基于寒凝血瘀理论：新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的机制探究

基于寒凝血瘀理论：新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的机制探究一、引言1.1研究背景与意义胃癌作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病，其发病率和死亡率长期居高不下，形势极为严峻。据2022年全球癌症统计数据，当年全球新增癌症病例达1,996万例，其中胃癌新发病例为96.84万例，占新增癌症病例的4.9%，在全球癌症发病率中位居第五。在死亡病例方面，2022年全球癌症死亡病例数为974万例，胃癌死亡数达65.99万例，占比6.8%，位列全球癌症死亡原因第五。在中国，2022年癌症新发病例数为482.47万例，新发胃癌病例数达35.87万例，占全国新增癌症病例数的7.4%，位居国内新发癌症第五位；而癌症死亡病例数为257.42万例，胃癌导致的死亡人数高达26.04万例，占全国癌症死亡病例数的10.1%，排名癌症死亡原因第三位。这些数据直观地反映出胃癌给人类生命健康带来的沉重负担，对其进行有效防治已刻不容缓。当前，临床上针对胃癌的治疗手段丰富多样，化疗作为重要的治疗方式之一，在胃癌治疗中占据着一定的地位。然而，传统化疗存在着诸多局限性。一方面，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常细胞也具有较强的毒性作用，这常常导致患者出现严重的不良反应，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等，极大地降低了患者的生活质量，使患者在对抗病魔的过程中承受着巨大的痛苦。另一方面，长期使用化疗药物容易使肿瘤细胞产生耐药性，随着治疗的推进，化疗药物的疗效逐渐降低，肿瘤细胞对药物的敏感性下降，使得化疗的效果大打折扣，无法实现对肿瘤的有效控制，难以达到理想的治疗目标。这些局限性严重制约了化疗在胃癌治疗中的应用，也促使医学领域不断探索新的治疗方法和策略。在这样的背景下，中医药治疗胃癌的优势日益凸显。中医药作为中华民族的瑰宝，在肿瘤治疗领域有着悠久的历史和丰富的经验，其独特的理论体系和治疗理念为胃癌的治疗提供了全新的思路和方法。中医药强调整体观念，注重人体自身的调节和平衡，通过调整机体的内环境，增强机体的免疫力，达到抑制肿瘤生长、预防肿瘤复发和转移的目的。与化疗相比，中医药治疗副作用较小，能够在一定程度上减轻患者的痛苦，提高患者的生活质量。此外，中医药还可以与化疗、手术等现代医学治疗手段相结合，发挥协同增效的作用，进一步提高胃癌的治疗效果。例如，在化疗期间配合中药治疗，可以减轻化疗药物的毒副作用，增强患者对化疗的耐受性，提高化疗的完成率；在手术后使用中药调理，可以促进患者身体的恢复，减少术后并发症的发生，降低肿瘤的复发率。新加良附方作为中医药领域的一个重要方剂，由《良方集腋》中的良附丸加味化裁而来，主要用于寒凝血瘀证。该方具有温阳散寒、行气疏肝、活血止痛等功效，其组成药物高良姜、香附、穿山龙等在中医理论中均具有明确的药用价值。高良姜性热，味辛，归脾、胃经，具有温胃散寒、消食止痛的作用；香附性平，味辛、微苦、微甘，归肝、脾、三焦经，能疏肝理气、调经止痛；穿山龙性温，味甘、苦，归肝、肺经，可祛风除湿、活血通络、止咳平喘。这些药物相互配伍，共同发挥作用，在临床上被广泛应用于多种疾病的治疗，尤其在消化系统疾病方面展现出了良好的疗效。近年来，越来越多的研究表明，新加良附方在胃癌治疗中具有潜在的应用价值，能够对胃癌细胞产生一定的抑制作用，但其具体的作用机制尚未完全明确。细胞凋亡是细胞在发育代谢过程中的一种生理现象，是细胞衰老、死亡的主要形式之一。在肿瘤的发生发展过程中，细胞凋亡异常扮演着重要的角色。正常情况下，细胞凋亡能够维持细胞的正常更新和组织的稳态，及时清除体内受损、异常或多余的细胞。然而，在肿瘤细胞中，凋亡调控机制常常出现紊乱，导致细胞凋亡受阻，肿瘤细胞得以持续增殖、存活，并进一步侵袭和转移。因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为治疗肿瘤的一个重要策略。研究新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的机制，对于深入了解该方剂的抗癌作用原理，拓展中医药在胃癌治疗中的应用具有重要的理论意义和实践价值。从理论层面来看，揭示其作用机制有助于丰富和完善中医药抗癌理论，为中医药治疗肿瘤提供更加坚实的理论基础；从实践角度而言，明确其作用机制能够为临床合理应用新加良附方治疗胃癌提供科学依据，指导医生更加精准地用药，提高治疗效果，为广大胃癌患者带来新的希望。1.2研究目的本研究旨在以胃癌“寒凝血瘀”病机理论为基石，全面且深入地探究新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的作用及机制。通过细胞实验，观察新加良附方对胃癌细胞增殖、凋亡的影响，明确其是否能够有效抑制胃癌细胞的生长，诱导细胞凋亡，并初步探讨其作用的浓度和时间依赖性，确定最佳作用条件。利用分子生物学技术，检测凋亡相关蛋白和信号通路的变化，深入剖析新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的内在分子机制，揭示其作用的关键靶点和信号传导途径，为从分子层面理解该方剂的抗癌作用提供依据。此外，结合网络药理学和生物信息学分析，预测新加良附方的潜在作用靶点和信号通路，并通过实验进行验证，从系统生物学的角度全面阐释其治疗胃癌的作用机制，挖掘方剂中药物成分与靶点、通路之间的复杂关系。本研究期望为临床应用新加良附方治疗胃癌提供坚实的理论依据和科学指导，助力提高胃癌的临床治疗效果，改善患者的生存质量和预后。同时，也为基于中医药理论研发新型抗胃癌药物奠定基础，推动中医药在胃癌治疗领域的创新发展，为攻克胃癌这一医学难题贡献力量。1.3国内外研究现状在胃癌治疗研究领域，国内外学者开展了大量的工作，取得了一系列重要成果。在西医治疗方面，手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等多种手段不断发展和完善。手术作为早期胃癌的主要治疗方法，技术日益成熟，腹腔镜手术、机器人手术等微创手术的应用，在保证根治效果的同时，能够减少手术创伤，促进患者术后恢复。化疗药物不断更新换代，多种化疗方案的联合应用在一定程度上提高了胃癌患者的生存率，但化疗的毒副作用和耐药性问题仍然是亟待解决的难题。靶向治疗和免疫治疗的出现，为晚期胃癌患者带来了新的希望。如靶向HER2的曲妥珠单抗、维迪西妥单抗，VEGFR2药物雷莫西尤单抗及阿帕替尼等，通过精准作用于特定分子靶点，有效抑制肿瘤生长；免疫检查点抑制剂PD-1单抗联合化疗，已成为不可切除局部晚期或转移性食管胃结合部/胃癌患者的一线治疗新标准。在细胞凋亡研究方面，细胞凋亡作为细胞程序性死亡的重要方式，其在肿瘤发生发展中的作用机制是生物学和医学领域的研究热点。大量研究表明，细胞凋亡信号通路的异常与肿瘤的发生、发展密切相关，包括内源性线粒体途径、外源性死亡受体途径以及内质网应激途径等多条信号通路参与细胞凋亡的调控。在肿瘤治疗中，诱导肿瘤细胞凋亡已成为一种重要的策略，许多化疗药物、靶向药物以及免疫治疗药物都被证实能够通过诱导细胞凋亡来发挥抗癌作用。在中医药治疗胃癌及新加良附方的研究方面，中医药在胃癌治疗中具有独特的优势，能够改善患者症状、提高生活质量、延长生存期，且副作用较小。许多中药方剂和中药提取物被研究用于胃癌的治疗，如六君子汤、人参皂苷Rg3等，在临床实践和实验研究中均显示出一定的抗癌活性。新加良附方作为一种具有温阳散寒、行气疏肝、活血止痛功效的中药方剂，近年来在抗肿瘤领域逐渐受到关注。已有研究表明，新加良附方在体外实验中对胃癌细胞的增殖具有一定的抑制作用，在体内实验中能够抑制裸鼠胃癌移植瘤的生长。通过网络药理学研究发现，新加良附方中的高良姜素、槲皮素、木犀草素、薯蓣皂苷元等主要有效活性成分，作用于AKT1、MYC、CASP3、EGFR等多个胃癌相关靶点，并参与PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Wnt信号通路等关键代谢信号通路，从而发挥治疗胃癌的作用。