DB22∕T 1614-2012 蛋及乳制品中硝基呋喃代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱∕质谱法

ICS67.100

X04

DB22

吉林省地方标准

DB22/T1614—2012

蛋及乳制品中硝基呋喃代谢物残留量的测

定液相色谱-质谱/质谱法

Determinationofmetabolitesofnitrofuransresiduesineggandmilkproducts——

HPLC-MS/MSmethod

2012-12-01发布2013-01-01实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T1614—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、吉林出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：康明芹、李玲、杨帆、周立波、张代辉、顾婷婷、宋清莲、孟日增。

I

DB22/T1614—2012

蛋及乳制品中硝基呋喃代谢物残留量的测定

液相色谱-质谱/质谱法

1范围

本标准规定了蛋及乳制品中呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基（5-Moroholino-methyl-3-

amino-2-oxazolidnone，AMOZ）、呋喃西林代谢物氨基脲（Semicarbazid，SEM）、呋喃妥因代谢物1-

氨基-乙丙酰脲（1-Aminohydantoin，AHD）、呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-唑烷基酮（3-Amino-2-

oxazolidinone，AOZ）残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。

本标准适用于蛋及乳制品中AMOZ、SEM、AHD、AOZ残留量的测定和确证。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

3原理

试样中的硝基呋喃代谢物经三氯乙酸提取，与邻硝基苯甲醛衍生，调pH后固相萃取小柱（HLB，

N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯）净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，AMOZ、AHD和AOZ用内标法定

量，SEM用外标法定量。

4试剂与材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1邻硝基苯甲醛（C7H5NO3）：纯度≥99.0%。

4.2氢氧化钠（NaOH）。

4.3磷酸氢二钾（KH2PO4）。

4.4三水乙酸铅(C4H6O4Pb·3H2O)。

4.54种硝基呋喃代谢物标准物质：呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、呋喃

西林代谢物氨基脲（SEM）、呋喃妥因代谢物1-氨基-乙丙酰脲（AHD）、呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-唑烷

基酮（AOZ），纯度均≥98%。标准物质具体信息参见附录A。

4.64种硝基呋喃代谢物内标标准物质：D5-AMOZ，13C15N-SEM，13C3-AHD，D4-AOZ。

4.7甲醇（CH3OH）：色谱纯。

1

DB22/T1614—2012

4.8乙腈（CH3CN）：色谱纯。

4.9三氯乙酸(CCl3COOH)。

4.10二甲基亚砜（C2H6OS）。

4.11甲酸（HCOOH）：色谱纯。

4.12乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。

4.13磷酸氢二钾溶液：0.1mol/L。称取17.4g磷酸氢二钾（4.3），用水溶解并定容至1000mL。

4.1410%三氯乙酸溶液：称取100.0g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。

4.15氢氧化钠溶液：2.0mol/L。称取80.0g氢氧化钠（4.2），用水溶解并定容至1000mL。

4.1625%乙酸铅溶液：称取58g三水乙酸铅（4.4），用142mL水溶解，混匀。

4.170.1%甲酸溶液：取1mL甲酸(4.11)，用水稀释并定容至1000mL。

4.18样品定容液：乙腈-0.1%甲酸溶液（2+8）。量取20mL乙腈(4.8)与80mL的0.1%甲酸溶液(4.17)，

混匀。

4.19衍生化试剂：7.5mg/L。称取0.75g邻硝基苯甲醛（4.1），用二甲基亚砜（4.10）溶解并定容至

100mL。

4.204种硝基呋喃代谢物标准储备液：0.1mg/mL。准确称取硝基呋喃代谢物标准物质（4.5）10.0mg，

分别用少量乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，分别用乙腈定容至刻度，混匀，-18℃以下避光保存。

