板孔，室温孵育1小时。

3.加入待测样品：将待测样品加入板孔，室温孵育1小时。

4.加入酶标二抗：将酶标二抗加入板孔，室温孵育1小时。

5.底物显色：加入底物，避光孵育30分钟。

6.终止反应：加入终止液，终止酶反应。

7.结果测定：用酶标仪测定吸光度值，计算样品浓度。

（二）流式细胞术（FCM）

1.细胞制备：收集细胞，洗涤并重悬。

2.细胞染色：加入荧光标记抗体，4℃孵育30分钟。

3.上机检测：将细胞悬液加入流式细胞仪，设置检测参数。

4.数据分析：用流式细胞软件分析细胞表面标志物表达情况。

（三）细胞增殖试验

1.细胞接种：将细胞接种在96孔板中，培养24小时。

2.加入刺激物：加入待测刺激物，继续培养。

3.MTT法检测：加入MTT溶液，孵育4小时。

4.溶解结晶：加入溶媒，振荡溶解结晶。

5.结果测定：用酶标仪测定吸光度值，计算细胞增殖情况。

四、试验结果分析

（一）数据统计

1.计算平均值和标准差：对重复实验数据进行统计。

2.绘制图表：用柱状图、折线图等展示数据变化趋势。

3.方差分析：用ANOVA等方法分析数据差异显著性。

（二）结果解读

1.对比对照组：分析实验组与对照组的差异。

2.结合文献：参考相关文献，解释实验结果。

3.提出建议：根据结果提出进一步研究方向。

五、注意事项

（一）试剂保存

1.室温保存：部分试剂需室温保存，避免冷冻。

2.冷冻保存：酶标试剂等需冷冻保存，避免反复冻融。

3.避光保存：荧光标记抗体等需避光保存，防止降解。

（二）实验安全

1.个人防护：佩戴实验服、手套、护目镜等。

2.废物处理：实验废弃物需分类处理，避免污染环境。

3.设备维护：定期检查实验设备，确保正常运行。

**一、免疫学试验概述**

免疫学试验是研究机体免疫系统功能、结构和代谢等的实验方法，广泛应用于医学、生物学、食品科学等领域。本指南将介绍免疫学试验的基本原则、常用方法和操作步骤，帮助实验人员规范操作，确保试验结果的准确性和可靠性。

