DB32T 5245-2025 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范

ICS11.220CCSB41江苏省地方标准DB32/T5245—2025猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范Technicalspecificationsofcellularimmunoassaysforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus2025‑10‑30发布 2025‑11‑30实施江苏省市场监督管理局 发布中国标准出版社 出版DB32/T5245—2025前 言本文件按照GB/T1.1—202标准化工作导则 第1部分标准化文件的结构和起草规的规起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省农业农村厅提出并组织实施。本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。限公司。ⅠDB32/T5245—2025猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范范围本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒MHC肽四聚体细胞免疫检测技术的试剂及仪器、质量控制和结果判定，描述了相应的检测方法。本文件适用于SLA⁃1*04∶01∶01型猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测、疫苗免疫效力评价和病毒感染的早期诊断，其他基因型猪的相关检测方法可参照确立。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文包括所有的修改单适用于本文件。GB/T18090 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法GB19489 实验室生物安全通用要求术语、定义和缩略语术语和定义下列术语和定义适用于本文件。主要组织相容性复合体 majorhistocompatibilitycomplex；MHC一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。SLA‑1等位基因 swineleukocyteantigenSLA基因座上的不同形式的基因。注1：SLA是猪的MHC。注2：SLA⁃1是SLA系统中的一个基因座。四聚体 tetramer一种由四个MHC分子单体与一条抗原肽结合后，再与荧光标记物连接形成的多聚体蛋白复合物。缩略语下列缩略语适用于本文件。APCAllophycocyani）BirABiotin⁃ProteinLigase）CTLTCytotoxicTLymphocyt）1DB32/T5245—2025DMSODimethylsµlfoxid）FACSFlµorescenceActivatingCellSorte）FITCFlµoresceinIsothiocyanateIsome）FSCForwardScatte）PBSPhosphateBµfferedSalin）PRRSPorcineReprodµctiveAndRespiratorySyndrom）PRRSVPorcineReprodµctiveAndRespiratorySyndromeVirµ）PBMCPeripheralBloodMononµclearCel）R⁃PER⁃Phycoerythri）SSCSideScatte）TCRTTCellRecepto）主要器材真空抗凝管。5mL10mL的无菌注射器。10mL15mL的透明无菌离心管。一次性巴氏吸管。1000μL无菌长枪头。可控温水平离心机。流式细胞仪。精密可调移液器，1μL~10μL20μL~200μL100μL~1000μL。流式管或1.5mL离心管。流式管管架或双面离心管架。用于覆盖1.5mL离心管板架或流式管的锡箔纸冷藏展示柜。