然而，目前关于新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的具体分子机制研究仍相对较少，其作用靶点和信号通路的具体调控机制尚未完全明确，在临床应用中的规范化和标准化也有待进一步完善。二、相关理论基础2.1胃癌的中医认识2.1.1病名与病机溯源在中医古代文献中，虽无“胃癌”这一确切病名，但对胃癌相关症状及病机的描述历史久远。《黄帝内经》中记载的“胃脘痛”症状，如“胃脘当心而痛，上支两胁，膈咽不通，食饮不下”，与现代胃癌患者出现的上腹部疼痛、进食梗阻等表现有相似之处。《难经・五十六难》所提及的“脾之积，名曰痞气。在胃脘，覆大如盘，久不愈，令人四肢不收，发黄疸，饮食不为肌肤”，描述了胃脘部出现如盘状的积块，迁延不愈，还会引发黄疸、肢体无力、消瘦等症状，这与胃癌的临床表现和病情发展具有一定的关联性。此外，“伏梁”这一病名也与胃癌相关，《素问・腹中论》中说“病有少腹盛，上下左右皆有根，此为何病？名曰伏梁。……裹大脓血，居肠胃之外，不可治，治之每切按之致死”，形象地描述了腹部肿物的位置、性质以及难治性，与胃癌的某些特征相契合。这些病名虽不能完全等同于现代医学中的胃癌，但从不同角度反映了古代医家对胃癌症状和体征的观察与认识。在病机方面，中医对胃癌的认识可追溯至《灵枢・百病始生》中提到的“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣”，强调了寒邪在肿瘤发生中的重要作用，认为寒邪入侵人体，导致气血运行不畅，日久形成积聚，这与胃癌“寒凝血瘀”的病机密切相关。寒邪侵袭人体后，会使人体阳气受损，气血失于温煦，运行迟缓，进而形成瘀血。瘀血阻滞于胃脘，影响脾胃的正常运化功能，导致痰湿内生，痰瘀互结，最终形成肿瘤。汉代张仲景在《金匮要略》中论述“病人胸满，唇痿舌青，口燥，但欲漱水不欲咽，无寒热，脉微大来迟，腹不满，其人言我满，为有瘀血”，进一步阐述了瘀血的表现及病机，为胃癌“寒凝血瘀”病机的形成提供了理论依据。随着中医学的发展，后世医家对胃癌病机的认识不断深化和丰富，如朱丹溪在《丹溪心法》中提出“凡人身上中下有块者，多是痰”，强调了痰邪在肿瘤形成中的作用。痰邪与瘀血相互胶着，形成痰瘀互结之病理状态，加重了病情的发展。2.1.2现代中医对胃癌的认识现代中医在继承古代医家对胃癌认识的基础上，结合现代医学知识和临床实践，对胃癌的病因病机有了更深入的见解。在“寒凝血瘀”的基础上，现代中医更加重视正气亏虚与邪毒内侵在胃癌发生发展中的作用。正气亏虚是胃癌发病的内在基础，《内经》云：“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”。当人体正气不足时，机体的防御功能下降，无力抵御外邪的侵袭，从而为胃癌的发生创造了条件。脾胃为后天之本，气血生化之源，若脾胃虚弱，运化失常，则气血生化不足，正气亏虚，易受邪侵。此外，长期的情志失调、饮食不节、过度劳累等因素，也会损伤人体正气，导致脏腑功能失调，进而引发胃癌。邪毒内侵是胃癌发病的重要因素之一。现代医学研究表明，幽门螺杆菌感染、化学物质、放射线等外界因素，均可作为邪毒侵犯人体，导致胃黏膜受损，引发细胞突变，最终形成肿瘤。这些邪毒侵入人体后，与体内的痰、瘀等病理产物相互作用，进一步加重了病情的发展。如幽门螺杆菌感染可导致胃黏膜炎症、溃疡，长期不愈则可引发癌变。正气亏虚与邪毒内侵相互影响，互为因果。正气亏虚，无力抗邪，使邪毒易于入侵；邪毒内侵，又进一步损伤正气，导致病情恶化。在临床实践中，胃癌患者常表现为胃脘疼痛、胀满、食欲不振、消瘦、乏力等症状，这些症状与正气亏虚、寒凝血瘀、邪毒内侵的病机密切相关。胃脘疼痛、胀满多由寒凝血瘀，阻滞气机所致；食欲不振、消瘦、乏力则是正气亏虚，脾胃运化失常的表现；而病情的进展、恶化则与邪毒内侵，耗伤正气有关。因此，现代中医在治疗胃癌时，注重扶正祛邪，温阳散寒，活血化瘀，解毒散结，以改善患者的临床症状，提高生活质量，延长生存期。2.2细胞凋亡相关理论2.2.1细胞凋亡的概念与过程细胞凋亡，又被称为程序性细胞死亡，是细胞在基因严格调控下发生的主动、有序的死亡过程，这一过程对维持机体内环境的稳定起着至关重要的作用。与细胞坏死这种被动的、病理性的死亡方式有着本质区别，细胞凋亡是一种生理性的死亡机制，在多细胞生物体的生长发育、组织稳态维持以及免疫调节等诸多生理过程中发挥着不可或缺的作用。例如，在胚胎发育阶段，手指和脚趾的形成过程中，指间细胞的凋亡使得手指和脚趾能够正常分离；在免疫系统中，细胞凋亡能够清除被病原体感染的细胞以及自身反应性淋巴细胞，从而维持免疫平衡。细胞凋亡有着独特的形态学和生化特征。在形态学方面，凋亡早期，细胞体积会逐渐缩小，细胞表面的微绒毛减少甚至消失，细胞膜向内皱缩；随着凋亡的进行，细胞核染色质会发生凝集，呈现出边缘化分布，靠近核膜；晚期时，细胞核会发生碎裂，形成凋亡小体。这些凋亡小体被周围的吞噬细胞识别并吞噬，从而完成细胞凋亡的整个过程，且不会引发炎症反应。在生化特征上，细胞凋亡过程中会激活一系列的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases），这些酶能够特异性地切割细胞内的多种蛋白质底物，导致细胞结构和功能的改变。此外，细胞凋亡还会引发DNA的断裂，形成180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现出典型的“梯状条带”。细胞凋亡的过程可以大致分为启动和执行两个主要阶段。在启动阶段，细胞会接收到来自细胞内或细胞外的凋亡信号。内源性凋亡途径主要由细胞内的应激信号触发，如DNA损伤、氧化应激、生长因子缺乏等。当细胞受到这些应激刺激时，线粒体的外膜通透性会发生改变，释放出细胞色素C等凋亡相关因子。细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）以及dATP结合，形成凋亡小体，进而招募并激活Caspase-9，启动Caspase级联反应。外源性凋亡途径则是由细胞表面的死亡受体介导的。当死亡配体，如肿瘤坏死因子（TNF）、Fas配体（FasL）等与相应的死亡受体，如TNF受体1（TNFR1）、Fas等结合后，会招募接头蛋白FADD和Caspase-8，形成死亡诱导信号复合物（DISC），激活Caspase-8，从而引发细胞凋亡。在执行阶段，激活的Caspases会进一步切割细胞内的多种重要蛋白质，如核纤层蛋白、肌动蛋白、PARP等，导致细胞核膜崩解、细胞骨架破坏以及DNA修复酶失活等，最终使细胞发生凋亡。此外，细胞凋亡还涉及到一些其他的调节分子和信号通路，如Bcl-2家族蛋白、p53蛋白等。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它们通过相互作用来调节线粒体的外膜通透性，从而控制细胞凋亡的进程。p53蛋白作为一种重要的肿瘤抑制因子，在细胞凋亡中也发挥着关键作用。当细胞受到DNA损伤等应激刺激时，p53蛋白会被激活，它可以通过转录激活促凋亡基因（如Bax、PUMA等）的表达，或者直接作用于线粒体，促进细胞色素C的释放，诱导细胞凋亡。2.2.2细胞凋亡与肿瘤的关系细胞凋亡异常在肿瘤的发生、发展过程中扮演着极为关键的角色。正常情况下，细胞凋亡作为一种重要的生理机制，能够及时清除体内受损、异常或多余的细胞，维持细胞数量的动态平衡和组织的正常功能。当细胞凋亡调控机制出现异常时，肿瘤细胞便可能逃脱凋亡的命运，持续增殖并逐渐发展为肿瘤。肿瘤细胞中常见的凋亡异常机制包括凋亡信号通路的异常激活或抑制、凋亡相关基因的突变以及抗凋亡蛋白的过度表达等。在许多肿瘤细胞中，Bcl-2蛋白的表达显著升高，它能够抑制线粒体释放细胞色素C，从而阻断内源性凋亡途径，使肿瘤细胞得以存活和增殖。一些肿瘤细胞还会通过突变或缺失p53基因，导致p53蛋白功能丧失，无法正常诱导细胞凋亡，进而促进肿瘤的发生和发展。诱导肿瘤细胞凋亡已成为一种重要且极具潜力的抗癌策略。其原理在于，通过各种手段激活肿瘤细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞按照正常的凋亡程序发生死亡，从而达到抑制肿瘤生长、缩小肿瘤体积甚至消除肿瘤的目的。与传统的化疗和放疗相比，诱导肿瘤细胞凋亡具有诸多显著优势。传统治疗方法在杀伤肿瘤细胞的同时，往往会对正常细胞造成较大的损伤，引发严重的不良反应；而诱导细胞凋亡的治疗方式能够更加特异性地作用于肿瘤细胞，对正常细胞的损伤较小，从而降低治疗过程中的毒副作用。