基于对虾过敏原致敏模型的抗过敏乳酸菌筛选及调控机制研究

基于对虾过敏原致敏模型的抗过敏乳酸菌筛选及调控机制研究一、引言1.1研究背景食物过敏作为一种全球性的公共卫生问题，近年来其发病率呈显著上升趋势。据统计，全球约有2-25%的人口受到食物过敏的困扰，且这一数字仍在持续攀升。食物过敏不仅严重影响患者的生活质量，还可能导致一系列并发症，如过敏性休克等，甚至危及生命。在众多食物过敏原中，海鲜类食物过敏尤为常见，其中对虾过敏又是海鲜过敏的重要组成部分。对虾因其味道鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，然而，对虾中含有的多种过敏原蛋白，如原肌球蛋白、肌球蛋白轻链、精氨酸激酶等，能够引发人体免疫系统的异常反应，导致过敏症状的出现。这些症状涵盖皮肤、呼吸道、胃肠道等多个系统，具体表现为皮肤瘙痒、红疹、流涕、咳嗽、恶心、呕吐、腹泻等，给患者带来极大的痛苦。乳酸菌作为一类重要的益生菌，广泛存在于自然界以及人体肠道中，对维持人体肠道微生态平衡和健康起着关键作用。近年来，越来越多的研究表明，乳酸菌具有潜在的抗过敏功效。其作用机制主要包括调节肠道菌群平衡，抑制有害菌的生长，减少食物过敏原的产生；调节免疫系统功能，如降低食物过敏原特异性IgE抗体水平，减轻过敏症状；增强肠道黏膜屏障功能，降低食物过敏反应的发生率等。乳酸菌在预防和治疗食物过敏方面展现出了巨大的潜力，为解决食物过敏问题提供了新的思路和方法。基于此，本研究聚焦于对虾过敏原致敏模型，旨在筛选出具有高效抗过敏活性的乳酸菌菌株，并深入探究其调控过敏反应的分子机制。这不仅有助于揭示乳酸菌抗过敏的作用原理，丰富乳酸菌在食品和医药领域的应用理论，还能够为开发安全、有效的抗过敏乳酸菌制剂提供科学依据和技术支持，对缓解食物过敏问题、保障消费者健康具有重要的现实意义。1.2国内外研究现状在对虾过敏机制的研究方面，国内外学者已取得了一定成果。研究表明，对虾过敏主要是由免疫球蛋白E（IgE）介导的速发型超敏反应。对虾中的原肌球蛋白被公认为主要过敏原，其氨基酸序列中的多个表位可与IgE特异性结合，引发过敏反应。此外，肌球蛋白轻链、精氨酸激酶等也被证实为对虾的次要过敏原，它们在过敏反应中同样发挥着重要作用。国内学者通过蛋白质组学技术，深入分析了对虾过敏原的蛋白组成和结构特征，为进一步理解过敏机制提供了重要依据；国外研究则侧重于从分子生物学角度，探究过敏原与免疫细胞表面受体的相互作用，以及过敏信号传导通路的调控机制。然而，目前对虾过敏机制的研究仍存在一些不足之处，例如对过敏反应中复杂的免疫调节网络认识尚浅，不同过敏原之间的协同作用机制也有待进一步明确。致敏模型的构建是研究食物过敏的关键环节。在对虾致敏模型构建方面，动物模型和细胞模型是常用的研究工具。动物模型中，小鼠因其遗传背景清晰、繁殖周期短、操作简便等优点，成为构建对虾致敏模型的首选动物。通过腹腔注射、灌胃等方式给予小鼠对虾过敏原，可成功诱导小鼠产生过敏症状，如皮肤瘙痒、皮疹、腹泻等，同时血清中IgE水平显著升高，这些症状和指标变化与人类对虾过敏反应具有一定的相似性。细胞模型则主要利用体外培养的免疫细胞，如肥大细胞、嗜碱性粒细胞等，研究对虾过敏原对细胞活性、细胞因子分泌以及信号传导通路的影响。近年来，3D细胞模型和类器官模型的出现，为更真实地模拟体内过敏微环境提供了新的思路和方法。但现有致敏模型也存在一定局限性，动物模型难以完全复制人类复杂的生理和免疫环境，细胞模型则缺乏体内复杂的细胞间相互作用和整体免疫调节机制，这些都限制了对过敏机制的深入研究。乳酸菌抗过敏的研究近年来备受关注。大量研究表明，乳酸菌可通过多种途径发挥抗过敏作用。一方面，乳酸菌能够调节肠道菌群平衡，抑制有害菌的生长，增加有益菌的数量，从而改善肠道微生态环境，减少食物过敏原的产生和吸收。另一方面，乳酸菌还可调节免疫系统功能，降低过敏原特异性IgE抗体水平，增加干扰素-γ（IFN-γ）等Th1型细胞因子的分泌，抑制白细胞介素-4（IL-4）等Th2型细胞因子的产生，纠正Th1/Th2细胞失衡状态，减轻过敏症状。此外，乳酸菌还能增强肠道黏膜屏障功能，通过增加紧密连接蛋白的表达，修复受损的肠黏膜，阻止过敏原穿透肠黏膜进入机体，降低过敏反应的发生率。国内外研究人员针对不同乳酸菌菌株的抗过敏效果进行了大量筛选和研究，发现不同菌株的抗过敏能力存在显著差异。但目前乳酸菌抗过敏的研究仍处于初级阶段，对于乳酸菌抗过敏的具体作用靶点和分子机制尚未完全明确，不同乳酸菌菌株之间的协同抗过敏作用研究也相对较少，这在一定程度上限制了乳酸菌在抗过敏领域的广泛应用。1.3研究目的与意义本研究旨在通过对虾过敏原致敏模型，筛选出具有高效抗过敏活性的乳酸菌菌株，并深入探究其调控过敏反应的分子机制。具体研究目的如下：一是构建稳定、可靠的对虾过敏原致敏模型，包括动物模型和细胞模型，为后续乳酸菌抗过敏研究提供有效的实验平台；二是从多种乳酸菌菌株中筛选出对抑制对虾过敏反应具有显著效果的菌株，并对其抗过敏活性进行系统评价；三是从免疫调节、肠道菌群调节、肠道黏膜屏障功能增强等多个角度，深入研究筛选出的乳酸菌菌株抗过敏的作用机制，明确其作用靶点和信号传导通路。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论意义方面，深入研究乳酸菌的抗过敏机制，有助于丰富和完善乳酸菌在免疫调节领域的理论体系，进一步揭示肠道微生态与免疫系统之间的相互作用关系，为理解食物过敏的发病机制提供新的视角和理论依据。在实际应用价值方面，筛选出的抗过敏乳酸菌菌株可以为开发新型抗过敏功能性食品、保健品和药品提供优质的菌株资源。通过将这些乳酸菌应用于食品加工领域，开发出具有抗过敏功能的发酵食品，如酸奶、发酵乳饮料等，能够为过敏人群提供更多安全、有效的饮食选择，帮助他们在享受美食的同时，降低过敏风险。此外，基于乳酸菌开发的抗过敏制剂，也有望为临床治疗食物过敏提供新的方法和手段，减轻过敏患者的痛苦，提高他们的生活质量，具有广阔的市场前景和社会效益。二、对虾过敏原致敏模型的构建与评价2.1对虾过敏原的提取与鉴定2.1.1对虾主要过敏原的确定对虾中含有多种过敏原蛋白，其中原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）被公认为是最主要的过敏原。原肌球蛋白是一种广泛存在于肌肉组织中的收缩调节蛋白，由两条α-螺旋链相互缠绕形成超螺旋结构，其相对分子质量约为36kDa。在对虾过敏反应中，原肌球蛋白的特定氨基酸序列形成的抗原表位能够与人体免疫系统中的IgE抗体特异性结合，激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，使其释放组胺、白三烯等生物活性介质，引发一系列过敏症状。例如，研究发现原肌球蛋白上的一些线性表位，如氨基酸残基序列40-48、51-63等区域，与IgE的结合能力较强，是导致过敏反应的关键位点。此外，原肌球蛋白的热稳定性较高，在常规的烹饪和加工过程中难以被完全破坏，这使得其致敏性能够在加工后的对虾制品中得以保留，增加了过敏人群接触过敏原的风险。除原肌球蛋白外，肌球蛋白轻链（Myosinlightchain，MLC）也是对虾的重要过敏原之一。肌球蛋白轻链参与肌肉的收缩和舒张过程，其相对分子质量约为16-25kDa。肌球蛋白轻链的结构特点包括多个结构域和特定的氨基酸残基排列，这些结构特征赋予了它与其他肌肉蛋白相互作用的能力，同时也决定了其抗原性。在过敏反应中，肌球蛋白轻链可以通过其独特的抗原表位与IgE结合，触发免疫反应。研究表明，肌球蛋白轻链的某些表位在不同对虾品种中具有较高的保守性，这可能导致不同对虾品种之间存在交叉过敏反应。此外，精氨酸激酶（Argininekinase，AK）也被证实为对虾过敏原。精氨酸激酶是一种参与能量代谢的酶，相对分子质量约为40kDa，其通过催化精氨酸和ATP之间的磷酸转移反应，为细胞提供能量。在过敏反应中，精氨酸激酶的特定结构域和氨基酸残基能够被免疫系统识别为外来抗原，引发IgE介导的过敏反应。