细胞冻存管。血细胞计数板。倒置光学显微镜。主要试剂除另有规定外，所有试剂应为分析纯。猪外周血单个核细胞分离液。PBSAA.1。BB.5。FACSA.2。无菌双蒸水。A.3。MHCPE⁃pSLA+⁃Tetramer。红细胞裂解液。2DB32/T5245—2025检测阴性样品制备见附录B。阳性样品制备见附录C。样品采集与处理B.2。PBMC的分离见B.3。PBMCB.5。PBMCB.5。SLA⁃1E。样品染色检测试剂配置：按照待检测样本数量，参照A.3配制染色液，含有FITCmouseanti⁃pigCD3+、APCmouseanti⁃pigCD8a+和PE⁃pSLA+⁃Tetramer三种成份。6.4.1配制的FACS染色混合液重悬细胞沉淀200µL/4℃~8℃避光孵育30min~60min。6.4.2孵育后细胞悬液，水平离心机，250g离心10minFACS洗涤液清洗2次，再将细胞沉淀重悬于FACS200µL/4h内上流式细胞仪分析。若无法及时上机可使用含有工作浓度为1 ~2 多聚甲醛的FACS液体固定4℃~8℃避光保存并在一周内尽快完成上机检测。流式细胞术检测开机后，对流式细胞仪进行清洗、光路系统进行校验，应参照流式细胞仪的校验参数检测FSC、SSC和各荧光通道的平均荧光强度、变异系数和荧光分辨率。应设置空白对照和单染管对照。与阴性样品对比，通过相应散点图中的荧光强度表达，区分出目标细胞的阳性信号并进行圈门。应在进样稳定后开始采集信号。有效细胞信号采集数量不低于10000个细胞。信号采集时间不应超过5min。数据分析，使用高版本号软件。根据FSC/SSC双参数获得单核淋巴细胞的百分比，根据FITC⁃CD3+/SSC双参数获得CD3T淋巴细胞细胞百分比，根据APC⁃CD8+/FITC⁃CD3双参数获得CD3CD8T淋巴细胞细胞的百分比APC⁃CD8+/PE⁃pSLACD8+/pSLAT淋巴细胞的百分比，即抗原特异CTL细胞的百分比。3DB32/T5245—2025结果判定在判定结果前应检查对照样品的结果——空白对照，用以排除细胞自发荧光背景，设置最佳的PMT电压；——单染管对照，设置最佳的荧光补偿；—阴性样品设置圈门界限CD8+/pSLA+⁃tetramer双阳的T淋细胞的百分比范围0 ~10 如有一标准不符合结果是无效的需重新检测和分析。结果计算以CD8+/pSLA+⁃tetramer双阳的T淋巴细胞比较对象，阳性率按公式（1）计算：式中：P——阳性率；

SP=N×100 （1）S——待检测样本CD8+/pSLA+⁃tetramer双阳的T淋巴细胞；N——阴性对照样本CD8+/pSLA+⁃tetramer双阳的T淋巴细胞。结果判定当P≥2时，样品为阳性；当P<2时，样品为阴性。临床综合判定结合第7章中阴阳性样品的检测结果，对猪群PRRSV的感染免疫情况进行综合判定，见表1。表1 感染免疫情况判定基因型流式结果综合判定SLA⁃1*04∶01∶01P≥2猪群已经感染PRRSV野毒或者疫苗免疫后诱导了细胞免疫反P<2猪群未感染PRRSV野毒或者疫苗免疫后未诱导细胞免疫反应以上判断适用于GP5（LLDTKGKLY）。在基因型和多肽更换时，应根据流式细胞监测与攻毒保护实验结果对应关系S/N为2进行适度调整设定标准4DB32/T5245—2025附 录 A资料性）试剂配制PBS0.01MpH7.）配制溶液所需试剂如下：——8g氯化钠（NaCl）；——0.2g氯化钾（KCl）；—1.44g磷酸氢二钠Na2HPO；—0.2g磷酸二氢钾KH2PO；加双蒸水至1000mLpH至7.24℃保存备用。FACS洗涤液在A.1中加入0.01 Proclin3000.1 BSA振荡混匀即可使用。流式检测用酶标抗体和流式抗体稀释液酶标抗体应一直保存在2℃~8℃。使用A.2FACS稀释酶标抗体，按照下表配置酶标抗体工作液，现配现用。未用完的酶标抗体应立即放回至2℃~8℃条件下保存。表A.1 酶标抗体工作液配置待检样品个数（细胞数）酶标抗体体积酶标抗体稀释液体积≈10）FITCmouseanti⁃pigCD30.5mg/m1µL；APC/AlexaFluor647mouseanti⁃pigCD8a0.2mg/m2µL；PE⁃pSLA+⁃Tetramer0.4mg/m1µL。