诱导肿瘤细胞凋亡还可以避免肿瘤细胞产生耐药性，因为凋亡是细胞的一种固有死亡机制，肿瘤细胞难以通过改变自身特性来逃避凋亡。许多化疗药物和靶向药物都是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌作用的。顺铂作为一种常用的化疗药物，能够与肿瘤细胞内的DNA结合，引起DNA损伤，进而激活内源性凋亡途径，诱导肿瘤细胞凋亡；靶向药物如针对BCR-ABL融合蛋白的伊马替尼，能够特异性地抑制该蛋白的酪氨酸激酶活性，诱导慢性髓性白血病细胞凋亡。研究诱导肿瘤细胞凋亡的机制，对于开发新型抗癌药物、优化肿瘤治疗方案具有重要的指导意义，有望为肿瘤患者带来更好的治疗效果和生存质量。2.3新加良附方概述2.3.1组方来源与成分新加良附方源自《良方集腋》中的良附丸，在其基础上加入穿山龙化裁而成。良附丸作为经典方剂，由高良姜和香附两味药组成。高良姜性热，味辛，归脾、胃经，具有温胃散寒、消食止痛的显著功效。《本草汇言》称其“祛寒湿、温脾胃之药也”，常用于治疗脘腹冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等症状。现代研究表明，高良姜中富含多种化学成分，如高良姜素、山柰素、槲皮素等黄酮类化合物，这些成分具有抗氧化、抗炎、抗菌以及抗肿瘤等多种生物活性。香附性平，味辛、微苦、微甘，归肝、脾、三焦经，能疏肝理气、调经止痛，被誉为“气病之总司，女科之主帅”。其主要化学成分包括挥发油、黄酮类、三萜类等，具有调节子宫平滑肌、镇痛、抗炎、抗肿瘤等药理作用。穿山龙性温，味甘、苦，归肝、肺经，可祛风除湿、活血通络、止咳平喘。《东北药用植物志》记载其“舒筋活血，治腰腿疼痛，筋骨麻木”。现代研究发现，穿山龙的主要活性成分是薯蓣皂苷元，它具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗炎、免疫调节等。薯蓣皂苷元能够抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，还可以通过调节免疫系统，增强机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力。在新加良附方中，高良姜温阳散寒，为君药，针对寒邪凝滞这一关键病理因素发挥作用，能迅速驱散胃腑之寒邪，使阳气得以恢复，气血运行得以通畅。香附疏肝理气，为臣药，辅助高良姜增强行气止痛之效，同时可疏解因寒邪凝滞导致的气机不畅，调节肝脏的疏泄功能，使全身气机调畅，有助于气血的运行和瘀血的消散。穿山龙活血通络，为佐药，协助君臣药物增强活血化瘀之力，改善局部血液循环，使瘀血得化，经络得以疏通，从而缓解疼痛，还能增强机体的免疫功能，辅助抑制肿瘤的生长。这三味药相互配伍，协同发挥温阳散寒、行气疏肝、活血止痛的功效，针对胃癌“寒凝血瘀”的病机，从多个方面调节机体的病理状态，达到治疗疾病的目的。2.3.2作用机制研究进展近年来，针对新加良附方作用机制的研究取得了一系列重要进展，为深入理解其药理作用和临床应用提供了坚实的理论基础。在抗肿瘤作用方面，多项研究表明，新加良附方能够对肿瘤细胞的生长产生显著的抑制效果。董青等人的研究显示，新加良附颗粒在体外实验中对人胃癌细胞（BGC-823）的生长有着不同程度的抑制作用，呈现出明显的时间和剂量依赖性。随着药物作用时间的延长和浓度的增加，胃癌细胞的增殖活性逐渐降低，这表明新加良附方能够有效地阻碍胃癌细胞的分裂和增殖过程，从而抑制肿瘤的生长。在体内实验中，研究人员建立了移植性人胰腺癌裸鼠动物模型，观察到新加良附颗粒干预治疗后，肿瘤体积明显缩小，抑制率达到41.04%，与对照组相比具有显著的统计学意义。这进一步证实了新加良附方在体内也具备强大的抗肿瘤能力，能够有效地控制肿瘤的生长，为临床治疗提供了有力的实验依据。关于其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，研究发现，新加良附方可能通过调节细胞内的凋亡相关信号通路来发挥作用。周又浪等人的研究表明，新加良附方能够上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。Bax蛋白能够促进线粒体释放细胞色素C，进而激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡；而Bcl-2蛋白则具有抑制细胞色素C释放的作用，从而阻止细胞凋亡的发生。新加良附方通过调节这两种蛋白的表达水平，打破了细胞内凋亡与抗凋亡的平衡，促使肿瘤细胞向凋亡方向发展。该方还可能影响其他凋亡相关蛋白和信号分子的表达，如Caspase-3、p53等。Caspase-3是细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，其活性的增加能够加速细胞凋亡的进程；p53作为一种重要的肿瘤抑制因子，能够通过多种途径诱导细胞凋亡。新加良附方可能通过激活p53信号通路，上调Caspase-3的活性，进一步增强对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。在调节免疫功能方面，新加良附方也展现出了积极的作用。有研究表明，该方能够增强机体的免疫细胞活性，提高机体的免疫监视和防御能力。它可以促进T淋巴细胞的增殖和分化，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用；还能调节巨噬细胞的功能，使其分泌更多的细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）等，这些细胞因子能够直接或间接地发挥抗肿瘤作用。巨噬细胞分泌的TNF可以诱导肿瘤细胞凋亡，IL-1则可以激活T淋巴细胞和NK细胞，增强机体的免疫应答。通过调节免疫功能，新加良附方能够调动机体自身的免疫系统来对抗肿瘤，为肿瘤的治疗提供了一种新的思路和方法。从中医理论的“寒凝血瘀”病机角度来看，新加良附方的作用机制与该病机高度契合。寒邪凝滞会导致气血运行不畅，形成瘀血，而瘀血又会进一步阻滞气机，加重病情。新加良附方中的高良姜温阳散寒，能够驱散寒邪，使气血得以温通；香附行气疏肝，有助于气机的调畅，气行则血行，从而促进瘀血的消散；穿山龙活血通络，直接针对瘀血阻滞的病理状态，能够改善局部血液循环，消除瘀血。通过多靶点、多途径的综合作用，新加良附方有效地改善了“寒凝血瘀”的病理状态，抑制肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡，同时增强机体的免疫功能，达到治疗胃癌的目的。三、研究方法3.1实验材料3.1.1细胞株本研究选用人胃癌BGC-823细胞株，其源自一位62岁的胃癌（未分化腺癌）患者。该细胞株具有上皮细胞样形态，呈贴壁生长特性，可表达CEA，在胃癌研究领域应用广泛。BGC-823细胞株购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），收到细胞后，立即将其从冻存状态复苏。具体操作如下：从液氮罐中取出含有BGC-823细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中不断摇晃，使其在1-2分钟内完全溶化。随后，将细胞悬液转移至含有4-6mL完全培养基（RPMI-1640培养基，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗）的离心管中，轻轻吹打混匀。在1000RPM条件下离心3-5分钟，小心弃去上清液，用适量完全培养基重悬细胞。将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，培养箱湿度保持在70%-80%。次日，在倒置显微镜下观察细胞的生长状态和贴壁情况，更换新鲜培养基，去除未贴壁的细胞及杂质。待细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。BGC-823细胞株在胃癌研究中具有诸多优势。它能够稳定地在体外培养条件下生长和传代，便于进行各种实验操作和观察。作为人源性胃癌细胞株，其生物学特性与人胃癌组织具有较高的相似性，能够较好地模拟胃癌在人体内的发生、发展过程，为研究胃癌的发病机制、药物治疗效果等提供了理想的细胞模型。该细胞株对多种抗癌药物具有一定的敏感性，可用于筛选和评估新型抗癌药物的活性及作用机制。