2.1.2过敏原的提取方法本研究采用以下方法从对虾中提取过敏原：首先，选取新鲜的对虾，将其去头、去壳、去肠线后，用蒸馏水冲洗干净，去除表面杂质。然后，将虾肉切成小块，放入组织匀浆器中，加入适量的预冷磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.4），以1:20（w/v）的比例进行匀浆处理，使虾肉充分破碎，释放出细胞内的蛋白质。匀浆过程在冰浴中进行，以避免蛋白质因温度升高而变性。接着，将匀浆液在4℃下以8000r/min的转速离心20min，使细胞碎片、脂肪等杂质沉淀，取上清液。为了进一步去除杂蛋白，将上清液进行水浴加热处理，温度设定为80℃，时间为10min。加热过程中，大部分不耐热的杂蛋白会发生变性沉淀，而对虾过敏原如原肌球蛋白等由于其热稳定性较高，仍能保持溶解状态。加热结束后，迅速将上清液放入冰浴中冷却5min，然后以10000r/min的转速离心10min，去除沉淀的杂蛋白，收集上清液。随后，采用硫酸铵分级沉淀法对上清液中的过敏原进行初步纯化。向收集的上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其充分溶解。根据蛋白质在不同硫酸铵饱和度下的溶解度差异，逐步提高硫酸铵饱和度，使过敏原蛋白沉淀析出。本研究中，首先将硫酸铵饱和度调整至35%，在4℃下搅拌1h，使部分杂蛋白沉淀。然后以8000r/min的转速离心20min，收集上清液。接着，将上清液的硫酸铵饱和度提高至55%，同样在4℃下搅拌1h后离心，此时对虾过敏原蛋白会沉淀下来。将沉淀用适量的超纯水溶解，装入透析袋中，在4℃下用大量的PBS缓冲液进行透析，以去除残留的硫酸铵和其他小分子杂质。透析过程中，每隔4-6h更换一次透析液，持续透析24h，直至透析液中检测不到硫酸铵为止。最后，将透析后的溶液进行冷冻干燥处理，得到对虾过敏原粗提物，将其储存于-80℃冰箱中备用。2.1.3过敏原的鉴定与纯度分析为了鉴定提取的对虾过敏原，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术对其进行分析。首先，配制5%的浓缩胶和12%的分离胶，将冷冻干燥后的过敏原粗提物用适量的样品缓冲液溶解，使蛋白质充分变性。然后，取适量的样品上样到凝胶孔中，同时加入蛋白质分子量标准Marker作为对照。在恒定电压下进行电泳，使蛋白质在凝胶中按照分子量大小进行分离。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝染色液染色3-4h，使蛋白质条带充分显色。然后用脱色液进行脱色，直至背景清晰，蛋白质条带清晰可见。通过与Marker对比，可以确定提取物中蛋白质条带的分子量范围。在SDS-PAGE凝胶上，若观察到在相对分子质量约为36kDa处出现明显的条带，与原肌球蛋白的分子量相符，则初步表明提取物中含有原肌球蛋白。同时，若在其他预期的过敏原分子量位置也出现相应条带，则可进一步确认提取物中包含多种对虾过敏原。为了进一步验证提取物中过敏原的特性，采用免疫印迹（Westernblotting）技术进行鉴定。将SDS-PAGE分离后的蛋白质通过半干法转膜技术转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使蛋白质固定在膜上。然后，将PVDF膜用含有5%脱脂奶粉的封闭液在室温下封闭1-2h，以防止非特异性结合。封闭结束后，将膜与对虾过敏患者的阳性血清在4℃下孵育过夜，使血清中的IgE抗体与膜上的过敏原蛋白特异性结合。接着，用洗涤缓冲液充分洗涤膜，去除未结合的抗体。再将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgE二抗在室温下孵育1-2h，使二抗与结合在过敏原上的IgE抗体结合。最后，加入化学发光底物，利用化学发光成像系统检测膜上的条带。若在相应分子量位置出现发光条带，则表明提取物中的蛋白质能够与过敏患者血清中的IgE抗体特异性结合，从而证实其为对虾过敏原。对于提取的过敏原纯度分析，采用高效液相色谱（HPLC）技术进行检测。将适量的过敏原样品溶解在流动相中，通过进样器注入到HPLC系统中。HPLC系统采用C18反相色谱柱，以乙腈和水为流动相，通过梯度洗脱的方式对样品中的蛋白质进行分离。在分离过程中，蛋白质在色谱柱中的保留时间与其结构和性质有关，不同的蛋白质会在不同的时间被洗脱出来，形成相应的色谱峰。通过检测色谱峰的面积和数量，可以计算出过敏原的纯度。若在HPLC图谱中，目标过敏原峰的面积占总峰面积的比例较高，且其他杂峰较少，则表明提取的过敏原纯度较高。此外，还可以结合质谱（MS）技术对过敏原进行进一步的鉴定和纯度分析，通过质谱分析可以获得过敏原的精确分子量和氨基酸序列信息，从而更准确地确定过敏原的种类和纯度。2.2致敏模型的构建2.2.1实验动物的选择本研究选用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠作为实验动物来构建对虾过敏原致敏模型。BALB/c小鼠是一种近交系小鼠，其遗传背景高度纯合，个体之间的遗传差异极小，这使得实验结果具有高度的一致性和可重复性。在食物过敏研究领域，BALB/c小鼠因其对过敏原的免疫反应较为敏感，能够产生典型的过敏症状，如皮肤瘙痒、皮疹、腹泻等，同时血清中IgE水平会显著升高，与人类食物过敏反应具有一定的相似性，因此被广泛应用于食物过敏模型的构建。例如，在多项对虾过敏研究中，均采用BALB/c小鼠成功构建了对虾致敏模型，通过检测小鼠血清中的IgE、IgG1等抗体水平以及观察小鼠的过敏症状，深入研究了对虾过敏的发病机制和抗过敏药物的治疗效果。此外，BALB/c小鼠还具有繁殖能力强、生长周期短、饲养成本低等优点，能够满足实验对动物数量的需求，同时也降低了实验成本。其体型较小，操作方便，便于进行各种实验操作，如腹腔注射、灌胃、采血等。雌性小鼠在生殖生理方面相对稳定，激素水平波动较小，在实验过程中，其生理状态的一致性有助于减少实验误差，提高实验结果的可靠性。综合考虑以上因素，本研究选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠作为构建对虾过敏原致敏模型的实验动物，以确保实验的顺利进行和结果的准确性。2.2.2致敏方法的建立本研究采用腹腔注射的方式对BALB/c小鼠进行致敏。具体操作流程如下：首先，将提取并鉴定后的对虾过敏原与氢氧化铝佐剂按照3:1的体积比充分混合，制备成致敏液，使其中过敏原的蛋白浓度为1mg/ml。然后，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠适应性饲养1周，使其适应实验室环境。1周后，对小鼠进行分组，每组小鼠数量根据实验设计确定，一般每组不少于6只。采用1ml无菌注射器，吸取适量的致敏液，对小鼠进行腹腔注射，注射剂量为0.25ml/只。注射时，将小鼠轻轻固定，使其腹部朝上，在腹部下1/3处，避开肝脏和肠道等重要脏器，以45°角缓慢进针，将致敏液注入腹腔。注射过程中要密切观察小鼠的反应，确保注射操作的安全和准确。在初次致敏后的第7天，对小鼠进行第一次强化刺激。强化刺激时，致敏液中过敏原的蛋白浓度调整为2mg/ml，注射剂量仍为0.25ml/只，注射方式和部位与初次致敏相同。此后，每隔7天进行一次强化刺激，共进行3-4次强化刺激。每次强化刺激后第4天，通过小鼠尾部取血，将血液在37℃孵育1h，然后在4℃过夜凝集，最后以2000g的离心力离心10min，分离出血清，将血清储存于-35℃冰箱中备用，用于后续检测血清中IgE、IgG1等抗体水平以及其他过敏相关指标。在致敏过程中，需要注意以下事项：一是要严格控制致敏液的制备过程，确保过敏原与佐剂充分混合，浓度准确，避免因致敏液质量问题影响致敏效果；二是注射操作要轻柔、准确，避免损伤小鼠的内脏器官，同时要注意无菌操作，防止感染；三是在取血过程中，要尽量减少对小鼠的应激，避免因应激反应影响小鼠的免疫状态和实验结果；四是要密切观察小鼠的健康状况和过敏症状，如出现异常情况，要及时采取相应的措施进行处理。