4.214种硝基呋喃代谢物内标标准储备液：0.1mg/mL。分别准确称取硝基呋喃代谢物内标标准物质

（4.6）10.0mg，分别用少量乙腈溶解并转移至100mL容量瓶中，分别用乙腈定容至刻度，混匀，-18℃

以下避光保存。

4.224种硝基呋喃代谢物标准工作液：20.0μg/L。首先分别准确吸取上述4种硝基呋喃代谢物标准储

备液（4.20）用乙腈稀释成1.0mg/L的溶液，然后从中准确吸取2.0mL于100mL容量瓶中，用样品定

容液稀释并定容至刻度，混匀，4℃以下避光保存。

4.234种硝基呋喃代谢物内标标准工作液：20.0μg/L。首先分别准确吸取上述4种硝基呋喃代谢物内

标标准储备液（4.21）用乙腈稀释成1.0mg/L的溶液，然后从中准确吸取2.0mL于100mL容量瓶中，

用样品定容液稀释并定容至刻度，混匀，4℃以下避光保存。

4.24pH精密试纸：5.5~9.0。

4.25OasisHLB柱：200mg/6mL，使用前依次用10mL甲醇(4.7)，10mL水预处理。

4.26滤膜：0.22µm，有机系。

5仪器与设备

5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。

5.2高速冷冻离心机：10000r/min，配50mL具塞聚丙烯或聚四氟乙烯离心管。

2

DB22/T1614—2012

5.3超声波清洗器：40kHz。

5.4恒温箱或恒温水浴装置：（37±1）℃。

5.5天平：感量0.0001g和0.01g。

5.6真空泵：负压为30psi。

6分析步骤

6.1提取和衍生化

称取1g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入100μL硝基呋喃代谢物内标标准工作液（4.23），

充分混匀。加入10mL10%三氯乙酸（4.14），涡旋1min，60℃水浴提取2h，冷却至室温后-4℃冷

冻离心4min，上清液过滤至另一干净离心管中。滤渣中加入5mL10%三氯乙酸重复提取一次，合并两

次滤液，加入200μL衍生化试剂（4.19），置于37℃恒温装置中16h。

6.2净化

将上述衍生溶液取出放至室温后，加入4mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（4.13），用2mol/L氢氧

化钠溶液（4.15）调节溶液pH值至7.0～7.5，加入100μL乙酸铅溶液（4.16），涡旋30s，10000r/min

离心3min，上清液过预处理过的HLB小柱（4.25），待全部通过后，用10mL水分两次洗涤，弃去淋

洗液，负压抽干，再用4mL乙酸乙酯（4.12）洗脱，收集洗脱液至试管中，氮气吹至近干后，用乙腈

-0.1%甲酸溶液（4.17）定容至1mL，过0.22μm滤膜，滤液供LC-MS/MS测定。

6.3空白试验

除不称取试样外，均按6.1、6.2进行。

6.4测定

6.4.1色谱参考条件

色谱参考条件如下：

a)色谱柱：C18，2.1mm×150mm；3.5μm；

b)柱温：室温；

c)流速：0.20mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相及梯度洗脱条件见表1。

表1流动相及梯度洗脱条件

时间乙腈0.1%甲酸溶液

min%%

0.02080

3.05050

8.05050

8.12080

3

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表1（续）

时间乙腈0.1%甲酸溶液

min%%

202080

6.4.2质谱参考条件

质谱参考条件如下：

a)电离方式：电喷雾电离（ESI）；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测（MRM）；

d)电离电压：3kV~5kV；

e)脱溶剂气：0.75MPa；

f)雾化气：1.5MPa；

g)辅助气：1.5MPa；

h)碰撞气：0.15MPa；

i)离子源温度：300℃~550.0℃；

j)定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表2。

表2目标化合物的监测离子对、去簇电压和碰撞能量

母离子子离子去簇电压碰撞能量

化合物名称

m/zm/zVV

1286018

AMOZ的衍生物335

291*6018

D5-AMOZ的衍生物3402966015

1925517

SEM的衍生物209

166*5515

1787019

AHD的衍生物249

134*7022

13C3-AHD的衍生物2521347022

134*6519

AOZ的衍生物236

1926520

D4-AOZ的衍生物2401346522

注：带“*”的为定量离子。

6.4.3定性分析

在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时

间与标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的两对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对

丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对标准偏差不超过表3规定的范围，则

可判定样品中存在该物质。标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B。

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表3定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≤10%

允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%

6.4.4定量测定

根据试样中被测样液中被测组分的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行分析，对于高浓度

样品须适当进行系列稀释。标准工作液和样液中被测组分的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述

色谱条件下，参考保留时间为3.90min～10.70min，AMOZ、AHD和AOZ用内标法定量，SEM用外标法定量。

标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B。

7结果计算和表述

按（1）式计算试样中每种硝基呋喃代谢物含量，计算结果需扣除空白值。

c´V

X=i.........................................................................................(1)

im

式中：

Xi——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；

ci——从标准曲线读出的被测组分溶液浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m——样液所代表的最终试样的质量，单位为克(g)。

计算结果表示到小数点后一位。

8定量限、回收率和精密度

8.1定量限

本标准方法AMOZ、SEM、AHD、AOZ的定量限均为1.0μg/kg。

8.2回收率及精密度

在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定结果的算术平均值的15%。

样品中4种硝基呋喃代谢物的添加浓度及其回收率、精密度实验数据参见附录C。

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DB22/T1614—2012

AA

附录A

（资料性附录）

标准物质信息

表A.1标准物质和内标物质信息

原代谢物代谢物

代谢物名称代谢物英文名称代谢物CAS编号代谢物分子式

药内标分子式内标缩写

呋

5-甲基吗啉-3-5-Moroholino-me

喃

氨基-2-唑烷基thyl-3-amino43056-63-9C8H15D5N3O3C8H15D5N3O3AMOZ-D5

它

酮（AMOZ）-2-oxazolidnone

酮

呋

喃

1313

氨基脲（SEM）Semicarbazid563-41-7CH5N3OCH5N3OSEM-C

西

林

呋

喃1-氨基-乙丙酰1-aminohydantoi

1313

2827-56-7C3H5N3O2C3H5N3O2AHD-C3

妥脲（AHD）n

因

呋

喃3-氨基-2-唑烷3-Amino-2-oxazo

80-65-9C3H6N2O2C3H2N2O2D4AOZ-D4

唑基酮（AOZ）lidinone

酮

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BB

附录B

（资料性附录）

标准溶液多反应监测（MRM）色谱图

图B.1硝基呋喃代谢物标准溶液多反应监测（MRM）色谱图（5.0μg/L）

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DB22/T1614—2012

CC

附录C

（资料性附录）

不同添加水平平均回收率及精密度（n=10）

表C.1不同添加水平平均回收率及精密度

添加浓度回收率范围相对标准偏差

样品名称化合物%

µg/kg%

1.082.0～1005.62

AMOZ2.091.5～1033.57

1097.6～1052.34

1.060.0～66.03.25

SEM2.062.5～71.04.39

鸡蛋白粉1060.5～64.81.74

1.079.0～98.06.10

AHD2.095.0～1145.56

1095.8～98.50.95

1.095.0～1094.32

AOZ2.095.5～1062.90

1096.0～1042.38

1.076.0～10610.1

AMOZ2.082.0～11612.2

1096.9～1042.45

1.060.0～70.05.00

SEM2.060.0～69.03.88

1062.8～64.50.93

豆奶粉

1.088.0～1066.09

AHD2.090.0～1044.29

1095.9～99.21.14

1.0110～1182.52

AOZ2.0110～1192.60

1095.8～1052.61

1.068.0～10611.3

AMOZ2.093.0～99.02.03

1096.0～1011.40

奶粉1.060.0～68.03.96

SEM2.062.5～68.02.99

1061.7～64.01.31

AHD1.085.0～1005.37

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DB22/T1614—2012

表C.1不同添加水平平均回收率及精密度(续)

2.093.0～1084.31

1096.8～99.80.98

1.072.0～79.03.04

AOZ2.071.5～76.52.61

1061.9～65.41.51

1.092.0～1115.20

AMOZ2.091.0～1043.79

1097.9～1042.07

1.0