DB4201∕T 520-2017 两系杂交水稻品种纯度SSR鉴定方法

ICS65.020.20

B22

DB4201

武汉市地方标准

DB4201/T520—2017

两系杂交水稻品种纯度SSR鉴定方法

2017-06-20发布2017-07-20实施

武汉市质量技术监督局发布

DB4201/T520-2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由武汉市农业委员会归口。

本标准起草单位：中垦锦绣华农武汉科技有限公司、武汉市农业技术推广中心。

本标准主要起草人：徐姮、许树文、昌华敏、熊恒多、李晏斌、刘万里、万元香。

本标准首次发布。

I

DB4201/T520-2017

两系杂交水稻品种纯度SSR鉴定方法

1范围

本标准规定了用SSR分析技术进行两系杂交水稻品种纯度鉴定的原理、仪器设备及试剂、相关试剂

及溶液配制、推荐引物、操作程序、统计与计算的方法。

本标准适用于两系杂交水稻品种纯度的快速鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB4404.1-2008粮食作物种子第1部分：禾谷类

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

引物

一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，提供3'-OH末端作DNA合成的起点，延伸合成模版DNA的互

补链。

3.2

SSR标记

简单序列重复标记

由几个核苷酸（一般为2个～6个）为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列；由于

基本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异

引物来扩增SSR序列即可揭示其多态性。

3.3

推荐引物

品种纯度鉴定中优先选用的一套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。

3.4

聚合酶链式反应

1

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一种利用酶促反应对特定DNA片段进行体外扩增的技术，该技术以短核苷酸序列作为引物，并使

用一种耐高温的DNA聚合酶，只需非常少量的DNA样品，在短时间内以样品DNA为模版合成上亿个拷

贝。

3.5

两系杂交水稻

两系杂交水稻是利用光温敏不育系水稻为基础，与恢复系杂交生产的杂交稻种子。

3.6

品种纯度

品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。

4原理

品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核苷酸序列的不同所致，利用不同品种其SSR多态性存在差

异的特点达到纯度鉴定目的。简单重复序列（SSR）分布于水稻整个基因组的不同位置上，不同品种每

个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序

列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进

行扩增，扩增产物通过电泳进行分离，在凝胶成像系统上观察可辨别SSR电泳谱带。通过选用亲本间具

有多态性的SSR引物在杂交种中PCR扩增产物电泳谱带差异，鉴定两系水稻品种纯度。

5仪器设备及试剂

见附录A。

6相关试剂及溶液配制

见附录B。所用试剂均为分析纯。试剂配制用水均应符合GB/T6682的一级水的要求。

7推荐引物

见附录C，其它在本文件中未推荐的亲本间多态性引物也可以使用。

8操作程序

8.1样品制备

8.1.1受检样品的扦样、分样和保存，应符合GB/T3543.2的要求。

8.1.2试样的数量及淘汰值可参考GB/T3543.5要求。检测时将其双亲的标准种子设为对照。

8.2样品DNA提取

8.2.1材料准备

8.2.1.1亲本

2

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每个亲本取20个单株叶片取等量组织混合制取样品，提供的亲本种子应符合GB4404.1的原种纯度

要求。

8.2.1.2杂交种

每个样品取200粒以上的种子，培养幼苗单株制样应符合GB/T3543.4要求。

8.2.2DNA提取

8.2.2.1亲本DNA的提取

按GB/T3543.4要求的方法培养幼苗取水稻叶片2cm放入研钵中，加液氮充分研磨至粉末状，然后

移入2ml离心管中，加入500ul预热（60℃）的DNA提取液，65℃水浴30min，间隔15分钟颠倒混匀

一次，再加入500ul氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。10000rpm离心5min。将上清液400ul转入

另一支含有800ul-20℃预冷乙醇的离心管沉淀DNA，10000rpm离心10min，弃上清液，再用70％乙

醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加入200ul超纯水溶解DNA，检测浓度，将DNA稀释至20ng/ul，