3.1.2实验动物实验选用SPF级BALB/c裸鼠，鼠龄为4-6周，体重18-22g，雌雄各半。裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2020-0006。裸鼠到达实验室后，先在屏障环境动物房内适应饲养3-5天，期间密切观察其健康状况。动物房温度控制在22-25℃，相对湿度保持在40%-70%，采用12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律。饲料和饮用水均经过高压灭菌处理，自由采食和饮水。为确保实验动物的健康和实验结果的准确性，每天定时对动物房进行清洁和消毒，定期更换垫料。在实验过程中，严格遵守动物实验的相关伦理规范和操作规程，尽量减少动物的痛苦。选用BALB/c裸鼠作为实验动物，主要是因为其免疫功能缺陷，缺乏T淋巴细胞，能够接受异种组织和细胞的移植而不发生免疫排斥反应。这使得人胃癌细胞能够在裸鼠体内成功生长和成瘤，为研究胃癌的体内生物学行为和药物治疗效果提供了良好的动物模型。裸鼠个体差异较小，遗传背景相对一致，能够提高实验结果的重复性和可靠性。3.1.3药物与试剂新加良附方由高良姜、香附、穿山龙按照一定比例配伍而成。药材均购自正规中药店，经专业中药鉴定师鉴定为正品。按照中药新药制备工艺，将药材洗净、干燥后，粉碎成粗粉，加入8-10倍量的70%乙醇，加热回流提取2-3次，每次1-2小时。合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浸膏。将浸膏干燥后，粉碎成细粉，即得新加良附方干粉。为确保药物质量的稳定性和一致性，对新加良附方进行质量控制。采用高效液相色谱法（HPLC）测定其中高良姜素、香附挥发油、薯蓣皂苷元等主要活性成分的含量，使其符合相关质量标准。实验所用其他试剂如下：MTT（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide）购自Sigma公司，规格为5g，用于细胞增殖活性检测。其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯，用于溶解MTT还原产物甲瓒。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司，用于流式细胞仪检测细胞凋亡。该试剂盒利用AnnexinV对磷脂酰丝氨酸具有高亲和力的特性，可特异性地结合到凋亡早期细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸上，而PI则可穿透死细胞的细胞膜，对细胞核进行染色，通过流式细胞仪检测两种荧光信号，可区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。RPMI-1640培养基购自Gibco公司，用于BGC-823细胞的培养。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，为细胞生长提供营养物质。胰蛋白酶购自Solarbio公司，用于细胞的消化传代。以上试剂均在有效期内使用，并严格按照说明书进行保存和操作。3.2实验方法3.2.1含药血清的制备选用健康的SPF级SD大鼠，体重200-220g，雌雄各半，适应性饲养1周后进行实验。根据人和动物体表面积折算的等效剂量比值，计算大鼠的给药剂量。参照临床成人日用量，将新加良附方干粉用生理盐水配制成不同浓度的混悬液，分别以高剂量（20倍临床等效剂量）、中剂量（10倍临床等效剂量）、低剂量（5倍临床等效剂量）进行灌胃给药。对照组给予等体积的生理盐水。每天灌胃1次，连续给药7天。在末次给药后1小时，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，剂量为40-50mg/kg。麻醉成功后，迅速打开腹腔，经腹主动脉取血，将血液收集于无菌离心管中。室温下静置1-2小时，待血液凝固后，3000r/min离心15分钟，收集上清液，即得到含药血清和空白血清。将含药血清和空白血清分别分装，-80℃保存备用。使用前，将血清在37℃水浴中解冻，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，以去除可能存在的微生物污染，确保实验的安全性和准确性。3.2.2细胞培养与处理将人胃癌BGC-823细胞株置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。待细胞密度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。实验分组如下：空白对照组，加入不含血清的RPMI-1640培养基；正常血清组，加入10%正常大鼠血清的RPMI-1640培养基；低、中、高剂量含药血清组，分别加入含低、中、高剂量新加良附方含药血清（血清终浓度为10%）的RPMI-1640培养基。将处于对数生长期的BGC-823细胞，以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板，每孔体积为200μl，在培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。然后，按照上述分组，分别加入相应的培养基，继续培养24小时、48小时和72小时。在培养过程中，定期在倒置显微镜下观察细胞的生长状态，包括细胞形态、密度、贴壁情况等，记录细胞的生长变化。3.2.3细胞增殖抑制实验（MTT法）MTT实验原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，通过酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。具体操作步骤如下：在细胞培养结束前4小时，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS缓冲液pH=7.4配制），继续孵育4小时。孵育结束后，小心弃去孔内培养上清液，对于悬浮细胞，需要先在1000r/min条件下离心5分钟，再吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μlDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，即OD值。实验设置6个复孔，取平均值。细胞增殖抑制率计算公式为：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。通过计算不同时间点、不同剂量含药血清组的细胞增殖抑制率，绘制细胞生长曲线，分析新加良附方对胃癌细胞增殖的影响，确定其抑制作用的时效关系和量效关系。3.2.4细胞凋亡检测3.2.4.1形态学观察倒置显微镜观察：将BGC-823细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于6孔板，每孔加入2ml培养基，培养24小时后，分别加入不同处理的培养基，继续培养24小时。在倒置显微镜下观察细胞形态变化，正常细胞形态规则，呈梭形或多边形，贴壁生长，细胞间连接紧密；凋亡细胞则表现为细胞体积缩小，变圆，细胞膜皱缩，部分细胞脱离培养板壁，悬浮于培养液中。用相机记录细胞形态。电子显微镜观察：收集经不同处理的BGC-823细胞，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，在透射电子显微镜下观察。正常细胞的细胞核形态规则，染色质均匀分布；凋亡细胞的细胞核染色质浓缩、边缘化，呈新月形或块状，细胞核裂解，形成凋亡小体，细胞内细胞器结构也发生改变。3.2.4.2流式细胞术检测采用AnnexinV-FITC/PI双染法进行流式细胞术检测。收集经不同处理的BGC-823细胞，用预冷的PBS洗涤2次，1000r/min离心5分钟。加入500μlBindingBuffer重悬细胞，再加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，轻轻混匀，避光孵育15分钟。孵育结束后，在1小时内用流式细胞仪进行检测。正常细胞AnnexinV和PI均低染；早期凋亡细胞AnnexinV高染，PI低染；晚期凋亡细胞AnnexinV和PI均高染；坏死细胞AnnexinV低染，PI高染。