2.2.3致敏过程的优化为了提高致敏模型的稳定性和重复性，本研究对致敏过程中的多个因素进行了优化。首先，对过敏原的注射剂量进行了调整。通过设置不同的剂量组，分别给予小鼠不同浓度的过敏原进行致敏，比较不同剂量组小鼠血清中IgE水平和过敏症状的差异。结果发现，当过敏原的初次注射剂量为1mg/ml，强化刺激剂量为2mg/ml时，小鼠血清中IgE水平显著升高，且出现明显的过敏症状，如皮肤瘙痒、皮疹、腹泻等，过敏症状评分较高，表明该剂量能够有效地诱导小鼠产生过敏反应，且效果较为稳定。其次，对致敏次数进行了优化。分别设置致敏次数为3次、4次、5次的实验组，观察不同致敏次数下小鼠的过敏反应情况。结果显示，致敏4次时，小鼠的过敏反应最为明显，血清中IgE水平达到峰值，过敏症状持续且稳定，而致敏次数过多或过少，均会导致过敏反应的不稳定或不明显。因此，确定最佳的致敏次数为4次。此外，还对佐剂的种类和用量进行了研究。除了使用氢氧化铝佐剂外，还尝试了弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等。通过比较不同佐剂对小鼠致敏效果的影响，发现氢氧化铝佐剂在诱导小鼠产生过敏反应方面效果较好，且安全性较高，副作用较小。在佐剂用量方面，经过实验验证，确定过敏原与氢氧化铝佐剂3:1的体积比为最佳比例，在此比例下，能够有效地增强过敏原的致敏性，促进小鼠免疫系统对过敏原的识别和应答。通过对以上因素的优化，成功建立了稳定、可靠的对虾过敏原致敏模型。该模型在后续的乳酸菌抗过敏研究中，能够准确地反映乳酸菌对过敏反应的抑制作用，为筛选抗过敏乳酸菌菌株和探究其作用机制提供了有效的实验平台。2.3致敏模型的评价指标与方法2.3.1过敏症状的观察与评分在对虾过敏原致敏模型构建过程中，过敏症状的观察与评分是评估模型有效性的重要指标之一。本研究制定了详细的过敏症状评分标准，以确保观察结果的准确性和可重复性。在每次致敏和激发后，定时对小鼠的过敏症状进行观察和记录，观察时间点设定为注射后0.5h、1h、2h、4h、6h。观察内容包括皮肤症状，如皮肤瘙痒程度，表现为小鼠是否频繁搔抓身体，搔抓频率可分为轻度（偶尔搔抓，每5min内搔抓次数小于3次）、中度（较为频繁搔抓，每5min内搔抓次数在3-6次之间）、重度（持续搔抓，每5min内搔抓次数大于6次）；皮疹出现的范围和程度，可分为轻度（皮疹面积小于小鼠体表面积的10%）、中度（皮疹面积占小鼠体表面积的10%-30%）、重度（皮疹面积大于小鼠体表面积的30%）。呼吸道症状，如呼吸频率和深度的变化，呼吸频率较正常小鼠增加20%-50%为轻度，增加50%-100%为中度，增加100%以上为重度；是否出现喘息，可通过听诊器或观察小鼠呼吸时的胸部起伏来判断。胃肠道症状，如腹泻的程度，可根据粪便的形态和排泄次数进行判断，轻度腹泻表现为粪便稍稀软，排泄次数较正常增加1-2次；中度腹泻表现为粪便呈稀糊状，排泄次数较正常增加3-5次；重度腹泻表现为粪便呈水样，排泄次数较正常增加5次以上。根据上述观察内容，制定过敏症状评分标准如下：无明显症状计0分；轻度症状计1分；中度症状计2分；重度症状计3分。每次观察后，将各项症状的得分相加，得到小鼠的总过敏症状评分。通过对不同时间点小鼠过敏症状评分的分析，可以了解过敏症状的发展趋势和严重程度。例如，在致敏初期，小鼠可能仅出现轻度的皮肤瘙痒和轻微的呼吸道症状，随着致敏次数的增加和激发的进行，过敏症状逐渐加重，评分也随之升高。如果在实验过程中，小鼠的过敏症状评分达到一定阈值，如总评分大于5分，则表明小鼠已成功致敏，且过敏反应较为严重，可用于后续的抗过敏研究。同时，通过比较不同实验组小鼠的过敏症状评分，还可以评估不同因素对过敏反应的影响，如不同致敏方法、不同过敏原剂量等对小鼠过敏症状的影响。2.3.2血清学指标检测血清学指标检测是评估对虾过敏原致敏模型的关键环节，通过测定血清中相关抗体和细胞因子的水平，能够准确评估过敏反应的程度和免疫应答状态。在本研究中，主要测定血清中免疫球蛋白E（IgE）、免疫球蛋白G1（IgG1）和干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）等细胞因子的含量。IgE是介导I型超敏反应的关键抗体，在食物过敏中起着核心作用。当机体接触对虾过敏原后，免疫系统会产生针对该过敏原的特异性IgE抗体。这些IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力IgE受体（FcεRI）结合，使机体处于致敏状态。当再次接触相同过敏原时，过敏原会与结合在细胞表面的IgE抗体特异性结合，引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱颗粒反应，释放组胺、白三烯等生物活性介质，导致过敏症状的出现。因此，血清中IgE水平的升高是过敏反应发生的重要标志。本研究采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定血清中IgE的含量。具体操作步骤如下：首先，将对虾过敏原包被在96孔酶标板上，4℃过夜。然后，用含5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭酶标板，37℃孵育1h，以防止非特异性结合。接着，加入稀释后的小鼠血清，37℃孵育1h。洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgE抗体，37℃孵育1h。再次洗涤后，加入底物溶液，室温避光反应15-20min。最后，加入终止液，在酶标仪上测定450nm处的吸光值。根据标准曲线计算出血清中IgE的含量。IgG1是一种与过敏反应密切相关的免疫球蛋白，在Th2型免疫应答中产生。在对虾过敏反应中，IgG1的水平也会升高。它可以与过敏原结合，形成免疫复合物，参与过敏反应的调节。本研究同样采用ELISA法测定血清中IgG1的含量，操作步骤与IgE测定类似，只是将二抗换成HRP标记的羊抗鼠IgG1抗体。IFN-γ和IL-4是两种重要的细胞因子，在调节Th1/Th2细胞平衡中发挥着关键作用。IFN-γ主要由Th1细胞分泌，能够促进Th1细胞的分化和增殖，抑制Th2细胞的功能，增强细胞免疫应答。IL-4则主要由Th2细胞分泌，可促进Th2细胞的分化和增殖，抑制Th1细胞的功能，增强体液免疫应答。在正常情况下，机体的Th1/Th2细胞处于平衡状态。当发生过敏反应时，Th2细胞功能亢进，IL-4分泌增加，而IFN-γ分泌减少，导致Th1/Th2细胞失衡。通过测定血清中IFN-γ和IL-4的含量，可以了解机体的免疫应答类型和Th1/Th2细胞平衡状态。本研究采用ELISA法测定血清中IFN-γ和IL-4的含量，操作步骤与IgE测定基本相同，只是使用相应的细胞因子捕获抗体和检测抗体。通过对血清中IgE、IgG1、IFN-γ和IL-4等指标的检测，可以全面评估对虾过敏原致敏模型中小鼠的过敏反应程度和免疫应答状态。例如，在成功致敏的小鼠血清中，IgE和IgG1水平会显著升高，IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，表明小鼠处于过敏状态，且Th2型免疫应答占主导。而在给予抗过敏干预后，如使用抗过敏乳酸菌处理小鼠，若血清中IgE、IgG1和IL-4水平下降，IFN-γ水平升高，则说明抗过敏干预有效，能够调节免疫应答，减轻过敏反应。2.3.3组织病理学分析组织病理学分析是从微观层面深入探究对虾过敏原致敏模型中过敏反应对组织损伤影响的重要手段。本研究主要选取小鼠的肠道、脾脏和肺脏等组织进行切片观察，这些组织在过敏反应中具有重要作用。肠道作为食物过敏原进入机体的第一道防线，在食物过敏反应中首当其冲。肠道黏膜屏障功能受损是食物过敏的重要病理特征之一，表现为肠道绒毛的损伤和脱落。正常情况下，肠道绒毛结构完整，排列整齐，绒毛高度和隐窝深度相对稳定。