196μL5DB32/T5245—2025附 录 B资料性）阴性对照制备PRRSV抗原和抗体双阴性猪的筛选参照GB/T18090定量PCR和ELISA操作规范和结果判定。抗凝血的采集使用5mL或10mL无菌注射器，前腔静脉采血，2⁃3mL/头，避免溶血，尽快转移到真空抗凝管中。2~8℃冷藏运送到实验室，48h内分离。猪PBMC的分离参照商品化猪外周单个核细胞分离试剂盒的操作步骤进行2~3mL1等体积混500~800g1000g20~30min；用吸管小心吸取第二层白色单个核细胞层到另一无菌的15mL10mL的细胞洗涤液或者PBS250g10min。5mL的细胞洗涤液或者PBS重悬细胞，重复洗涤2次。最后的细胞泥，重悬于PBS计数。所获得的新鲜PBMC应立即使用或分装后冻存。如果有红细胞污染，使用商品化红细胞裂解液裂解红细胞。如果未能及时染色进行流式分析PBMC的计数使用血细胞计数板：将细胞悬液充分混匀后，取少量滴加到血细胞计数板的计数室中，在显微镜下观察并计数。按照计数板的计数规则，计算出一定体积内的细胞数量，然后根据稀释倍数和总体积，计算出细胞的浓度。PBMC的冻存RPMI1640DMSO1。取浓度约为107个/mL1mL/管，装到细胞冻存盒中，放-70℃保存，转入液氮中保存24h。PBMC的复苏从液氮中取出冷冻细胞管℃左右中迅速解冻。将细胞转移入10倍量的RP⁃MI1640pH7.1000r/min离心10minFACS的细胞浓度后，即可使用。PBMC的染色按照抗体储液浓度与待检测样本数量配置。参照A.3FACSFITCmouseanti⁃pigCD3+APCmouseanti⁃pigCD8a+PE⁃pSLA+⁃Tetramer三种抗体。使用配置的FACS染色混合液重悬细胞沉淀200µL/4℃避光孵育30~60min。孵育后的细胞悬液，250g/min10minFACS洗涤液清洗2次，再将细胞沉淀重悬于FACS洗6DB32/T5245—2025200µL/不超过4上机分析。结果判定流式细胞检测设置圈门界限CD8+/pSLA+⁃tetramer⁃双阳的T淋巴细胞的百分比范围0 ~10 ，判定为阴性对照成立。7DB32/T5245—2025附 录 C资料性）阳性对照制备PRRSV疫苗免疫猪商品化VR2332活疫苗，接种抗原抗体双阴性猪参照附录B方法筛选1头份/30d内的抗凝血。猪外周血的采集参照B.2操作。PBMC的分离参照B.3操作。细胞冻存液配置参照B.4操作。PBMC的冻存参照B.5操作。PBMC的复苏参照B.6操作。PBMC的染色参照B.7操作。结果判定流式细胞检测设置圈门界限CD8+/pSLA+⁃tetramer双阳的T淋巴细胞的百分比范围15 ~40 判定为阳性对照成立。8DB32/T5245—2025附 录 D规范性）CD8+/pSLA+‑tetramer的制备CD8+/GP5SLA+‑tetramer的制备设计与构建：将猪群中高频率出现的等位基因及PRRSVNADC30⁃like毒株的GP5蛋白序列输入预测网站，筛选出高亲和力且保守的GP5（LLDTKGKLY）。构建特殊结构的融αβ2m和GP5肽段间插入连接肽G43AlphaFold3分析确认结构可行。重组菌构建与表达：优化等位基因αβ2m和GP5α链羧基端添加BirA底物肽序列，插入连接肽后克隆到pColdI感受态细胞，构建阳性重组菌。诱导重组菌表达SDS⁃PAGE45kDa，且主要在上清中可溶性表达。生物素连接酶基因克隆与共转化DH5α为模板克隆BirADH5α/pET28a⁃BirABL2DE。将pET28a⁃BirA与pColdI⁃GP5⁃β2m⁃α共转化BL2DE感受态细SDS⁃PAGE和Westernblot检测目的蛋白及生物素化情况。GP5⁃SLASDS⁃PAGE检测纯度≥90。将生物素化单体与PE⁃SA30~60min形成CD8+/GP5SLA+⁃tetramer。质检标准：通过SDS⁃PAGE检测蛋白表达、纯化效果，确保目的蛋白条带清晰、纯度达标。利用Westernblot鉴定目的蛋白生物素化情况，在预期位置出现明显反应性条带视为合格。最终制备的四聚采集细胞信号数量不低于10000个，保证检测结果可靠。