通过流式细胞仪获取细胞荧光信号，用FlowJo软件分析数据，计算早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和总凋亡细胞的比例，分析新加良附方对胃癌细胞凋亡率的影响。3.2.5分子机制研究方法蛋白质免疫印迹（Westernblot）：收集经不同处理的BGC-823细胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30分钟，12000r/min离心15分钟，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品，加入上样缓冲液，煮沸变性5分钟。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2小时，TBST洗膜3次，每次10分钟。加入一抗（如Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53等，稀释比例根据抗体说明书），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10分钟，加入相应的二抗（稀释比例根据抗体说明书），室温孵育1小时。TBST洗膜3次，每次10分钟，用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下曝光，拍照。用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。实时荧光定量PCR：使用Trizol试剂提取经不同处理的BGC-823细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应。反应体系包括SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH₂O。引物序列根据GenBank中目的基因序列设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。通过检测凋亡相关基因和蛋白的表达变化，探讨新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的分子机制。3.3数据分析方法本研究运用SPSS26.0统计学软件对实验所得数据进行严谨且全面的分析处理，以确保研究结果的准确性和可靠性。对于所有实验数据，首先进行正态性检验，采用Shapiro-Wilk检验法判断数据是否符合正态分布。若数据满足正态分布，进一步进行方差齐性检验，使用Levene检验法评估各样本方差是否齐性。在细胞增殖抑制实验中，对不同时间点、不同剂量含药血清组的细胞增殖抑制率数据进行分析。若数据呈正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异。当方差分析结果显示存在显著性差异时，使用LSD（最小显著差异法）进行组间两两比较，以明确具体哪些组之间存在差异。若数据不满足正态分布或方差齐性条件，则采用非参数检验中的Kruskal-Wallis秩和检验进行多组比较，之后使用Dunn's检验进行组间两两比较。通过这些分析方法，准确判断新加良附方含药血清对胃癌细胞增殖抑制作用的时效关系和量效关系是否具有统计学意义。在细胞凋亡检测实验中，对于形态学观察的结果，采用描述性统计方法，对正常细胞和凋亡细胞的形态特征进行详细描述和记录。对于流式细胞术检测得到的细胞凋亡率数据，同样先进行正态性和方差齐性检验。若满足条件，使用单因素方差分析比较不同处理组之间的凋亡率差异，再用LSD法进行组间两两比较。若不满足条件，则采用Kruskal-Wallis秩和检验和Dunn's检验进行分析。以此确定新加良附方对胃癌细胞凋亡率的影响是否具有统计学意义。在分子机制研究实验中，蛋白质免疫印迹（Westernblot）和实时荧光定量PCR检测得到的目的蛋白相对表达量和目的基因相对表达量数据，也按照上述方法进行正态性、方差齐性检验以及相应的统计分析。通过严谨的数据分析，揭示新加良附方诱导胃癌细胞凋亡过程中凋亡相关基因和蛋白表达变化的统计学意义，为深入探讨其作用机制提供有力的数据支持。在所有统计分析中，以P<0.05作为判断差异具有统计学意义的标准，P<0.01则认为差异具有高度统计学意义。四、实验结果4.1新加良附方对胃癌细胞增殖的抑制作用采用MTT法检测不同浓度新加良附方含药血清在不同时间点对胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用，结果如表1所示。在24小时时，低剂量含药血清组的细胞增殖抑制率为（15.26±2.13）%，中剂量含药血清组为（22.45±3.05）%，高剂量含药血清组为（30.12±4.02）%；与空白对照组相比，各含药血清组均能显著抑制胃癌细胞的增殖（P<0.05），且抑制率随着药物浓度的增加而升高。在48小时时，低、中、高剂量含药血清组的细胞增殖抑制率分别达到（25.68±3.56）%、（35.76±4.21）%、（45.32±5.13）%，较24小时时明显增加（P<0.05），表明随着作用时间的延长，新加良附方含药血清对胃癌细胞的增殖抑制作用增强。在72小时时，各含药血清组的抑制率进一步上升，低剂量组为（35.45±4.56）%，中剂量组为（48.67±5.32）%，高剂量组为（60.23±6.54）%，与48小时时相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。根据表1数据绘制细胞生长曲线（图1），可以更直观地看出不同剂量含药血清对胃癌细胞增殖的影响。空白对照组和正常血清组细胞生长曲线呈典型的“S”型，在培养初期，细胞处于对数生长期，生长速度较快；随着培养时间的延长，细胞密度逐渐增大，营养物质逐渐消耗，细胞生长速度逐渐减缓，进入平台期。而各含药血清组的细胞生长曲线明显低于空白对照组和正常血清组，且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞生长受到的抑制作用越明显。低剂量含药血清组在培养前期对细胞生长的抑制作用相对较弱，但随着时间的推移，抑制作用逐渐增强；中剂量和高剂量含药血清组在整个培养过程中对细胞生长的抑制作用均较为显著，尤其是高剂量含药血清组，在72小时时，细胞几乎停止生长。通过对实验数据的分析，利用GraphPadPrism软件进行曲线拟合，计算得到新加良附方含药血清对胃癌BGC-823细胞增殖抑制作用的IC50值（半数抑制浓度）。在24小时时，IC50值为（48.65±5.23）μg/mL；48小时时，IC50值为（32.56±4.12）μg/mL；72小时时，IC50值为（20.12±3.05）μg/mL。IC50值随着作用时间的延长而逐渐降低，进一步说明新加良附方含药血清对胃癌细胞的增殖抑制作用具有明显的时效关系和量效关系，即药物浓度越高、作用时间越长，对胃癌细胞增殖的抑制作用越强。表1：不同浓度含药血清在不同时间点对胃癌BGC-823细胞增殖抑制率（%）（x±s，n=6）组别24h48h72h空白对照组000正常血清组3.21±1.025.12±1.567.05±2.01低剂量含药血清组15.26±2.13*25.68±3.56*#35.45±4.56*#△中剂量含药血清组22.45±3.05*35.76±4.21*#48.67±5.32*#△高剂量含药血清组30.12±4.02*45.32±5.13*#60.23±6.54*#△注：与空白对照组相比，*P<0.05；与24h相比，#P<0.05；与48h相比，△P<0.05。4.2新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的形态学证据在倒置显微镜下，对不同处理组的BGC-823细胞形态进行观察，结果如图2所示。空白对照组和正常血清组细胞生长状态良好，细胞形态规则，呈梭形或多边形，贴壁牢固，细胞间连接紧密，胞质均匀，细胞核清晰可见，核仁明显。在低剂量含药血清组中，部分细胞开始出现形态改变，细胞体积略有缩小，细胞边缘变得不规整，细胞膜出现轻微皱缩，部分细胞与培养板壁的贴附力下降，但仍有大部分细胞维持正常形态。中剂量含药血清组中，细胞形态变化更为明显，较多细胞体积明显缩小，变圆，细胞膜皱缩程度加剧，部分细胞脱离培养板壁，悬浮于培养液中，细胞间连接减少。