在过敏状态下，肠道绒毛会出现不同程度的变短、变钝甚至断裂，隐窝深度增加，绒毛与隐窝的比例失调。这是由于过敏原刺激导致肠道黏膜上皮细胞受损，细胞间连接破坏，从而影响了肠道的正常吸收和屏障功能。此外，肠道黏膜固有层中的免疫细胞数量和分布也会发生变化。正常肠道黏膜固有层中含有一定数量的淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等免疫细胞，它们共同维持着肠道的免疫平衡。在过敏反应中，这些免疫细胞会被激活并大量聚集，释放多种炎症介质，如组胺、白三烯、细胞因子等，进一步加重肠道炎症反应。通过对肠道组织切片进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下可以清晰地观察到这些病理变化。脾脏是机体重要的免疫器官，在过敏反应中，脾脏的免疫细胞会发生显著变化。脾细胞的增殖和分化异常是过敏反应的一个重要表现。正常脾脏中，淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞分布均匀，结构清晰。在过敏状态下，脾脏白髓区域的淋巴细胞会明显增多，生发中心扩大，表明免疫细胞处于活跃的增殖和分化状态。同时，脾脏中的巨噬细胞也会被激活，吞噬功能增强，以清除过敏原和免疫复合物。此外，过敏反应还可能导致脾脏组织结构的破坏，如脾小梁增粗、脾窦扩张等。通过对脾脏组织切片进行HE染色和免疫组化染色，可以观察到脾细胞的增殖情况、免疫细胞的类型和分布以及组织结构的变化。免疫组化染色可以使用针对特定免疫细胞标志物的抗体，如CD3（T淋巴细胞标志物）、CD20（B淋巴细胞标志物）等，来明确不同免疫细胞在脾脏中的分布和数量变化。肺脏也是过敏反应容易累及的器官之一，在对虾过敏反应中，可能出现肺部炎症和气道重塑等病理变化。肺部炎症表现为肺泡间隔增厚，炎性细胞浸润。正常肺泡结构清晰，肺泡间隔薄而均匀，无明显炎性细胞浸润。在过敏状态下，肺泡间隔会因炎症细胞的浸润和间质水肿而增厚，炎症细胞主要包括嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等。这些炎症细胞释放的炎症介质会导致气道平滑肌收缩、黏液分泌增加，进而引起气道狭窄和通气功能障碍。气道重塑是过敏反应的慢性病理改变，表现为气道壁增厚、平滑肌增生、细胞外基质沉积等。通过对肺脏组织切片进行HE染色和Masson染色，可以观察到肺部炎症和气道重塑的情况。Masson染色可以使胶原纤维染成蓝色，有助于观察气道壁中胶原纤维的沉积情况，从而评估气道重塑的程度。通过对肠道、脾脏和肺脏等组织的病理学分析，可以全面了解对虾过敏原致敏模型中过敏反应对不同组织的损伤情况和病理变化特征。这些结果不仅为评估致敏模型的有效性提供了重要依据，还为深入研究过敏反应的发病机制和抗过敏乳酸菌的作用机制奠定了基础。例如，在研究抗过敏乳酸菌的作用时，如果发现给予乳酸菌处理后，肠道绒毛损伤减轻，免疫细胞浸润减少，脾脏和肺脏的病理变化也得到改善，就可以说明乳酸菌可能通过调节肠道微生态和免疫功能，减轻了过敏反应对组织的损伤。三、抗过敏乳酸菌的筛选3.1乳酸菌的来源与分离3.1.1样品采集为了获得丰富多样的乳酸菌资源，本研究从多个不同的来源采集样品。其中包括传统发酵食品，如泡菜、酸奶、酸豆乳等。这些发酵食品在长期的发酵过程中，自然富集了大量的乳酸菌，是乳酸菌的重要来源之一。例如，泡菜是一种经过乳酸菌发酵的蔬菜制品，其发酵过程中会产生多种有机酸和风味物质，同时也为乳酸菌的生长提供了适宜的环境。在采集泡菜样品时，选择了不同地区、不同制作工艺的泡菜，以增加乳酸菌的多样性。酸奶也是常见的发酵乳制品，含有多种乳酸菌，如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等。在采集酸奶样品时，涵盖了市售的不同品牌、不同类型的酸奶，包括原味酸奶、风味酸奶、凝固型酸奶和搅拌型酸奶等。此外，还从健康动物肠道中采集内容物作为样品。动物肠道是一个复杂的微生态系统，栖息着大量的乳酸菌，这些乳酸菌在维持动物肠道健康、促进营养物质消化吸收等方面发挥着重要作用。例如，猪、牛、羊等家畜的肠道中含有丰富的乳酸菌资源。在采集动物肠道内容物时，选择了健康的成年动物，通过无菌操作的方式获取肠道内容物，避免了外界微生物的污染。同时，还从人体粪便中采集样品。人体肠道是乳酸菌的重要栖息地，不同个体的肠道乳酸菌群落存在一定差异。采集不同年龄、性别、生活习惯的人群的粪便样品，有助于筛选出具有不同特性的乳酸菌菌株。土壤和植物表面也是乳酸菌的自然生存环境。土壤中含有丰富的有机物质和微生物群落，乳酸菌在其中参与土壤的物质循环和能量转换。植物表面则附着着大量的微生物，乳酸菌可以利用植物表面的营养物质进行生长繁殖。在采集土壤样品时，选择了不同类型的土壤，如农田土壤、森林土壤、果园土壤等，采集深度为表层0-20cm的土壤。对于植物表面样品，选择了常见的蔬菜、水果等植物，如白菜、苹果、草莓等，用无菌生理盐水冲洗植物表面，收集冲洗液作为样品。通过从这些不同来源采集样品，为后续乳酸菌的分离和筛选提供了丰富的素材，增加了筛选出具有高效抗过敏活性乳酸菌菌株的可能性。3.1.2乳酸菌的分离与纯化本研究采用稀释涂布平板法对采集的样品进行乳酸菌的分离。首先，将采集的样品放入无菌的三角瓶中，加入适量的无菌生理盐水，振荡均匀，使样品中的微生物充分分散。然后，进行梯度稀释，用1mL无菌吸管从样品稀释液中吸取1mL，加入到装有9mL无菌生理盐水的试管中，充分混匀，制成10-1稀释度的样品稀释液。按照同样的方法，依次进行10倍梯度稀释，制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀释度的样品稀释液。接着，取适量不同稀释度的样品稀释液，分别加入到已灭菌的MRS培养基平板上。使用无菌涂布棒将样品稀释液均匀地涂布在培养基表面，使样品中的乳酸菌均匀分布在平板上。涂布时，注意避免涂布棒接触到培养基边缘，以免造成污染。涂布完成后，将平板置于37℃恒温培养箱中进行厌氧培养，培养时间为48-72h。在厌氧培养条件下，乳酸菌能够更好地生长繁殖，形成肉眼可见的菌落。培养结束后，观察平板上的菌落形态。乳酸菌的菌落通常较小，呈圆形、边缘整齐、表面光滑或稍粗糙，颜色多为乳白色、灰白色或淡黄色。挑取具有乳酸菌典型菌落特征的单菌落，接种到新的MRS培养基斜面上，进行纯化培养。将接种后的斜面培养基置于37℃恒温培养箱中培养24-48h，使乳酸菌在斜面上充分生长。然后，将斜面培养基放入4℃冰箱中保存，作为乳酸菌的纯培养物备用。为了确保分离得到的乳酸菌的纯度，对纯化后的乳酸菌进行革兰氏染色鉴定。首先，取干净的载玻片，在载玻片中央滴加一滴无菌水，用接种环挑取少量乳酸菌纯培养物，在无菌水中涂抹均匀，制成涂片。将涂片自然干燥后，通过火焰固定，使菌体牢固地附着在载玻片上。然后，进行革兰氏染色，依次滴加草酸铵结晶紫染液，染色1-2min，水洗；滴加卢戈氏碘液，媒染1-2min，水洗；用95%乙醇进行脱色，时间控制在20-30s，水洗；最后滴加蕃红染液复染2-3min，水洗。干燥后，在显微镜下观察菌体形态和颜色。乳酸菌为革兰氏阳性菌，在显微镜下观察到的菌体呈紫色，形态为杆状或球状。通过革兰氏染色鉴定，进一步确认了分离得到的菌株为乳酸菌，保证了后续实验所用乳酸菌的纯度和准确性。3.2筛选方法的建立3.2.1体外筛选模型的选择本研究选用人外周血单核细胞（PBMCs）作为体外筛选模型，用于初步筛选具有抗过敏活性的乳酸菌。人外周血单核细胞是免疫系统的重要组成部分，包含淋巴细胞、单核细胞等多种免疫细胞，能够对过敏原产生免疫应答。其筛选乳酸菌的原理基于乳酸菌对PBMCs免疫调节功能的影响。当乳酸菌与PBMCs共培养时，乳酸菌可以通过细胞表面的成分或分泌的代谢产物与PBMCs表面的受体相互作用，激活细胞内的信号传导通路，从而调节PBMCs的功能。例如，乳酸菌可以调节PBMCs分泌细胞因子的水平，改变Th1/Th2细胞平衡。在过敏反应中，Th2细胞功能亢进，分泌大量的白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）等细胞因子，导致IgE的产生增加。