-20℃保存留用。

8.2.2.2杂交种DNA的提取

按GB/T3543.4要求的方法培养幼苗取水稻叶片2cm剪碎移入PCR板单孔内，每个单孔加入BufferA

50ul，然后将加有样品和BufferA的PCR板放入95℃水浴15min，然后每个单孔加入50ulBufferB，

混匀离心，取2ul上清作为样品DNA。

注：以上为推荐用于水稻纯度鉴定的DNA快速提取方法，样品DNA即取即用，不宜留存；其他能够达到PCR扩增质量

要求的DNA提取方法都适用于本标准。

8.3PCR扩增

8.3.1引物选择

首先选择附录C中的引物在亲本中进行扩增，挑选出亲本间检测出差异的引物用于杂交种纯度检测，

杂交种纯度检测时加入2个亲本作为对照。

8.3.2反应体系

20ul的反应体系，2ul样品DNA，1ul正向引物（10umol/L），1ul反向引物（10umol/L），

0.2ulTaqDNA聚合酶(5U/ul)，0.2uldNTP（10mM/L），2ulPCR缓冲液(10×，pH8.3)，13.6ul

超纯水。

8.3.3反应程序

94℃预变性5min，一次循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；运行35个循环，

72℃延伸5min，4℃保存。

8.4PCR产物检测

8.4.1琼脂糖凝胶制备

将1×TAE电泳缓冲液和琼脂糖（2.5％浓度）混合煮沸融化，冷却至50℃～55℃，加入EB（或EB

替代物），使其最终浓度约为0.5μg/ml，适时倒入制胶平台上，待胶凝固后拔出梳子。

8.4.2电泳

3

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将制好的凝胶放入加入TAE缓冲液的电泳槽中（缓冲液应高于凝胶表面），清除加样孔气泡和杂质，

向加样孔中加入8ul混有溴酚蓝的PCR产物，接通电源在5V/CM凝胶的电压下进行电泳，至指示剂（溴

酚蓝）接近胶板底部时，结束电泳。

8.4.3拍照记录

将胶板放入凝胶成像系统进行拍照，记录结果并保存。

9统计与计算

如果SSR位点表现双亲带型，则说明品种为真杂种；如果出现单个亲本带型或其他带型，则该种子

（幼苗、株）为假杂种。品种纯度（P）的数值以百分数表示，按公式（1）计算：

N1−N2……（1）

P=×100%

N1

式中：

P——品种纯度；

N1——检测种子数；

N2——非双亲带型的种子数。

4

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AA

附录A

（资料性附录）

仪器设备及试剂

A.1仪器设备包括但不限于：

——PCR扩增仪；

——电泳仪；

——水平电泳槽及配套的制胶附件；

——凝胶成像系统；

——高速冷冻离心机；

——水平摇床；

——磁力搅拌计；

——微波炉；

——高压灭菌锅；

——紫外分光光度计；

——移液器：规格分别为10ul、20ul、100ul、200ul、1000ul连续可调；

——酸度计；

——恒温水浴锅；

——电子天平；

——检验砻谷机。

A.2试剂包括但不限于：

——吐温20（W/V）；

——氢氧化钠；

——三羟甲基氨基甲烷；

——氯仿；

——异戊醇；

——浓盐酸；

——冰醋酸；

——蔗糖；

——溴酚蓝粉末；

——乙二胺四乙酸二钠；

——乙二胺四乙酸；

——10×PCR反应缓冲液；

——TaqDNA聚合酶；

——琼脂糖；

——无水乙醇；

——氯化钠；

——4种脱氧核苷酸；

——石蜡油

——A.2.19甲醛；

——A.2.20溴化乙锭（EB）。

5

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BB

附录B

（资料性附录）

相关试剂及溶液配制

B.1DNA提取溶液的配制

B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（pH8.0）溶液

称取186.1g乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA•2H2O），加入800ml水，再加入20g固体氢氧化钠(NaOH)，

搅拌，待完全溶解后，冷却至室温，再用NaOH准确调pH至8.0，定容至1000ml。在103.4kPa（121℃）

条件下灭菌20min。

B.1.20.5mol/L盐酸（HCl）溶液

量取25ml浓盐酸（36％～38％），加水定容至500ml。

B.1.31mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液

称取60.55g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于400ml水中，用0.5mol/L盐酸溶液（B.1.2）调pH

至8.0，定容至500ml，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

B.1.45mol/L氯化钠溶液

称取146g氯化钠（NaCl）溶于水中，定容至500ml，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

B.1.5DNA提取液

分别称取15g十二烷基苯磺酸钠（SDS），放入烧杯中，分别加入40ml乙二胺四乙酸二钠盐溶

(pH8.0)(B.1.1)、100ml三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液（B.1.3）和100ml氯化钠

溶液（B.1.4），加水搅拌定容至1000ml。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。于-20℃保存。