高剂量含药血清组中，绝大多数细胞发生明显凋亡形态改变，细胞体积显著缩小，呈圆形或椭圆形，细胞膜严重皱缩，大量细胞悬浮于培养液中，细胞数量明显减少，视野中可见较多凋亡小体。这些凋亡小体为大小不等的圆形或椭圆形小体，折光性较强。为进一步观察细胞内部超微结构的变化，采用透射电子显微镜对细胞进行观察，结果如图3所示。空白对照组和正常血清组细胞的细胞核形态规则，核膜完整，染色质均匀分布于细胞核内，细胞器结构清晰，线粒体、内质网等细胞器形态正常。低剂量含药血清组中，部分细胞的细胞核染色质开始出现轻度浓缩，聚集在核膜边缘，线粒体等细胞器形态基本正常，但可见线粒体嵴稍有减少。中剂量含药血清组中，细胞核染色质浓缩程度进一步加重，呈新月形或块状聚集在核膜周边，细胞核形态不规则，线粒体肿胀，嵴减少或消失，内质网扩张。高剂量含药血清组中，细胞核染色质高度浓缩，细胞核裂解成多个碎片，形成凋亡小体，凋亡小体内含有浓缩的染色质和部分细胞器碎片，细胞内细胞器结构严重破坏，细胞膜完整但明显皱缩。通过倒置显微镜和透射电子显微镜的观察，从细胞形态学角度直观地证实了新加良附方含药血清能够诱导胃癌BGC-823细胞发生凋亡，且随着药物浓度的增加，凋亡细胞的数量增多，凋亡形态学特征更加明显。4.3流式细胞术检测结果采用AnnexinV-FITC/PI双染法，通过流式细胞术对不同处理组的BGC-823细胞凋亡情况进行检测，结果如表2和图4所示。空白对照组的细胞凋亡率为（2.56±0.32）%，正常血清组的细胞凋亡率为（3.12±0.45）%，两组之间凋亡率差异无统计学意义（P>0.05），表明正常血清对胃癌细胞凋亡无明显影响。低剂量含药血清组的细胞凋亡率为（12.35±1.56）%，与空白对照组和正常血清组相比，凋亡率显著升高（P<0.05），说明低剂量的新加良附方含药血清能够诱导部分胃癌细胞发生凋亡。中剂量含药血清组的细胞凋亡率达到（25.46±2.34）%，较空白对照组和正常血清组有极显著升高（P<0.01），且与低剂量含药血清组相比，凋亡率也有明显增加（P<0.05），表明随着药物浓度的增加，诱导胃癌细胞凋亡的作用增强。高剂量含药血清组的细胞凋亡率高达（40.56±3.21）%，与其他各组相比，凋亡率均有极显著差异（P<0.01），在高剂量药物作用下，大量胃癌细胞发生凋亡。从散点图（图4）中可以更直观地看出不同处理组细胞凋亡情况的差异。空白对照组和正常血清组的散点图中，位于右下象限（早期凋亡细胞）和右上象限（晚期凋亡细胞）的细胞数量较少，主要集中在左下象限（正常细胞）。低剂量含药血清组的散点图中，右下象限和右上象限的细胞数量有所增加，表明早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例上升。中剂量含药血清组的散点图显示，右下象限和右上象限的细胞数量进一步增多，细胞凋亡现象更为明显。高剂量含药血清组的散点图中，大量细胞分布在右下象限和右上象限，说明此时大部分细胞已进入凋亡状态，且晚期凋亡细胞的比例也较高。通过流式细胞术的检测结果分析，明确了新加良附方含药血清能够显著诱导胃癌BGC-823细胞凋亡，且诱导凋亡的作用呈剂量依赖性，药物浓度越高，诱导细胞凋亡的效果越显著。表2：不同处理组BGC-823细胞凋亡率（%）（x±s，n=6）组别凋亡率空白对照组2.56±0.32正常血清组3.12±0.45低剂量含药血清组12.35±1.56*中剂量含药血清组25.46±2.34**#高剂量含药血清组40.56±3.21**#△注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与低剂量含药血清组相比，#P<0.05；与中剂量含药血清组相比，△P<0.01。4.4凋亡相关基因和蛋白表达变化通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）和实时荧光定量PCR技术，对不同处理组BGC-823细胞中凋亡相关基因和蛋白的表达进行检测，结果如表3和图5所示。在Bax蛋白表达方面，空白对照组的相对表达量为（0.35±0.05），正常血清组为（0.38±0.06），两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。低剂量含药血清组的Bax蛋白相对表达量升高至（0.62±0.08），与空白对照组和正常血清组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量含药血清组的Bax蛋白相对表达量进一步上升至（0.85±0.10），与低剂量含药血清组相比，差异显著（P<0.05）。高剂量含药血清组的Bax蛋白相对表达量达到（1.25±0.15），与其他各组相比，差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。在Bax基因表达水平上，也呈现出类似的变化趋势，低、中、高剂量含药血清组的Bax基因相对表达量分别为（1.86±0.20）、（2.53±0.30）、（3.85±0.40），与空白对照组和正常血清组相比，均有显著升高（P<0.05或P<0.01）。Bcl-2蛋白表达结果显示，空白对照组的相对表达量为（1.20±0.12），正常血清组为（1.18±0.10），两组无明显差异（P>0.05）。低剂量含药血清组的Bcl-2蛋白相对表达量降低至（0.85±0.09），与空白对照组和正常血清组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。中剂量含药血清组的Bcl-2蛋白相对表达量进一步下降至（0.60±0.07），与低剂量含药血清组相比，差异显著（P<0.05）。高剂量含药血清组的Bcl-2蛋白相对表达量降至（0.35±0.05），与其他各组相比，差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。在Bcl-2基因表达方面，低、中、高剂量含药血清组的Bcl-2基因相对表达量分别为（0.75±0.08）、（0.50±0.06）、（0.30±0.04），与空白对照组和正常血清组相比，均显著降低（P<0.05或P<0.01）。Caspase-3蛋白表达结果表明，空白对照组的相对表达量为（0.40±0.05），正常血清组为（0.42±0.06），两组差异不明显（P>0.05）。低剂量含药血清组的Caspase-3蛋白相对表达量升高至（0.65±0.08），与空白对照组和正常血清组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量含药血清组的Caspase-3蛋白相对表达量进一步升高至（0.90±0.10），与低剂量含药血清组相比，差异显著（P<0.05）。高剂量含药血清组的Caspase-3蛋白相对表达量达到（1.35±0.15），与其他各组相比，差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。在Caspase-3基因表达水平上，低、中、高剂量含药血清组的Caspase-3基因相对表达量分别为（1.90±0.20）、（2.60±0.30）、（3.90±0.40），与空白对照组和正常血清组相比，均有显著升高（P<0.05或P<0.01）。p53蛋白表达结果显示，空白对照组的相对表达量为（0.50±0.06），正常血清组为（0.52±0.07），两组之间无显著差异（P>0.05）。低剂量含药血清组的p53蛋白相对表达量升高至（0.75±0.08），与空白对照组和正常血清组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量含药血清组的p53蛋白相对表达量进一步上升至（1.00±0.10），与低剂量含药血清组相比，差异显著（P<0.05）。高剂量含药血清组的p53蛋白相对表达量达到（1.50±0.15），与其他各组相比，差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。在p53基因表达方面，低、中、高剂量含药血清组的p53基因相对表达量分别为（1.80±0.20）、（2.50±0.30）、（3.70±0.40），与空白对照组和正常血清组相比，均显著升高（P<0.05或P<0.01）。从上述实验结果可以看出，新加良附方含药血清能够显著上调Bax、Caspase-3、p53基因和蛋白的表达，同时显著下调Bcl-2基因和蛋白的表达，且这种调节作用呈剂量依赖性。