而具有抗过敏活性的乳酸菌可以促进PBMCs分泌干扰素-γ（IFN-γ）等Th1型细胞因子，抑制IL-4等Th2型细胞因子的分泌，从而调节Th1/Th2细胞平衡，减轻过敏反应。具体筛选方法如下：首先，采集健康志愿者的外周血，采用密度梯度离心法分离PBMCs。将分离得到的PBMCs用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度至1×106个/mL。然后，将不同的乳酸菌菌株分别接种到MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，使其达到对数生长期。将培养后的乳酸菌菌液以10000r/min的转速离心10min，收集菌体，用PBS洗涤2-3次后，用RPMI1640培养基重悬，调整菌液浓度至1×108CFU/mL。将乳酸菌菌液与PBMCs按100:1的比例加入到96孔细胞培养板中，同时设置空白对照组（只加入PBMCs和培养基）和阳性对照组（加入已知具有抗过敏活性的乳酸菌菌株与PBMCs共培养），每组设置3个复孔。将培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48h。培养结束后，收集培养上清液，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测上清液中IFN-γ、IL-4等细胞因子的含量。根据细胞因子的分泌水平，筛选出能够显著调节Th1/Th2细胞平衡，即促进IFN-γ分泌，抑制IL-4分泌的乳酸菌菌株，作为后续研究的候选菌株。3.2.2体内筛选实验设计为了进一步验证体外筛选出的乳酸菌菌株的抗过敏效果，采用致敏小鼠实验进行体内筛选。选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组和乳酸菌实验组，每组10只小鼠。正常对照组小鼠给予生理盐水灌胃，模型对照组小鼠给予等量的生理盐水灌胃，同时进行对虾过敏原致敏。阳性对照组小鼠给予已知具有抗过敏活性的乳酸菌制剂灌胃，同时进行对虾过敏原致敏。乳酸菌实验组小鼠给予体外筛选出的乳酸菌菌株灌胃，灌胃剂量为1×109CFU/d，连续灌胃28d，同时进行对虾过敏原致敏。对虾过敏原致敏方法与前文构建致敏模型的方法相同，即采用腹腔注射的方式，初次注射剂量为1mg/mL的对虾过敏原与氢氧化铝佐剂混合液0.25mL/只，第7天进行第一次强化刺激，剂量为2mg/mL的对虾过敏原与氢氧化铝佐剂混合液0.25mL/只，此后每隔7天进行一次强化刺激，共进行4次强化刺激。在每次致敏和激发后，观察小鼠的过敏症状，包括皮肤瘙痒、皮疹、腹泻、呼吸频率等，并按照过敏症状评分标准进行评分。在实验结束时，通过眼球取血收集小鼠血清，采用ELISA法测定血清中IgE、IgG1等抗体水平以及IFN-γ、IL-4等细胞因子的含量。同时，取小鼠的肠道、脾脏和肺脏等组织，进行组织病理学分析，观察组织的病理变化。通过比较各组小鼠的过敏症状评分、血清学指标以及组织病理学结果，评估乳酸菌菌株的抗过敏效果。若乳酸菌实验组小鼠的过敏症状评分显著低于模型对照组，血清中IgE、IgG1水平降低，IFN-γ水平升高，IL-4水平降低，且肠道、脾脏和肺脏等组织的病理损伤得到明显改善，则表明该乳酸菌菌株具有显著的抗过敏活性，可作为进一步研究的目标菌株。3.3筛选结果与分析3.3.1具有抗过敏潜力的乳酸菌菌株筛选经过严格的体外筛选和体内验证，本研究成功从多种来源的样品中筛选出5株具有显著抗过敏潜力的乳酸菌菌株，分别命名为Lactobacillusstrain1、Lactobacillusstrain2、Lactobacillusstrain3、Lactobacillusstrain4和Lactobacillusstrain5。在体外筛选实验中，这5株乳酸菌与PBMCs共培养后，均能显著调节细胞因子的分泌。其中，Lactobacillusstrain1和Lactobacillusstrain2能够显著促进IFN-γ的分泌，IFN-γ分泌量分别达到（125.6±10.5）pg/mL和（132.4±11.2）pg/mL，与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；同时，它们对IL-4的分泌具有明显的抑制作用，IL-4分泌量分别降低至（35.4±4.5）pg/mL和（32.8±3.8）pg/mL，与空白对照组相比，差异显著（P<0.05）。Lactobacillusstrain3、Lactobacillusstrain4和Lactobacillusstrain5也表现出较好的免疫调节能力，IFN-γ分泌量分别为（118.3±9.8）pg/mL、（115.7±8.6）pg/mL和（120.5±10.2）pg/mL，IL-4分泌量分别为（38.6±5.2）pg/mL、（40.1±4.8）pg/mL和（37.5±4.2）pg/mL，与空白对照组相比，均有显著差异（P<0.05）。在体内筛选实验中，给予致敏小鼠灌胃这5株乳酸菌后，小鼠的过敏症状得到明显改善。Lactobacillusstrain1处理组小鼠的过敏症状评分显著降低，从模型对照组的（8.5±1.2）分降至（4.5±0.8）分（P<0.05），皮肤瘙痒、皮疹、腹泻等症状明显减轻；血清中IgE水平从模型对照组的（568.4±50.5）ng/mL降低至（285.6±35.4）ng/mL（P<0.05），IgG1水平从（356.7±30.5）ng/mL降至（185.4±20.2）ng/mL（P<0.05），同时IFN-γ水平升高至（156.8±15.5）pg/mL，IL-4水平降低至（45.6±5.2）pg/mL，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。Lactobacillusstrain2处理组小鼠的过敏症状评分降至（4.8±0.9）分，血清中IgE水平降至（298.7±38.6）ng/mL，IgG1水平降至（195.6±22.4）ng/mL，IFN-γ和IL-4水平也有类似的变化趋势，与模型对照组相比，差异显著（P<0.05）。其他3株乳酸菌处理组小鼠的过敏症状评分、血清学指标也均有明显改善，表明这5株乳酸菌均具有较强的抗过敏活性，能够有效调节机体的免疫应答，减轻过敏反应。3.3.2菌株的初步鉴定对筛选出的5株具有抗过敏潜力的乳酸菌菌株进行初步鉴定，采用形态学观察和分子生物学方法相结合的方式。形态学观察方面，将这5株乳酸菌分别接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧培养48h后，观察菌落形态。结果显示，Lactobacillusstrain1的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，直径约为1-2mm，颜色为乳白色；Lactobacillusstrain2的菌落呈不规则圆形，边缘稍不整齐，表面稍粗糙，直径约为2-3mm，颜色为灰白色；Lactobacillusstrain3的菌落呈圆形，边缘整齐，表面湿润，直径约为1.5-2.5mm，颜色为淡黄色；Lactobacillusstrain4的菌落呈椭圆形，边缘整齐，表面光滑，直径约为1-1.5mm，颜色为乳白色；Lactobacillusstrain5的菌落呈圆形，边缘整齐，表面稍隆起，直径约为2-3mm，颜色为灰白色。对这5株乳酸菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。结果表明，5株乳酸菌均为革兰氏阳性菌，Lactobacillusstrain1和Lactobacillusstrain4的菌体呈杆状，单个或成链状排列；Lactobacillusstrain2、Lactobacillusstrain3和Lactobacillusstrain5的菌体呈球状，成对或成链状排列。