CD8+/NSLA+‑tetramer的制备设计与构建：将猪群中高频率出现的等位基因及PRRSVNADC30⁃like毒株的N蛋白序列输入预测网站，筛选出高亲和力且保守的N（TLSDSGRISY）。构建特殊结构的融合蛋αβ2m和N肽段间插入连接肽G43AlphaFold3分析确认结构可行。重组菌构建与表达：优化等位基因αβ2m和Nα链羧基端添加BirA底物肽序列，插入连接肽后克隆到pColdI感受态细胞，构建阳性重组菌。诱导重组菌表达SDS⁃PAGE45kDa，且主要在上清中可溶性表达。生物素连接酶基因克隆与共转化DH5α为模板克隆BirADH5α/pET28a⁃BirABL2DE。将pET28a⁃BirA与pColdI⁃N⁃β2m⁃α共转化BL2DE感受态细SDS⁃PAGE和Westernblot检测目的蛋白及生物素化情况。单体纯化与四聚体组装：用镍柱纯化生物素化的N⁃SLASDS⁃PAGE检测纯度≥90。将生物素化单体与PE⁃SA30~60min形成CD8+/NSLA+⁃tetramer。质检标准：通过SDS⁃PAGE检测蛋白表达、纯化效果，确保目的蛋白条带清晰、纯度达标。利用Westernblot鉴定目的蛋白生物素化情况，在预期位置出现明显反应性条带视为合格。最终制备的四聚采集细胞信号数量不低于10000个，保证检测结果可靠。9DB32/T5245—2025附 录 E资料性）SLA基因型检测SLA‑1引物序列SLA⁃1⁃FCATGGGGCCTGGAGCCCTCTTCSLA⁃1⁃RGTGTCCCTCAGTTCCCACAAGGSLA‑1序列扩增和检测样本准备：抗凝血采集参照B.2操作。取适量抗凝血样本0.3mL，置于无菌离心管中。细胞裂解：向抗凝血样本中加入2倍体积的RNAisoBlood试剂，立即剧烈振荡或涡旋混合15s~30s，确保血细胞充分裂解。此时细胞内的核酸释放到裂解液中。5min，使裂解物充分反应。随后加入0.215s，再次室温静置2min~3min12000g4℃离心15min。离心后，溶液会分为3层，上层为无色的水含RNRNA沉淀：小心吸取上层水相转移至新的离心管中，避免吸到中间层的蛋白质。加入0.5倍体积10min。然后12000g4℃离心10minRNA会沉淀在离心管底部，形成白色或淡白色沉淀。RNA洗涤弃去上清液加入1mL75 乙用DEPC处理水配洗涤RNA沉淀。7500g、4℃离心5min小心弃去上清尽量去除残留的乙醇避免RNA沉淀丢失。可将离心管短暂开盖在超净台中晾干或室温放置数分钟使乙醇充分挥发但注意不要让RNA沉淀完全干燥以免影响后续溶解。RNA溶解：向干燥后的RNA沉淀中加入适量无RNase一般为20μL~50μLRNA含量调整RNA溶解。可将离心管置于55~60℃水浴中孵育10~15min速溶解过程。RNA测定RNA的浓度和纯度，评估提取效果。对于高RNAA260/280比值通常在1.8~2.1之间。SLA‑1*04∶01特异性扩增序列（1117bp）5´⁃CATGGGGCCTGGAGCCCTCTTCCTGCTGCTGTCGGGGACCCTGGCCCTGACCGGGACCCAGGCGGGTCCCCACTCCCTGAGCTATTTCTACACCGCCGTGTCCCGGCCCGACCGCGGGGACTCTCGCTTCATCGCCGTCGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAACTACGCCCCGAATCCGCGGATGGAGCCTCGGGTGCCGTGGATACAGCAGGAGGGGCAGGAGTATTGGGATCGGGAGACGCGGAATGTCAAGGAAACCGCACAGACTTACGGAGTGGGCCTGAACACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTCCAGAGCATGTACGGCTGCTACTTGGGACCAGACGGGCTCCTCCTCCACGGGTACAGACAGGACGCCTACGACGGCGCCGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCG