DB15∕T 2602-2022 苜蓿中咪草烟残留量的测定 高效液相色谱法

ICS65.020.01

CCSB25

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2602—2022

苜蓿中咪草烟残留量的测定

高效液相色谱法

DeterminationofImazethapyrresidueinalfalfa-Highperformanceliquid

chromatography

2022-06-24发布2022-07-24实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2602—2022

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5试剂和材料.........................................................................1

6仪器和设备.........................................................................2

7试样制备...........................................................................2

8测定步骤...........................................................................2

9结果计算和表示.....................................................................3

10精密度............................................................................4

附录A（资料性）高效液相色谱法测定咪草烟标准溶液色谱法...............................5

I

DB15/T2602—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农畜产品质量安全中心、内蒙古自治

区产品质量检验研究院、太仆寺旗现代农牧业综合服务中心。

本文件主要起草人：吴洪新、王文曦、云颖、盈盈、付慧、黄奕颖、杨红东、姚继红、王冠、云岩

春、张慧泽、刘洪林、卫媛、李薇、李润航、降晓伟、李坤娜、张燕东、刘宇宁、湖日尔、刘江英、赵

志惠。

II

DB15/T2602—2022

苜蓿中咪草烟残留量的测定

高效液相色谱法

1范围

本文件规定了高效液相色谱法测定苜蓿中咪草烟残留量的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制

备、测定步骤、结果计算和表示、精密度。

本文件适用于苜蓿中咪草烟残留量的测定。

本文件的检出限为0.025mg/kg。

本文件的定量限为0.10mg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14699.1饲料采样

GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中咪草烟残留物样品经过甲醇和碳酸钠提取液提取、离心、萃取、旋蒸，用离子交换型（SCX）

固相萃取小柱净化，甲醇和氨水洗脱，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。

5试剂和材料

乙腈（CH3CN）：色谱纯。

甲醇（CH3OH）：色谱纯。

磷酸（H3PO4）：优级纯。

二氯甲烷（CH2Cl2）。

冰乙酸（CH3COOH）：优级纯。

氨水（NH4OH）。

无水硫酸钠（Na2SO4）：优级纯。

碳酸钠（Na2CO3）：优级纯。

碳酸钠溶液（0.1mol/L）：称取10.6g碳酸钠，用水溶解，定容至1L容量瓶中。

1

DB15/T2602—2022

甲醇-碳酸钠溶液（1+1，v/v）：量取100mL甲醇，加入100mL碳酸钠溶液（5.9），混匀。

磷酸溶液（1+9，v/v）：量取10mL磷酸，用水稀释定容至100mL。

氨水-甲醇（1+9，v/v）：量取10mL氨水，加入90mL甲醇，混匀。

水+甲醇（1+9，v/v）：量取10mL水，加入90mL甲醇，混匀。

乙酸溶液（5+95，v/v）：量取5mL冰乙酸，用水稀释定容至100mL。

标准品：咪草烟（C15H19N3O3）：纯度不小于95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物

质。

标准储备液(1.00mg/mL)：准确称取适量的咪草烟标准物质，用甲醇溶解并配制成(1.00mg/mL)

的标准储备液，保存于-18℃冰箱内，可使用6个月。

标准使用液：准确吸取0.10mL咪草烟的标准储备液(5.16)至10mL容量瓶内，用甲醇稀释定容

至刻度，配制成10.0μg/mL的标准溶液，于-18℃冰箱内避光保存，可使用1个月。

标准系列工作液：分别吸取浓度为10.0μg/mL咪草烟标准液0.25mL、0.50mL、1.00mL、

1.50mL、2.00mL于10.00mL容量瓶，用水+甲醇(5.13)定容至刻度，该标准系列咪草烟浓度分别为

0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、1.50μg/mL、2.00μg/mL。

固相萃取柱：SCX，60mg/3mL。

微孔过滤膜（尼龙）：13mm×0.22µm。

注：除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682所规定的一级水。

6仪器和设备

高效液相色谱仪：配有紫外检测器（或二极管阵列检测器）。

电子天平：感量0.01mg和0.01g。

离心机：转速大于等于4000r/min。

超声波水浴。

旋转蒸发仪。

涡旋混合器。

氮吹仪。

组织粉碎机。

样品筛：筛孔尺寸1.0mm。

7试样制备

按照GB/T14699.1中有关规定采集样品，去杂质后充分混匀，按照GB/T20195制备试样，利用四分

法取样后，充分研磨，过1.0mm筛，新鲜样品利用四分法取样后，充分破碎作为分析样品备用，将处理

好的试样放置-18℃冰箱保存。

8测定步骤

提取

准确称取苜蓿新鲜样品5g（精确至0.01g）或草粉2g（精确至0.01g）于50mL的塑料离心管中，

加入30mL的甲醇-碳酸钠溶液（5.10），混匀，超声提取30min，用磷酸溶液（5.11）调至pH=2.5，于

4000r/min离心10min，收集上清液于分液漏斗中，用50mL二氯甲烷（5.4）萃取两次（25mL+25mL），

2

DB15/T2602—2022

有机相加适量无水硫酸钠（5.7）除水后收集于旋转蒸发瓶中，于45℃减压蒸至近干，加适量甲醇（5.2）

溶解。

净化

强阳离子交换固相萃取柱SCX（5.19）净化，用1mL水、1mL甲醇（5.2）活化固相萃取柱，试样全

部过柱，用1mL水、1mL甲醇（5.2）淋洗固相萃取柱，再用6mL氨水-甲醇（5.12）洗脱，收集流出液

于10mL比色管中，整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃条件下氮吹至近干，用2.00

mL水-甲醇（5.13）溶解、涡旋混匀，过0.22μm微孔过滤膜（5.20），待测。

测定

8.3.1相液色谱测定参考条件

液相色谱法测定参考条件如下：

a)色谱柱：C18型柱，长150mm，内径3.9mm，粒径5μm，或等效的色谱柱；

b)流动相：A:乙酸（5.14）+B:乙腈（5.1）=60+40（v/v）；

c)流速：1.0mL/min；

d)进样量：10.00μL；

e)柱温：40℃；

f)检测波长：258nm。

8.3.2标准曲线的制作

按照8.3.1测定条件，将标准工作液（5.18）注入高效液相色谱仪中进行测试。测定相应的峰面积，

以标准工作液（5.18）的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

8.3.3试样溶液的测定

按照8.3.1测定条件，将待测样品溶液注入高效液相色谱仪中进行测试。待测样品溶液中目标物质

的响应值应在仪器线性范围内，否则应适当稀释。标准工作液与待测样品溶液等体积进样。根据标准溶

液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性，外标法定量。咪草烟标准

溶液色谱图见附录A中图A.1。

平行实验

按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。

空白实验

除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。

9结果计算和表示

试样中咪草烟含量X按式（1）计算：

（C-C0）×V

X=······································································(1)

m

式中：

X——试样中咪草烟的含量，mg/kg；

3

DB15/T2602—2022

C——待测液中咪草烟的浓度，µg/mL；

C0——试剂空白；

V——试样溶液定容体积，mL；

m——试样的称样量，g。

注：测定结果用算术平均值表示，保留两位有效数字。

10精密度

在