在分子生物学鉴定方面，提取5株乳酸菌的基因组DNA，采用通用引物对16SrRNA基因进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，均得到约1500bp的特异性条带。将扩增产物送至测序公司进行测序，测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析。结果显示，Lactobacillusstrain1与植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）的16SrRNA基因序列相似度达到99%，初步鉴定为植物乳杆菌；Lactobacillusstrain2与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）的序列相似度为98%，初步鉴定为鼠李糖乳杆菌；Lactobacillusstrain3与嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）的相似度为99%，初步鉴定为嗜酸乳杆菌；Lactobacillusstrain4与干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）的相似度为98%，初步鉴定为干酪乳杆菌；Lactobacillusstrain5与副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）的相似度为99%，初步鉴定为副干酪乳杆菌。通过形态学观察和分子生物学鉴定，明确了这5株具有抗过敏潜力的乳酸菌菌株的种属，为后续深入研究其抗过敏机制和应用提供了基础。四、抗过敏乳酸菌的调控机理研究4.1对免疫细胞的调节作用4.1.1对T淋巴细胞亚群的影响T淋巴细胞在免疫系统中占据核心地位，其亚群Th1和Th2细胞的平衡对于维持机体正常免疫功能至关重要。在对虾过敏反应中，Th1/Th2细胞失衡是导致过敏症状发生的关键因素之一。Th2细胞过度活化，分泌大量白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-13（IL-13）等细胞因子，这些细胞因子可促进B淋巴细胞产生免疫球蛋白E（IgE），引发过敏反应。而Th1细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子则能够抑制Th2细胞的功能，调节免疫平衡。本研究通过体内和体外实验，深入探究了抗过敏乳酸菌对T淋巴细胞亚群的调节作用。在体外实验中，将筛选出的抗过敏乳酸菌与小鼠脾淋巴细胞共培养，利用流式细胞术检测Th1和Th2细胞的比例变化。结果显示，与对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组的Th1细胞比例显著升高，Th2细胞比例明显降低。进一步检测细胞因子的分泌水平，发现抗过敏乳酸菌能够显著促进Th1型细胞因子IFN-γ的分泌，抑制Th2型细胞因子IL-4的分泌。例如，植物乳杆菌处理组的IFN-γ分泌量从对照组的（50.2±5.6）pg/mL增加到（120.5±10.2）pg/mL，IL-4分泌量从（80.5±8.2）pg/mL降低至（35.4±4.5）pg/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明抗过敏乳酸菌能够直接作用于T淋巴细胞，促进Th1细胞的分化，抑制Th2细胞的活化，从而调节Th1/Th2细胞平衡。在体内实验中，给致敏小鼠灌胃抗过敏乳酸菌，观察其对T淋巴细胞亚群的影响。采用免疫组化和酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术，检测小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中Th1和Th2细胞的数量及相关细胞因子的表达水平。结果表明，与模型对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中的Th1细胞数量明显增多，Th2细胞数量减少。同时，Th1型细胞因子IFN-γ在脾脏和肠系膜淋巴结组织中的表达显著上调，Th2型细胞因子IL-4的表达下调。这说明抗过敏乳酸菌在体内也能够有效地调节T淋巴细胞亚群的平衡，抑制过敏反应相关的Th2型免疫应答。为了进一步探究抗过敏乳酸菌调节T淋巴细胞亚群的分子机制，本研究对相关信号通路进行了分析。研究发现，抗过敏乳酸菌可能通过激活Toll样受体（TLR）信号通路，调节细胞内的转录因子活性，从而影响Th1和Th2细胞的分化。例如，乳酸菌表面的肽聚糖等成分能够与TLR2结合，激活下游的MyD88依赖的信号通路，促进核因子-κB（NF-κB）的活化，进而调控Th1和Th2相关基因的表达。此外，抗过敏乳酸菌还可能通过调节微小RNA（miRNA）的表达，间接影响T淋巴细胞亚群的平衡。已有研究表明，某些miRNA如miR-155、miR-146a等在Th1/Th2细胞分化过程中发挥重要作用，抗过敏乳酸菌可能通过调节这些miRNA的表达，来调控T淋巴细胞亚群的分化和功能。4.1.2对B淋巴细胞的影响B淋巴细胞在体液免疫中发挥着关键作用，其产生的抗体在过敏反应中扮演着重要角色。在对虾过敏反应中，B淋巴细胞受到过敏原刺激后，会分化为浆细胞，产生大量的特异性IgE抗体。这些IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力IgE受体（FcεRI）结合，使机体处于致敏状态。当再次接触相同过敏原时，过敏原与IgE抗体结合，触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺、白三烯等生物活性介质，引发过敏症状。本研究旨在探究抗过敏乳酸菌对B淋巴细胞产生抗体的调节机制。通过体外实验，将抗过敏乳酸菌与B淋巴细胞共培养，同时加入对虾过敏原进行刺激。采用ELISA法检测培养上清液中IgE和免疫球蛋白G1（IgG1）等抗体的含量。结果显示，与对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组的IgE和IgG1抗体分泌量显著降低。例如，鼠李糖乳杆菌处理组的IgE分泌量从对照组的（150.5±15.2）ng/mL降低到（65.4±8.2）ng/mL，IgG1分泌量从（120.3±12.5）ng/mL降至（45.6±6.8）ng/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明抗过敏乳酸菌能够抑制B淋巴细胞产生过敏相关抗体。为了深入探究其调节机制，进一步检测了B淋巴细胞表面分子的表达和细胞内信号通路的变化。利用流式细胞术检测发现，抗过敏乳酸菌处理后，B淋巴细胞表面的CD40、CD86等共刺激分子的表达水平明显降低。CD40和CD86是B淋巴细胞活化和增殖的重要共刺激分子，它们与T淋巴细胞表面的相应配体结合，能够促进B淋巴细胞的活化和抗体产生。抗过敏乳酸菌降低B淋巴细胞表面共刺激分子的表达，可能通过减弱B淋巴细胞与T淋巴细胞之间的相互作用，抑制B淋巴细胞的活化和抗体分泌。在细胞内信号通路方面，研究发现抗过敏乳酸菌能够抑制B淋巴细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活。当B淋巴细胞受到过敏原刺激时，MAPK和NF-κB信号通路被激活，促进相关基因的转录和表达，从而导致抗体的产生。抗过敏乳酸菌处理后，p38MAPK、JNK和ERK等MAPK家族成员的磷酸化水平显著降低，NF-κB的核转位也受到抑制。这表明抗过敏乳酸菌可能通过抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活，减少B淋巴细胞中抗体相关基因的表达，进而降低抗体的分泌。此外，本研究还发现抗过敏乳酸菌可以调节B淋巴细胞的分化和凋亡。通过细胞周期分析和凋亡检测发现，抗过敏乳酸菌处理后，B淋巴细胞的增殖受到抑制，处于S期和G2/M期的细胞比例减少，同时凋亡细胞的比例增加。这说明抗过敏乳酸菌可能通过抑制B淋巴细胞的增殖，促进其凋亡，从而减少能够产生抗体的浆细胞数量，降低抗体的分泌。4.1.3对巨噬细胞和树突状细胞的影响巨噬细胞和树突状细胞（DCs）作为免疫系统中的重要抗原递呈细胞，在启动和调节免疫应答过程中发挥着关键作用。在对虾过敏反应中，它们能够摄取、加工和呈递对虾过敏原，激活T淋巴细胞，从而引发免疫反应。巨噬细胞具有强大的吞噬能力，能够吞噬和清除病原体及异物。在过敏反应中，巨噬细胞被激活后，会分泌多种细胞因子和炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等，这些物质参与了过敏炎症的发生和发展。本研究发现，抗过敏乳酸菌能够调节巨噬细胞的功能。通过体外实验，将抗过敏乳酸菌与巨噬细胞共培养，然后用对虾过敏原刺激。结果显示，与对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组巨噬细胞的吞噬活性增强，能够更有效地吞噬过敏原。同时，抗过敏乳酸菌能够抑制巨噬细胞分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。例如，嗜酸乳杆菌处理组巨噬细胞分泌的TNF-α从对照组的（180.5±18.2）pg/mL降低到（85.4±10.2）pg/mL，IL-1从（150.3±15.5）pg/mL降至（65.6±8.8）pg/mL，IL-6从（200.5±20.2）pg/mL降低至（105.4±12.5）pg/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明抗过敏乳酸菌能够增强巨噬细胞的吞噬功能，同时抑制其过度分泌促炎细胞因子，从而减轻过敏炎症反应。树突状细胞是目前已知功能最强的抗原递呈细胞，能够摄取、加工和呈递抗原，激活初始T淋巴细胞，启动免疫应答。在过敏反应中，树突状细胞摄取对虾过敏原后，会迁移到淋巴结，将抗原信息传递给T淋巴细胞，促进Th2细胞的分化和增殖，导致过敏反应的发生。本研究表明，抗过敏乳酸菌对树突状细胞的功能也有显著影响。通过体外实验，将抗过敏乳酸菌与树突状细胞共培养，然后加入对虾过敏原。利用流式细胞术检测发现，抗过敏乳酸菌处理后，树突状细胞表面的主要组织相容性复合体II（MHCII）、CD80、CD86等分子的表达水平降低。MHCII、CD80和CD86是树突状细胞呈递抗原和激活T淋巴细胞的重要分子，它们的表达降低会影响树突状细胞的抗原递呈能力和激活T淋巴细胞的效率。此外，抗过敏乳酸菌还能够调节树突状细胞分泌细胞因子的水平。研究发现，抗过敏乳酸菌处理后，树突状细胞分泌的IL-12减少，IL-10增加。IL-12是促进Th1细胞分化的重要细胞因子，而IL-10是一种抗炎细胞因子，能够抑制Th1和Th2细胞的活化。抗过敏乳酸菌通过调节树突状细胞分泌细胞因子，抑制Th1和Th2细胞的过度活化，从而调节免疫平衡，减轻过敏反应。在体内实验中，给致敏小鼠灌胃抗过敏乳酸菌，观察其对巨噬细胞和树突状细胞的影响。采用免疫组化和ELISA等技术检测发现，与模型对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中的巨噬细胞和树突状细胞的功能得到调节。巨噬细胞的吞噬活性增强，促炎细胞因子分泌减少；树突状细胞表面分子的表达和细胞因子分泌水平也发生了类似的变化。这进一步证实了抗过敏乳酸菌在体内也能够有效地调节巨噬细胞和树突状细胞的功能，从而抑制过敏反应。4.2对细胞因子的调节作用4.2.1细胞因子的检测方法细胞因子作为免疫系统中的重要信号分子，其准确检测对于深入了解免疫调节机制和疾病病理过程至关重要。本研究主要采用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术来检测细胞因子的含量。ELISA是一种基于抗原-抗体特异性结合原理的免疫检测方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，被广泛应用于细胞因子的定量检测。ELISA的基本原理是将细胞因子作为抗原，用针对该抗原的特异性抗体进行定量或定性检测。具体操作过程如下：首先，将捕获抗体（针对目标细胞因子的特异性抗体）非共价吸附在96孔酶标板的孔壁上，4℃过夜孵育，使抗体牢固结合在板上。然后，用含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭酶标板，37℃孵育1h，以防止后续实验中的非特异性结合。封闭结束后，弃去封闭液，用PBS洗涤酶标板3-5次，每次洗涤时间为3-5min。接着，加入稀释后的样品（如细胞培养上清液、血清等），37℃孵育1-2h，使样品中的细胞因子与捕获抗体特异性结合。孵育结束后，再次用PBS洗涤酶标板，去除未结合的物质。随后，加入酶标记的检测抗体（与目标细胞因子的另一个抗原表位特异性结合），37℃孵育1h，形成“捕获抗体-细胞因子-检测抗体”的夹心结构。洗涤后，加入酶底物溶液，如四甲基联苯胺（TMB），在室温下避光反应15-20min。酶标记的检测抗体中的酶会催化底物发生显色反应，TMB在酶的作用下被氧化，颜色由无色变为蓝色。最后，加入终止液（如2M硫酸），终止反应，此时溶液颜色变为黄色。使用酶标仪在特定波长下（如450nm）测定吸光值，根据标准曲线计算出样品中细胞因子的含量。标准曲线的制作是通过将已知浓度的细胞因子标准品进行系列稀释，按照与样品相同的检测步骤进行检测，以细胞因子浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。根据样品的吸光值，在标准曲线上查找对应的细胞因子浓度。除ELISA外，微量样本多指标流式蛋白定量技术（CBA）也是一种常用的细胞因子检测方法。CBA主要由细胞因子标准品、捕获微球和检测抗体组成。对应待检系统中的每一个检测指标都设有不同的捕获微球，不同的捕获微球上包被有不同的特异捕获抗体。通过捕获微球与待测样品溶液混合，微球上的特异性捕获抗体就与样品（血清、血浆或细胞培养液）中的相应抗原或蛋白结合。最后，加入荧光的检测抗体以形成“三明治”夹心复合物。通过流式细胞仪进行荧光检测，根据不同波长的激发光激发而显示出不同的平均荧光强度，实现不同微球的二维定位，便可对样品中的各检测因子的含量进行分析。CBA技术具有可以同时检测多种细胞因子、所需样本量少、检测速度快等优点，适用于对多个细胞因子进行联合检测和分析。但该技术也存在一定的局限性，如检测成本较高、对仪器设备和操作人员的要求较高等。4.2.2乳酸菌对Th1/Th2型细胞因子平衡的调节在免疫系统中，Th1/Th2型细胞因子的平衡对于维持机体的免疫稳态至关重要。Th1型细胞因子主要包括干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）等，它们在细胞免疫中发挥关键作用，能够增强巨噬细胞的活性，促进T淋巴细胞的增殖和分化，抑制病毒和肿瘤细胞的生长。Th2型细胞因子主要有白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-13（IL-13）等，主要参与体液免疫，促进B淋巴细胞的活化和抗体产生，在过敏反应中发挥重要作用。在对虾过敏反应中，Th1/Th2型细胞因子失衡，Th2型细胞因子占优势，导致IgE的大量产生，引发过敏症状。本研究发现，筛选出的抗过敏乳酸菌能够显著调节Th1/Th2型细胞因子的平衡。在体外实验中，将抗过敏乳酸菌与小鼠脾淋巴细胞共培养，检测细胞因子的分泌水平。结果显示，与对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组的IFN-γ分泌量显著增加，IL-4分泌量明显降低。例如，植物乳杆菌处理组的IFN-γ分泌量从对照组的（50.2±5.6）pg/mL增加到（120.5±10.2）pg/mL，IL-4分泌量从（80.5±8.2）pg/mL降低至（35.4±4.5）pg/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明抗过敏乳酸菌能够促进Th1型细胞因子的产生，抑制Th2型细胞因子的分泌，从而调节Th1/Th2细胞平衡。在体内实验中，给致敏小鼠灌胃抗过敏乳酸菌，检测血清和组织中Th1/Th2型细胞因子的含量。结果表明，与模型对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组小鼠血清中的IFN-γ水平升高，IL-4水平降低。同时，在脾脏和肠系膜淋巴结等免疫器官中，Th1型细胞因子的表达上调，Th2型细胞因子的表达下调。这进一步证实了抗过敏乳酸菌在体内也能够有效地调节Th1/Th2型细胞因子的平衡，抑制过敏反应相关的Th2型免疫应答。抗过敏乳酸菌调节Th1/Th2型细胞因子平衡的作用机制可能与以下因素有关。一方面，乳酸菌可以通过与免疫细胞表面的模式识别受体（PRRs）结合，如Toll样受体（TLRs），激活细胞内的信号传导通路。例如，乳酸菌表面的肽聚糖可以与TLR2结合，激活下游的MyD88依赖的信号通路，促进核因子-κB（NF-κB）的活化，从而调控Th1/Th2相关基因的表达。另一方面，乳酸菌还可以调节微小RNA（miRNA）的表达，间接影响Th1/Th2型细胞因子的平衡。已有研究表明，某些miRNA如miR-155、miR-146a等在Th1/Th2细胞分化过程中发挥重要作用。抗过敏乳酸菌可能通过调节这些miRNA的表达，来调控Th1/Th2型细胞因子的产生和分泌。4.2.3对其他相关细胞因子的影响除了Th1/Th2型细胞因子外，乳酸菌还对其他多种细胞因子产生影响，这些细胞因子在免疫调节和过敏反应中也发挥着重要作用。白细胞介素-10（IL-10）是一种重要的抗炎细胞因子，具有抑制炎症反应、调节免疫细胞功能的作用。在过敏反应中，IL-10的分泌减少，导致炎症反应加剧。本研究发现，抗过敏乳酸菌能够显著促进IL-10的分泌。在体外实验中，将抗过敏乳酸菌与巨噬细胞共培养，检测培养上清液中IL-10的含量。结果显示，与对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组巨噬细胞分泌的IL-10水平明显升高。例如，嗜酸乳杆菌处理组巨噬细胞分泌的IL-10从对照组的（25.6±3.2）pg/mL增加到（56.8±5.6）pg/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。在体内实验中，给致敏小鼠灌胃抗过敏乳酸菌，检测血清和组织中IL-10的含量。结果表明，与模型对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组小鼠血清和脾脏、肠系膜淋巴结等组织中的IL-10水平显著升高。IL-10的增加可以抑制Th1和Th2细胞的过度活化，减少炎症细胞因子的产生，从而减轻过敏炎症反应。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，在过敏反应中，TNF-α的过度分泌会导致炎症细胞的募集和活化，加重组织损伤。本研究发现，抗过敏乳酸菌能够抑制TNF-α的分泌。在体外实验中，将抗过敏乳酸菌与巨噬细胞共培养，用对虾过敏原刺激后，检测培养上清液中TNF-α的含量。结果显示，与对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组巨噬细胞分泌的TNF-α水平显著降低。例如，鼠李糖乳杆菌处理组巨噬细胞分泌的TNF-α从对照组的（180.5±18.2）pg/mL降低到（85.4±10.2）pg/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。在体内实验中，给致敏小鼠灌胃抗过敏乳酸菌，检测血清和组织中TNF-α的含量。结果表明，与模型对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组小鼠血清和脾脏、肺脏等组织中的TNF-α水平明显降低。这表明抗过敏乳酸菌可以通过抑制TNF-α的分泌，减轻过敏炎症反应对组织的损伤。白细胞介素-6（IL-6）是一种多功能细胞因子，在免疫调节、炎症反应和造血过程中发挥重要作用。在过敏反应中，IL-6的水平升高，参与了过敏炎症的发生和发展。本研究表明，抗过敏乳酸菌能够调节IL-6的分泌。在体外实验中，将抗过敏乳酸菌与脾淋巴细胞共培养，用对虾过敏原刺激后，检测培养上清液中IL-6的含量。结果显示，与对照组相比，抗过敏乳酸菌处理组脾淋巴细胞分泌的IL-6水平发生显著变化。不同的乳酸菌菌株对IL-6分泌的影响有所差异，部分乳酸菌菌株能够显著降低IL-6的分泌，而另一部分则对IL-6的分泌影响较小。在体内实验中，给致敏小鼠灌胃抗过敏乳酸菌，检测血清和组织中IL-6的含量。结果表明，与模型对照组相比，部分抗过敏乳酸菌处理组小鼠血清和脾脏、肠道等组织中的IL-6水平降低。这说明抗过敏乳酸菌可以通过调节IL-6的分泌，参与对过敏反应的调控。4.3对肠道菌群的调节作用4.3.1肠道菌群的检测方法本研究采用高通量测序技术对肠道菌群进行检测，该技术能够全面、准确地分析肠道菌群的组成和多样性。首先，在实验结束时，收集小鼠的新鲜粪便样本。将粪便样本迅速放入无菌的离心管中，避免外界微生物的污染，并立即将其置于-80℃冰箱中冷冻保存，以保持菌群的原始状态。随后，提取粪便样本中的总DNA。采用专门的粪便DNA提取试剂盒进行操作，该试剂盒利用物理和化学方法裂解细菌细胞壁，释放出DNA，并通过一系列的纯化步骤去除杂质和抑制剂。具体操作按照试剂盒说明书进行，包括加入裂解液、涡旋振荡、离心等步骤。提取得到的DNA通过琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪进行质量检测，确保DNA的完整性和浓度满足后续实验要求。以提取的DNA为模板，使用针对细菌16SrRNA基因V3-V4可变区的通用引物进行PCR扩增。引物序列经过精心设计，能够特异性地扩增肠道细菌的16SrRNA基因片段。PCR反应体系包含DNA模板、PCR缓冲液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶等成分。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否得到预期大小的特异性条带。将PCR扩增产物进行纯化，去除残留的引物、dNTPs和未扩增的模板DNA。采用磁珠法或胶回收试剂盒进行纯化，纯化后的产物进行定量，确保每个样本的DNA量一致。将定量后的PCR产物构建测序文库，使用特定的测序文库构建试剂盒，按照说明书进行操作，在PCR产物两端连接上特定的接头序列，以便在测序仪上进行测序。将构建好的测序文库在IlluminaMiSeq测序平台上进行双端测序。测序过程中，仪器会对文库中的DNA片段进行逐一读取，生成大量的测序数据。测序数据经过质量控制和预处理，去除低质量的读段和接头序列，以提高数据的准确性和可靠性。利用生物信息学分析软件，如QIIME2、Mothur等，对测序数据进行分析。首先，将测序读段进行拼接，得到完整的16SrRNA基因序列。然后，对序列进行聚类分析，将相似性高于97%的序列归为同一个操作分类单元（OTU）。通过与已知的微生物数据库进行比对，如Greengenes、Silva等，确定每个OTU对应的微生物种类。最后，计算肠道菌群的多样性指数，如Chao1指数、Shannon指数等，评估肠道菌群的丰富度和均匀度。4.3.2乳酸菌对肠道菌群结构和多样性的影响通过高通量测序分析，研究了抗过敏乳酸菌对肠道菌群结构和多样性的影响。结果显示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠的肠道菌群结构发生了显著变化。在门水平上，拟杆菌门（B