B.1.6氯仿-异戊醇（24：1）

将氯仿和异戊醇按24：1的体积比例配制混合液。

B.1.770％乙醇溶液

取700ml无水乙醇，用去离子水定容至1000ml。

B.1.810MNaOH溶液

取40g氢氧化钠，加入去离子水定容至100ml。

B.1.920％吐温20溶液

取100ml吐温20，加入去离子水定容至500ml。

B.1.10BufferA

6

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分别量取5ml10MNaOH溶液（B.1.8）和50ml20％吐温20溶液（B.1.9），加入去离子水搅拌定

容至500ml。临用临配。

B.1.11BufferB

称取12.114g三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl），0.744g乙二胺四乙酸（EDTA），加入去离子

水定容至1L。

B.1.1250倍TAE缓冲液

称取242g三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl），37.2g乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA•2H2O），加

入57.1ml冰醋酸，加去离子水定容至1L。

B.1.13溴酚蓝

取1g溴酚兰溶于30ml纯净水中，于搅拌台上电搅3h～4h；取120ml去离子水于干净旋盖玻璃瓶

中，加入240g蔗糖充分溶解；搅好的溴酚兰溶液倒入蔗糖溶液中混合，定容至400ml。倒入时，弃沉

淀。

B.2PCR产物检测

B.2.1琼脂糖凝胶制备

将1×TAE电泳缓冲液和琼脂糖（2.5％浓度）混合煮沸融化，冷却至50℃～55℃，加入EB（或EB

替代物），使其最终浓度约为0.5μg/ml，适时倒入制胶平台上，待胶凝固后拔出梳子。

B.2.2电泳

将制好的凝胶放入加入TAE缓冲液的电泳槽中（缓冲液应高于凝胶表面），清除加样孔气泡和杂质，

向加样孔中加入8ul混有溴酚蓝的PCR产物，接通电源在5V/CM凝胶的电压下进行电泳，至指示剂（溴

酚蓝）接近胶板底部时，结束电泳。

B.2.3拍照记录

将胶板放入凝胶成像系统进行拍照，记录结果并保存。

7

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CC

附录C

（资料性附录）

推荐引物

表C.1给出了推荐引物。

表C.1推荐引物

标记染色体臂正向引物序列（5-3）反向引物序列（5-3）近似片段长度

MarkerChrArmForwardprimer（5-3）Reverseprimer（5-3）Appoxlength

RM11951SATGGACCACAAACGACCTTCCGACTCCCTTGTTCTTCTGG150-160

RM2971LTCTTTGGAGGCGAGCTGAGCGAAGGGTACATCTGCTTAG160-190+

RM712SCTAGAGGCGAAAACGAGATGGGGTGGGCGAGGTAATAATG140--210

RM202LTCTGCAAGCCTTGTCTGATGTAAGTCGATCATTGTGTGGACC170--180+

RM2323LCCGGTATCCTTCGATATTGCCCGACTTTTCCTCCTGACG150-170

RM853LCCAAAGATGAAACCTGGATTGGCACAAGGTGAGCAGTCC90+-110

RM54144LACCATGGTTCAAGAGTGAAAACAGCTCAACCTGTTGAGTG100+-120

RM2734LGAAGCCGTCGTGAAGTTACCGTTTCCTACCTGATCGCGAC190+-210-

RM2675STGCAGACATAGAGAAGGAAGTGAGCAACAGCACAACTTGATG150--170

RM2745LCCTCGCTTATGAGAGCTTCGCTTCTCCATCACTCCCATGG160-170+

RM1906SCTTTGTCTATCTCAAGACACTTGCAGATGTTCTTCCTGATG110-130-

RM2536STCCTTCAAGAGTGCAAAACCGCATTGTCATGTCGAAGCC140+-160

RM3367LCTTACAGAGAAACGGCATCGGCTGGTTTGTTTCAGGTTCG170--200

RM187LTTCCCTCTCATGAGCTCCATGAGTGCCTGGCGCTGTAC160+-170+

RM3378SGTAGGAAAGGAAGGGCAGAGCGATAGATAGCTAGATGTGGCC170-440

RM728LCCGGCGATAAAACAATGAGGCATCGGTCCTAACTAAGGG170-200+

RM2199SCGTCGGATGATGTAAAGCCTCATATCGGCATTCGCCTG190+-220

RM2789LGTAGTGAGCCTAACAATAATCTCAACTCAGCATCTCTGTCC150--160

RM31110LTGGTAGTATAGGTACTAAACATTCCTATACACATACAAACATAC170+-190-

RM258