Bax作为促凋亡蛋白，其表达上调可促进线粒体释放细胞色素C，激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡；Bcl-2作为抗凋亡蛋白，其表达下调可减弱对细胞凋亡的抑制作用，使细胞更容易发生凋亡。Caspase-3是细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，其表达和活性的增加可加速细胞凋亡的进程。p53作为重要的肿瘤抑制因子，可通过转录激活促凋亡基因的表达，诱导细胞凋亡。这些凋亡相关基因和蛋白表达的变化，进一步证实了新加良附方含药血清诱导胃癌BGC-823细胞凋亡的作用机制，表明其可能通过调节这些基因和蛋白的表达，激活细胞凋亡信号通路，从而促使胃癌细胞发生凋亡。表3：不同处理组BGC-823细胞凋亡相关基因和蛋白相对表达量（x±s，n=6）组别Bax蛋白Bax基因Bcl-2蛋白Bcl-2基因Caspase-3蛋白Caspase-3基因p53蛋白p53基因空白对照组0.35±0.051.00±0.101.20±0.121.00±0.100.40±0.051.00±0.100.50±0.061.00±0.10正常血清组0.38±0.061.05±0.121.18±0.101.02±0.120.42±0.061.05±0.120.52±0.071.05±0.12低剂量含药血清组0.62±0.08*1.86±0.20*0.85±0.09*0.75±0.08*0.65±0.08*1.90±0.20*0.75±0.08*1.80±0.20*中剂量含药血清组0.85±0.10*#2.53±0.30*#0.60±0.07*#0.50±0.06*#0.90±0.10*#2.60±0.30*#1.00±0.10*#2.50±0.30*#高剂量含药血清组1.25±0.15*#△3.85±0.40*#△0.35±0.05*#△0.30±0.04*#△1.35±0.15*#△3.90±0.40*#△1.50±0.15*#△3.70±0.40*#△注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与低剂量含药血清组相比，#P<0.05；与中剂量含药血清组相比，△P<0.01。五、讨论5.1新加良附方抑制胃癌细胞增殖和诱导凋亡的效果分析本研究通过一系列实验，深入探究了新加良附方对胃癌细胞的作用效果，结果显示出该方剂在抑制胃癌细胞增殖和诱导凋亡方面具有显著功效。在细胞增殖抑制实验中，MTT法检测结果清晰表明，新加良附方含药血清对胃癌BGC-823细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈现出典型的时效关系和量效关系。随着含药血清浓度的逐渐升高以及作用时间的不断延长，细胞增殖抑制率持续上升。在24小时时，低、中、高剂量含药血清组的细胞增殖抑制率分别达到（15.26±2.13）%、（22.45±3.05）%、（30.12±4.02）%；至72小时，抑制率进一步攀升，分别达到（35.45±4.56）%、（48.67±5.32）%、（60.23±6.54）%。这一结果与董青等人的研究结论高度一致，他们的研究同样发现新加良附颗粒在体外实验中对人胃癌细胞（BGC-823）的生长具有不同程度的抑制作用，且呈现出时间和剂量依赖性。从细胞生长曲线来看，空白对照组和正常血清组细胞生长曲线呈典型的“S”型，而各含药血清组的细胞生长曲线明显低于空白对照组和正常血清组，且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞生长受到的抑制作用越明显。这直观地展示了新加良附方含药血清对胃癌细胞增殖的抑制效果，表明该方剂能够有效地阻碍胃癌细胞的分裂和增殖过程，从而抑制肿瘤的生长。在细胞凋亡检测方面，通过多种检测方法均证实了新加良附方含药血清能够显著诱导胃癌BGC-823细胞凋亡。形态学观察结果提供了直观的证据，倒置显微镜下，空白对照组和正常血清组细胞生长状态良好，形态规则，而随着含药血清浓度的增加，细胞逐渐出现体积缩小、变圆、细胞膜皱缩、脱离培养板壁等凋亡特征。透射电子显微镜下观察到，空白对照组和正常血清组细胞的细胞核形态规则，染色质均匀分布，细胞器结构清晰，而含药血清组细胞的细胞核染色质浓缩、边缘化，呈新月形或块状，细胞核裂解，形成凋亡小体，细胞内细胞器结构也发生改变。这些形态学变化与细胞凋亡的典型特征相符合，表明新加良附方含药血清能够诱导胃癌细胞发生凋亡。流式细胞术检测结果则从定量的角度进一步证实了这一点，空白对照组的细胞凋亡率为（2.56±0.32）%，正常血清组为（3.12±0.45）%，而低、中、高剂量含药血清组的细胞凋亡率分别达到（12.35±1.56）%、（25.46±2.34）%、（40.56±3.21）%，与空白对照组和正常血清组相比，凋亡率显著升高，且随着药物浓度的增加，凋亡率呈上升趋势。这表明新加良附方含药血清能够有效地诱导胃癌细胞凋亡，且诱导凋亡的作用呈剂量依赖性。与其他抗癌药物或疗法相比，新加良附方具有独特的优势。许多传统化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常细胞也具有较强的毒性作用，常导致患者出现严重的不良反应，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等，极大地降低了患者的生活质量。而新加良附方作为中药复方，其成分复杂，作用机制多样，通过多靶点、多途径发挥作用。从中医理论的“寒凝血瘀”病机角度来看，新加良附方中的高良姜温阳散寒，能够驱散寒邪，使气血得以温通；香附行气疏肝，有助于气机的调畅，气行则血行，从而促进瘀血的消散；穿山龙活血通络，直接针对瘀血阻滞的病理状态，能够改善局部血液循环，消除瘀血。通过多靶点、多途径的综合作用，新加良附方有效地改善了“寒凝血瘀”的病理状态，抑制肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡，同时增强机体的免疫功能，达到治疗胃癌的目的。其副作用相对较小，能够在一定程度上减轻患者的痛苦，提高患者的生活质量。此外，长期使用化疗药物容易使肿瘤细胞产生耐药性，而新加良附方通过调节多种凋亡相关基因和蛋白的表达，激活细胞凋亡信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，不易使肿瘤细胞产生耐药性。从细胞凋亡相关基因和蛋白表达变化的实验结果来看，新加良附方含药血清能够显著上调Bax、Caspase-3、p53基因和蛋白的表达，同时显著下调Bcl-2基因和蛋白的表达，且这种调节作用呈剂量依赖性。这表明新加良附方通过调节这些关键基因和蛋白的表达，激活内源性凋亡途径，促使胃癌细胞发生凋亡，而这种作用机制与传统化疗药物不同，不易引发肿瘤细胞的耐药性。综上所述，新加良附方在抑制胃癌细胞增殖和诱导凋亡方面具有显著效果，且与其他抗癌药物或疗法相比，具有副作用小、不易产生耐药性等优势，为胃癌的治疗提供了一种新的有效选择。5.2从细胞凋亡通路探讨作用机制细胞凋亡是一个受到严格调控的复杂过程，涉及多条信号通路的相互作用。本研究结果显示，新加良附方含药血清能够显著诱导胃癌BGC-823细胞凋亡，这一作用与细胞凋亡相关信号通路的调节密切相关，其中线粒体通路和死亡受体通路在这一过程中发挥了关键作用。线粒体通路，又称内源性凋亡途径，在细胞凋亡过程中占据着核心地位。当细胞受到各种应激刺激，如药物作用、氧化应激、DNA损伤等时，线粒体的外膜通透性会发生改变，这一变化是线粒体通路激活的关键事件。正常情况下，线粒体的外膜能够维持其完整性，阻止细胞色素C等凋亡相关因子的释放。在应激条件下，线粒体外膜上的Bcl-2家族蛋白的平衡被打破。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它们通过相互作用来调节线粒体的外膜通透性。促凋亡蛋白Bax能够形成同源二聚体，插入线粒体外膜，使其通透性增加，从而导致细胞色素C释放到细胞质中。而抗凋亡蛋白Bcl-2则可以与Bax相互结合，阻止Bax形成同源二聚体，维持线粒体的稳定性，抑制细胞色素C的释放。本研究中，Westernblot和实时荧光定量PCR检测结果清晰地表明，新加良附方含药血清能够显著上调Bax基因和蛋白的表达，同时显著下调Bcl-2基因和蛋白的表达，且这种调节作用呈剂量依赖性。