二、免疫学试验的基本原则

（一）试验设计

1.明确试验目的：确定要研究的免疫学问题，如抗体生成、细胞增殖、细胞凋亡、细胞因子分泌、免疫细胞亚群分析等。目的应具体、可衡量，避免过于宽泛。

（1）例如，研究某种刺激物对特定细胞增殖的影响，目的应明确为“检测刺激物X在浓度A、B、C下对B细胞72小时增殖率的影响”。

2.选择合适的试验模型：根据研究目的选择合适的实验动物或细胞模型。

（1）动物模型：需考虑动物的物种、品系、年龄、性别、免疫背景等因素。例如，小鼠常用于细胞因子研究，因其易于操作且成本较低；大鼠则可能用于更复杂的免疫病理学研究。

（2）细胞模型：需根据目标细胞类型选择。例如，T细胞增殖试验常用外周血淋巴细胞（PBMC）或特定T细胞亚群；细胞因子分泌试验常用原代细胞或细胞系。

3.设置对照组：设立阴性对照和阳性对照，以排除干扰因素，验证试验方法的可靠性。

（1）阴性对照：不包含刺激物或关键试剂的对照，用于检测非特异性结合、背景信号等。例如，在ELISA中，不加样品或抗体的孔作为阴性对照。

（2）阳性对照：包含已知阳性结果的对照，用于验证试验系统是否正常工作。例如，在细胞增殖试验中，加入已知刺激物的孔作为阳性对照。

（二）试剂和材料准备

1.试剂选择：选用高质量、低批间差异的试剂，如抗体、细胞因子、酶标试剂、培养基、血清等。优先选择知名品牌或经过验证的试剂。

（1）抗体选择：需注意抗体的特异性（针对目标抗原）、亲和力（结合强度）、克隆性（单克隆或多克隆）以及种属反应性。

（2）细胞因子选择：需确保细胞因子纯度高、活性检测合格。

2.试剂配制：严格按照说明书配制，确保浓度准确。配制好的试剂需妥善保存。

（1）抗体工作浓度：需通过预实验确定最佳工作浓度，避免过高（导致背景高）或过低（导致信号弱）。

（2）培养基补充：根据细胞类型添加适量的血清、双抗（青霉素和链霉素）、L-谷氨酰胺等。

3.材料准备：准备好实验所需的容器、器械、培养基等。

（1）容器：需根据实验类型选择合适的容器，如酶标板、细胞培养板、试管、离心管等。需确保容器洁净，无污染。

（2）器械：如移液器、pipettetips、显微镜、离心机、水浴锅、酶标仪、流式细胞仪等。需确保器械功能正常，定期校准。

（3）培养基：需根据细胞类型选择合适的培养基，如DMEM、RPMI-1640等。需确保培养基无菌，在有效期内使用。

（三）实验操作规范

1.无菌操作：所有涉及细胞或组织的实验过程需在无菌条件下进行，防止污染。

（1）操作环境：需在超净工作台或生物安全柜中进行。

（2）操作步骤：手部消毒、穿戴无菌手套、使用无菌吸管和移液器、避免说话和咳嗽等。

2.标记清晰：所有试剂和样品需标记清楚，避免混淆。

（1）标记内容：包括样品名称、编号、实验组别、操作日期、浓度等信息。

（2）标记方式：使用标签贴或电子标签，确保字迹清晰、牢固。

3.记录详细：详细记录实验步骤、观察结果和数据处理过程。

（1）记录方式：使用实验记录本或电子记录系统。

（2）记录内容：包括实验日期、时间、操作人、试剂名称和浓度、实验步骤、观察结果（如细胞状态、颜色变化等）、数据（如吸光度值、细胞计数等）、问题及解决方案等。

三、常用免疫学试验方法

（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.固定抗原：将抗原包被在酶标板孔中，4℃过夜。

（1）抗原准备：根据实验目的选择合适抗原，如重组蛋白、多肽、天然蛋白等。需确定抗原浓度，并进行预实验确定最佳包被浓度。

（2）包被液：常用碳酸盐缓冲液（pH9.6）或硼酸盐缓冲液（pH8.0）。

（3）包被步骤：

（1）用移液器吸取包被液，洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入抗原溶液，每孔100-200μL，封口膜封口，4℃孵育过夜。

2.封闭非特异性结合位点：用封闭液封闭板孔，室温孵育1小时。

（1）封闭液：常用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉溶液。

（2）封闭步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入封闭液，每孔100-200μL，封口膜封口，室温孵育1小时。

3.加入待测样品：将待测样品加入板孔，室温孵育1小时。

（1）样品处理：根据实验需要，可能需要对样品进行稀释或前处理（如灭活）。

（2）孵育步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入待测样品，每孔100-200μL，封口膜封口，室温孵育1小时。

4.加入酶标二抗：将酶标二抗加入板孔，室温孵育1小时。

（1）二抗选择：需与包被抗原或一抗的种属来源相对应。

（2）二抗工作浓度：需通过预实验确定最佳工作浓度。

（3）孵育步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入酶标二抗，每孔100-200μL，封口膜封口，室温孵育1小时。

5.底物显色：加入底物，避光孵育30分钟。

（1）底物选择：常用TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）或ABTS（2,2'-Azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）。

（2）显色步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入底物溶液，每孔100-200μL，避光孵育30分钟。

6.终止反应：加入终止液，终止酶反应。

（1）终止液：常用2MH₂SO₄或1MHCl。

（2）终止步骤：

（1）迅速加入终止液，每孔100-200μL，混匀。

7.结果测定：用酶标仪测定吸光度值，计算样品浓度。

（1）测定波长：根据底物选择合适的测定波长，如TMB常用450nm，ABTS常用405nm。

（2）数据分析：用酶标仪软件或Excel等工具分析数据，计算样品浓度。需扣除空白孔的吸光度值。

（二）流式细胞术（FCM）

1.细胞制备：收集细胞，洗涤并重悬。

（1）细胞收集：根据细胞类型选择合适的收集方法，如离心、过滤等。

（2）洗涤：用PBS或细胞培养基洗涤细胞，去除残留的培养液或血液。

（3）重悬：用适量PBS或细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至合适范围（如1×10⁶-1×10⁸cells/mL）。

2.细胞染色：加入荧光标记抗体，4℃孵育30分钟。

（1）抗体选择：根据实验目的选择合适的荧光标记抗体，需注意抗体的荧光颜色和种属反应性。

（2）抗体浓度：需通过预实验确定最佳工作浓度。

（3）染色步骤：

（1）用洗涤液洗涤细胞，去除残留的培养基或血清。

（2）加入荧光标记抗体，避光孵育30分钟。

3.上机检测：将细胞悬液加入流式细胞仪，设置检测参数。

（1）细胞浓度：根据仪器要求调整细胞浓度。

（2）设置参数：选择合适的荧光通道和检测参数，如电压、阈值等。

（3）运行实验：启动流式细胞仪，收集数据。

4.数据分析：用流式细胞软件分析细胞表面标志物表达情况。

（1）设门：根据细胞特征（如前向散射和侧向散射）设立分析门，排除细胞碎片和其他杂质。

（2）分析指标：常用指标包括细胞数量、荧光强度、细胞亚群比例等。

（3）统计分析：用流式细胞软件或Excel等工具进行统计分析，如计算平均值、标准差、绘制图表等。

（三）细胞增殖试验

1.细胞接种：将细胞接种在96孔板中，培养24小时。

（1）细胞浓度：根据细胞类型和生长特性选择合适的接种密度。

（2）接种步骤：

（1）用移液器吸取细胞悬液，加入96孔板中，每孔100-200μL。

（2）将96孔板置于培养箱中，37℃、5%CO₂培养24小时。

2.加入刺激物：加入待测刺激物，继续培养。

（1）刺激物：根据实验目的选择合适的刺激物，如细胞因子、药物等。

（2）刺激步骤：

（1）用洗涤液洗涤细胞，去除残留的培养基。

（2）加入待测刺激物，每孔加入适量刺激物。

（3）将96孔板置于培养箱中，继续培养。

3.MTT法检测：加入MTT溶液，孵育4小时。

（1）MTT溶液：用无血清培养基稀释MTT溶液至合适浓度，如0.5mg/mL。

（2）孵育步骤：

（1）用洗涤液洗涤细胞，去除残留的培养基。

（2）加入MTT溶液，每孔20-50μL，孵育4小时。

4.溶解结晶：加入溶媒，振荡溶解结晶。

（1）溶媒：常用DMSO或无水乙醇。

（2）溶解步骤：

（1）小心吸弃MTT溶液，避免吸弃培养基。

（2）加入溶媒，每孔100-200μL，振荡溶解结晶。

5.结果测定：用酶标仪测定吸光度值，计算细胞增殖情况。

（1）测定波长：MTT法常用570nm，参考波长常用630nm。

（2）数据分析：用酶标仪软件或Excel等工具分析数据，计算细胞增殖率。细胞增殖率计算公式：

细胞增殖率=(实验组吸光度值-阴性对照组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%

四、试验结果分析

（一）数据统计

1.计算平均值和标准差：对重复实验数据进行统计。

（1）重复实验：每个实验组至少进行3次重复实验，以提高数据的可靠性。

（2）统计方法：用Excel或统计软件计算平均值和标准差。

2.绘制图表：用柱状图、折线图等展示数据变化趋势。

（1）图表类型：根据数据类型选择合适的图表类型。

（2）图表绘制：用Excel或统计软件绘制图表，并标注清楚图例、坐标轴等。

3.方差分析：用ANOVA等方法分析数据差异显著性。

（1）方差分析：用ANOVA等方法分析不同实验组之间的差异是否具有统计学意义。

（2）多重比较：如果多个实验组之间有显著差异，需要进行多重比较，如TukeyHSD检验等。

（二）结果解读

1.对比对照组：分析实验组与对照组的差异。

（1）例如，在细胞增殖试验中，比较实验组细胞的增殖率与阴性对照组细胞的增殖率。

2.结合文献：参考相关文献，解释实验结果。

（1）查阅相关文献，了解该领域的最新研究进展和已有结论。

（2）将实验结果与文献进行比较，解释实验结果的生物学意义。

3.提出建议：根据结果提出进一步研究方向。

（1）根据实验结果，提出可能的解释和假设。

（2）根据实验结果，提出进一步研究的方向和建议。

五、注意事项

（一）试剂保存

1.室温保存：部分试剂需室温保存，避免冷冻。

（1）例如，某些酶标试剂、荧光标记抗体等。

（2）需根据说明书要求，在室温条件下保存。

2.冷冻保存：酶标试剂等需冷冻保存，避免反复冻融。

（1）例如，某些细胞因子、抗体等。

（2）需用冻存管分装，避免反复冻融。