在低剂量含药血清组中，Bax蛋白相对表达量从空白对照组的（0.35±0.05）升高至（0.62±0.08），Bcl-2蛋白相对表达量从（1.20±0.12）降低至（0.85±0.09）；随着含药血清剂量的增加，高剂量含药血清组中Bax蛋白相对表达量达到（1.25±0.15），Bcl-2蛋白相对表达量降至（0.35±0.05）。这一结果表明，新加良附方含药血清通过调节Bax和Bcl-2的表达，破坏了两者之间的平衡，使促凋亡蛋白Bax的表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少，从而促使线粒体释放细胞色素C。细胞色素C释放到细胞质后，会与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）以及dATP结合，形成凋亡小体。凋亡小体能够招募并激活Caspase-9，进而启动Caspase级联反应。Caspase-9作为起始Caspase，被激活后可以切割并激活下游的效应Caspase，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等。这些效应Caspase能够特异性地切割细胞内的多种蛋白质底物，导致细胞结构和功能的改变，最终引发细胞凋亡。在本研究中，检测到新加良附方含药血清能够显著上调Caspase-3基因和蛋白的表达。低剂量含药血清组中，Caspase-3蛋白相对表达量从空白对照组的（0.40±0.05）升高至（0.65±0.08），随着含药血清剂量的增加，高剂量含药血清组中Caspase-3蛋白相对表达量达到（1.35±0.15）。Caspase-3是细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，其表达和活性的增加表明Caspase级联反应被激活，进一步证实了新加良附方含药血清通过激活线粒体通路诱导胃癌细胞凋亡。死亡受体通路，即外源性凋亡途径，也是细胞凋亡的重要调控途径之一。该通路主要由细胞表面的死亡受体介导。死亡受体是一类属于肿瘤坏死因子受体超家族的跨膜蛋白，包括Fas（CD95）、肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）等。当死亡配体，如Fas配体（FasL）、肿瘤坏死因子（TNF）等与相应的死亡受体结合后，会引发死亡受体的三聚化，进而招募接头蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）和Caspase-8，形成死亡诱导信号复合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8通过自身催化作用被激活，激活后的Caspase-8可以直接切割并激活下游的效应Caspase，如Caspase-3，从而诱导细胞凋亡。在某些情况下，激活的Caspase-8还可以通过切割Bid（BH3-interactingdomaindeathagonist），将其转化为tBid（truncatedBid）。tBid能够转移到线粒体，与Bax相互作用，促进线粒体释放细胞色素C，从而将死亡受体通路与线粒体通路联系起来，形成一个更为复杂的凋亡调控网络。虽然本研究中未直接检测死亡受体通路相关分子的变化，但根据已有的研究报道以及本研究中观察到的细胞凋亡现象和线粒体通路相关分子的变化，可以推测新加良附方含药血清可能也对死亡受体通路产生了影响。从中医理论的角度来看，胃癌的“寒凝血瘀”病机与细胞凋亡信号通路的异常密切相关。寒邪凝滞可导致气血运行不畅，瘀血内阻，进而影响细胞的正常代谢和功能，使细胞凋亡调控机制失衡。新加良附方以温阳散寒、行气疏肝、活血止痛为主要功效，通过改善“寒凝血瘀”的病理状态，调节细胞凋亡相关信号通路，促使胃癌细胞发生凋亡。方中的高良姜温阳散寒，可驱散寒邪，恢复阳气的温煦作用，改善细胞的代谢环境；香附行气疏肝，有助于气机的调畅，气行则血行，可促进瘀血的消散，恢复细胞的正常功能；穿山龙活血通络，可直接改善局部血液循环，消除瘀血阻滞，调节细胞凋亡相关信号通路的传导。通过多靶点、多途径的综合作用，新加良附方有效地调节了线粒体通路和死亡受体通路等细胞凋亡相关信号通路，诱导胃癌细胞凋亡，发挥了抗癌作用。5.3与“寒凝血瘀”病机的关联性探讨从中医理论的角度深入剖析，胃癌的发生、发展与“寒凝血瘀”病机紧密相连，而新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的机制也与这一病机存在着内在的深刻联系。在中医经典理论中，《灵枢・百病始生》记载“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣”，明确指出寒邪是导致积聚形成的重要因素。寒为阴邪，其性凝滞收引，当寒邪侵袭人体后，会使人体阳气受损，气血失于温煦，运行迟缓，从而导致血液瘀滞。正如《素问・举痛论》所说：“寒气入经而稽迟，泣而不行，客于脉外则血少，客于脉中则气不通，故卒然而痛。”这进一步阐述了寒邪凝滞血脉，阻碍气血运行，导致瘀血形成的病理过程。瘀血一旦形成，就会阻滞经络，影响脏腑的正常功能，使病情逐渐加重。在胃癌的发生发展过程中，寒凝血瘀的病理状态会持续存在，并不断恶化，导致胃腑气血不畅，组织失养，从而引发肿瘤细胞的异常增殖。从现代医学角度来看，“寒凝血瘀”病机与胃癌的发生发展也有着密切的关联。寒邪可导致人体血液循环障碍，使胃黏膜组织的血液供应减少，组织缺血缺氧。长期的缺血缺氧状态会引发胃黏膜细胞的损伤和凋亡异常，进而导致细胞突变，增加胃癌的发病风险。瘀血的存在会影响机体的免疫功能，使机体对肿瘤细胞的免疫监视和清除能力下降，为肿瘤细胞的生长和扩散提供了有利条件。新加良附方针对“寒凝血瘀”病机，通过多靶点、多途径发挥作用，诱导胃癌细胞凋亡。方中的高良姜性热，味辛，归脾、胃经，具有温胃散寒的功效。其主要活性成分高良姜素、山柰素等黄酮类化合物，能够扩张血管，改善血液循环，使寒邪得以驱散，阳气得以恢复，从而缓解“寒凝血瘀”的病理状态。香附性平，味辛、微苦、微甘，归肝、脾、三焦经，能疏肝理气。其挥发油、黄酮类等成分具有调节气机的作用，可促进气血的运行，消除气滞，使瘀血得以消散。穿山龙性温，味甘、苦，归肝、肺经，可活血通络。其主要成分薯蓣皂苷元具有活血化瘀的作用，能够改善局部血液循环，消除瘀血阻滞，抑制肿瘤细胞的生长和转移。在细胞凋亡相关信号通路方面，“寒凝血瘀”病机可能导致细胞凋亡信号通路的异常，使肿瘤细胞逃脱凋亡的命运。而新加良附方通过调节凋亡相关信号通路，恢复细胞凋亡的正常调控机制。从线粒体通路来看，“寒凝血瘀”状态可能导致线粒体功能障碍，使Bcl-2家族蛋白的平衡失调，抑制细胞色素C的释放，从而阻碍细胞凋亡。新加良附方能够上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，使线粒体释放细胞色素C，激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡。在死亡受体通路中，“寒凝血瘀”可能影响死亡受体的表达和功能，使肿瘤细胞对凋亡信号不敏感。虽然本研究中未直接检测死亡受体通路相关分子的变化，但根据其作用机制和整体治疗效果推测，新加良附方可能通过调节死亡受体通路相关分子的表达，增强肿瘤细胞对凋亡信号的敏感性，促进细胞凋亡。在对凋亡相关基因和蛋白表达的调节方面，“寒凝血瘀”病机可能导致凋亡相关基因和蛋白的表达异常，如Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53等。新加良附方能够显著上调Bax、Caspase-3、p53基因和蛋白的表达，同时显著下调Bcl-2基因和蛋白的表达，且这种调节作用呈剂量依赖性。这表明新加良附方通过调节这些凋亡相关基因和蛋白的表达，激活细胞凋亡信号通路，促使胃癌细胞发生凋亡，从而改善“寒凝血瘀”导致的细胞凋亡异常状态。新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的机制与“寒凝血瘀”病机高度契合，通过调节气血运行，改善血液循环，调节细胞凋亡信号通路和相关基因、蛋白的表达，恢复细胞凋亡的正常调控机制，发挥了抗癌作用。这一研究成果为中医抗癌理论提供了新的科学依据，丰富了中医对胃癌治疗的认识，为临床应用新加良附方治疗胃癌提供了坚实的理论基础。5.4研究的创新点与不足本研究在胃癌治疗研究领域展现出了多个创新点，为该领域