3.避光保存：荧光标记抗体等需避光保存，防止降解。

（1）例如，荧光标记抗体、某些酶标试剂等。

（2）需用棕色瓶或避光容器保存。

（二）实验安全

1.个人防护：佩戴实验服、手套、护目镜等。

（1）实验服：需选择合适的实验服，避免污染。

（2）手套：需选择合适的手套，避免接触有害试剂。

（3）护目镜：需佩戴护目镜，避免有害试剂溅入眼睛。

2.废物处理：实验废弃物需分类处理，避免污染环境。

（1）分类处理：实验废弃物需分类处理，如化学废弃物、生物废弃物等。

（2）无害化处理：实验废弃物需进行无害化处理，如灭菌、焚烧等。

3.设备维护：定期检查实验设备，确保正常运行。

（1）定期校准：定期校准实验设备，如移液器、酶标仪等。

（2）清洁保养：定期清洁保养实验设备，避免污染。

（3）故障排除：及时排除实验设备的故障，确保实验顺利进行。

一、免疫学试验概述

免疫学试验是研究机体免疫系统功能、结构和代谢等的实验方法，广泛应用于医学、生物学、食品科学等领域。本指南将介绍免疫学试验的基本原则、常用方法和操作步骤，帮助实验人员规范操作，确保试验结果的准确性和可靠性。

二、免疫学试验的基本原则

（一）试验设计

1.明确试验目的：确定要研究的免疫学问题，如抗体生成、细胞增殖、细胞凋亡等。

2.选择合适的试验模型：根据研究目的选择合适的实验动物或细胞模型。

3.设置对照组：设立阴性对照和阳性对照，以排除干扰因素。

（二）试剂和材料准备

1.试剂选择：选用高质量、低批间差异的试剂，如抗体、细胞因子、酶标试剂等。

2.试剂配制：严格按照说明书配制，确保浓度准确。

3.材料准备：准备好实验所需的容器、器械、培养基等。

（三）实验操作规范

1.无菌操作：所有实验过程需在无菌条件下进行，防止污染。

2.标记清晰：所有试剂和样品需标记清楚，避免混淆。

3.记录详细：详细记录实验步骤、观察结果和数据处理过程。

三、常用免疫学试验方法

（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.固定抗原：将抗原包被在酶标板孔中，4℃过夜。

2.封闭非特异性结合位点：用封闭液封闭板孔，室温孵育1小时。

3.加入待测样品：将待测样品加入板孔，室温孵育1小时。

4.加入酶标二抗：将酶标二抗加入板孔，室温孵育1小时。

5.底物显色：加入底物，避光孵育30分钟。

6.终止反应：加入终止液，终止酶反应。

7.结果测定：用酶标仪测定吸光度值，计算样品浓度。

（二）流式细胞术（FCM）

1.细胞制备：收集细胞，洗涤并重悬。

2.细胞染色：加入荧光标记抗体，4℃孵育30分钟。

3.上机检测：将细胞悬液加入流式细胞仪，设置检测参数。

4.数据分析：用流式细胞软件分析细胞表面标志物表达情况。

（三）细胞增殖试验

1.细胞接种：将细胞接种在96孔板中，培养24小时。

2.加入刺激物：加入待测刺激物，继续培养。

3.MTT法检测：加入MTT溶液，孵育4小时。

4.溶解结晶：加入溶媒，振荡溶解结晶。

5.结果测定：用酶标仪测定吸光度值，计算细胞增殖情况。

四、试验结果分析

（一）数据统计

1.计算平均值和标准差：对重复实验数据进行统计。

2.绘制图表：用柱状图、折线图等展示数据变化趋势。

3.方差分析：用ANOVA等方法分析数据差异显著性。

（二）结果解读

1.对比对照组：分析实验组与对照组的差异。

2.结合文献：参考相关文献，解释实验结果。

3.提出建议：根据结果提出进一步研究方向。

五、注意事项

（一）试剂保存

1.室温保存：部分试剂需室温保存，避免冷冻。

2.冷冻保存：酶标试剂等需冷冻保存，避免反复冻融。

3.避光保存：荧光标记抗体等需避光保存，防止降解。

（二）实验安全

1.个人防护：佩戴实验服、手套、护目镜等。

2.废物处理：实验废弃物需分类处理，避免污染环境。

3.设备维护：定期检查实验设备，确保正常运行。

**一、免疫学试验概述**

免疫学试验是研究机体免疫系统功能、结构和代谢等的实验方法，广泛应用于医学、生物学、食品科学等领域。本指南将介绍免疫学试验的基本原则、常用方法和操作步骤，帮助实验人员规范操作，确保试验结果的准确性和可靠性。

二、免疫学试验的基本原则

（一）试验设计

1.明确试验目的：确定要研究的免疫学问题，如抗体生成、细胞增殖、细胞凋亡、细胞因子分泌、免疫细胞亚群分析等。目的应具体、可衡量，避免过于宽泛。

（1）例如，研究某种刺激物对特定细胞增殖的影响，目的应明确为“检测刺激物X在浓度A、B、C下对B细胞72小时增殖率的影响”。

2.选择合适的试验模型：根据研究目的选择合适的实验动物或细胞模型。

（1）动物模型：需考虑动物的物种、品系、年龄、性别、免疫背景等因素。例如，小鼠常用于细胞因子研究，因其易于操作且成本较低；大鼠则可能用于更复杂的免疫病理学研究。

（2）细胞模型：需根据目标细胞类型选择。例如，T细胞增殖试验常用外周血淋巴细胞（PBMC）或特定T细胞亚群；细胞因子分泌试验常用原代细胞或细胞系。

3.设置对照组：设立阴性对照和阳性对照，以排除干扰因素，验证试验方法的可靠性。

（1）阴性对照：不包含刺激物或关键试剂的对照，用于检测非特异性结合、背景信号等。例如，在ELISA中，不加样品或抗体的孔作为阴性对照。

（2）阳性对照：包含已知阳性结果的对照，用于验证试验系统是否正常工作。例如，在细胞增殖试验中，加入已知刺激物的孔作为阳性对照。

（二）试剂和材料准备

1.试剂选择：选用高质量、低批间差异的试剂，如抗体、细胞因子、酶标试剂、培养基、血清等。优先选择知名品牌或经过验证的试剂。

（1）抗体选择：需注意抗体的特异性（针对目标抗原）、亲和力（结合强度）、克隆性（单克隆或多克隆）以及种属反应性。

（2）细胞因子选择：需确保细胞因子纯度高、活性检测合格。

2.试剂配制：严格按照说明书配制，确保浓度准确。配制好的试剂需妥善保存。

（1）抗体工作浓度：需通过预实验确定最佳工作浓度，避免过高（导致背景高）或过低（导致信号弱）。

（2）培养基补充：根据细胞类型添加适量的血清、双抗（青霉素和链霉素）、L-谷氨酰胺等。

3.材料准备：准备好实验所需的容器、器械、培养基等。

（1）容器：需根据实验类型选择合适的容器，如酶标板、细胞培养板、试管、离心管等。需确保容器洁净，无污染。

（2）器械：如移液器、pipettetips、显微镜、离心机、水浴锅、酶标仪、流式细胞仪等。需确保器械功能正常，定期校准。

（3）培养基：需根据细胞类型选择合适的培养基，如DMEM、RPMI-1640等。需确保培养基无菌，在有效期内使用。

（三）实验操作规范

1.无菌操作：所有涉及细胞或组织的实验过程需在无菌条件下进行，防止污染。

（1）操作环境：需在超净工作台或生物安全柜中进行。

（2）操作步骤：手部消毒、穿戴无菌手套、使用无菌吸管和移液器、避免说话和咳嗽等。

2.标记清晰：所有试剂和样品需标记清楚，避免混淆。

（1）标记内容：包括样品名称、编号、实验组别、操作日期、浓度等信息。

（2）标记方式：使用标签贴或电子标签，确保字迹清晰、牢固。

3.记录详细：详细记录实验步骤、观察结果和数据处理过程。

（1）记录方式：使用实验记录本或电子记录系统。

（2）记录内容：包括实验日期、时间、操作人、试剂名称和浓度、实验步骤、观察结果（如细胞状态、颜色变化等）、数据（如吸光度值、细胞计数等）、问题及解决方案等。

三、常用免疫学试验方法

（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.固定抗原：将抗原包被在酶标板孔中，4℃过夜。

（1）抗原准备：根据实验目的选择合适抗原，如重组蛋白、多肽、天然蛋白等。需确定抗原浓度，并进行预实验确定最佳包被浓度。

（2）包被液：常用碳酸盐缓冲液（pH9.6）或硼酸盐缓冲液（pH8.0）。

（3）包被步骤：

（1）用移液器吸取包被液，洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入抗原溶液，每孔100-200μL，封口膜封口，4℃孵育过夜。

2.封闭非特异性结合位点：用封闭液封闭板孔，室温孵育1小时。

（1）封闭液：常用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉溶液。

（2）封闭步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入封闭液，每孔100-200μL，封口膜封口，室温孵育1小时。

3.加入待测样品：将待测样品加入板孔，室温孵育1小时。

（1）样品处理：根据实验需要，可能需要对样品进行稀释或前处理（如灭活）。

（2）孵育步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入待测样品，每孔100-200μL，封口膜封口，室温孵育1小时。

4.加入酶标二抗：将酶标二抗加入板孔，室温孵育1小时。

（1）二抗选择：需与包被抗原或一抗的种属来源相对应。

（2）二抗工作浓度：需通过预实验确定最佳工作浓度。

（3）孵育步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入酶标二抗，每孔100-200μL，封口膜封口，室温孵育1小时。

5.底物显色：加入底物，避光孵育30分钟。

（1）底物选择：常用TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）或ABTS（2,2'-Azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）。

（2）显色步骤：

（1）用洗涤液洗涤酶标板，每次洗涤后弃去洗涤液。

（2）加入底物溶液，每孔100-200μL，避光孵育30分钟。

6.终止反应：加入终止液，终止酶反应。

（1）终止液：常用2MH₂SO₄或1MHCl。

（2）终止步骤：

（1）迅速加入终止液，每孔100-200μL，混匀。

7.结果测定：用酶标仪测定吸光度值，计算样品浓度。

（1）测定波长：根据底物选择合适的测定波长，如TMB常用450nm，ABTS常用405nm。

（2）数据分析：用酶标仪软件或Excel等工具分析数据，计算样品浓度。需扣除空白孔的吸光度值。

（二）流式细胞术（FCM）

1.细胞制备：收集细胞，洗涤并重悬。

（1）细胞收集：根据细胞类型选择合适的收集方法，如离心、过滤等。

（2）洗涤：用PBS或细胞培养基洗涤细胞，去除残留的培养液或血液。

（3）重悬：用适量PBS或细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至合适范围（如1×10⁶-1×10⁸cells/mL）。

2.细胞染色：加入荧光标记抗体，4℃孵育30分钟。

（1）抗体选择：根据实验目的选择合适的荧光标记抗体，需注意抗体的荧光颜色和种属反应性。

（2）抗体浓度：需通过预实验确定最佳工作浓度。

（3）染色步骤：

（1）用洗涤液洗涤细胞，去除残留的培养基或血清。

（2）加入荧光标记抗体，避光孵育30分钟。

3.上机检测：将细胞悬液加入流式细胞仪，设置检测参数。

（1）细胞浓度：根据仪器要求调整细胞浓度。

（2）设置参数：选择合适的荧光通道和检测参数，如电压、阈值等。

（3）运行实验：启动流式细胞仪，收集数据。

4.数据分析：用流式细胞软件分析细胞表面标志物表达情况。

（1）设门：根据细胞特征（如前向散射和侧向散射）设立分析门，排除细胞碎片和其他杂质。

（2）分析指标：常用指标包括细胞数量、荧光强度、细胞亚群比例等。

（3）统计分析：用流式细胞软件或Excel等工具进行统计分析，如计算平均值、标准差、绘制图表等。

（三）细胞增殖试验

1.细胞接种：将细胞接种在96孔板中，培养24小时。

（1）细胞浓度：根据细胞类型和生长特性选择合适的接种密度。

（2）接种步骤：

（1）用移液器吸取细胞悬液，加入96孔板中，每孔100-200μL。

（2）将96孔板置于培养箱中，37℃、5%CO₂培养24小时。

2.加入刺激物：加入待测刺激物，继续培养。

（1）刺激物：根据实验目的选择合适的刺激物，如细胞因子、药物等。

（2）刺激步骤：

（1）用洗涤液洗涤细胞，去除残留的培养基。

（2）加入待测刺激物，每孔加入适量刺激物。

（3）将96孔板置于培养箱中，继续培养。

3.MTT法检测：加入MTT溶液，孵育4小时。

（1）MTT溶液：用无血清培养基稀释MTT溶液至合适浓度，如0.5mg/mL。

（2）孵育步骤：

（1）用洗涤液洗涤细胞，去除残留的培养基。

（2）加入MTT溶液，每孔20-50μL，孵育4小时。

4.溶解结晶：加入溶媒，振荡溶解结晶。

（1）溶媒：常用DMSO或无水乙醇。

（2）溶解步骤：

（1）小心吸弃MTT溶液，避免吸弃培养基。

（2）加入溶媒，每孔100-200μL，振荡溶解结晶。

5.结果测定：用酶