自制泡菜中的细菌鉴定

自制泡菜中的细菌鉴定摘要：泡菜作为我国历史悠久的美食具有营养丰富、口感爽脆、解腻开胃的特点，在我国人民的饮食中占有重要的地位，也凝聚了生产人民的智慧。本文介绍了中国泡菜历史发展过程和日韩两国的泡菜产业，从制作方式介绍了泡菜的发展历史。乳酸菌作为泡菜制作过程中主要的微生物直接影响了泡菜的品质，本文介绍了乳酸菌对于泡菜制作的作用和其所具有的特性以及其应用范围来介绍乳酸菌。最后还采用对照试验，使用四组不同制作方法的泡菜进行对照，进行了肉眼观察，并对发酵液其中的乳酸菌的分离和初步鉴定，结果发现泡菜中的主要菌群确实为乳酸菌，且发现了氯化钠的加入极大地影响了泡菜制作。关键词：泡菜；乳酸菌；分离；鉴定；自制泡菜前言 泡菜概述泡菜是我国的传统美食，古时候被称作是葅，在北魏时期的贾思勰所作的《齐民要术》中，就有关于泡菜制作的描述，这说明了在我国至少有一千四百多年的泡菜制作历史。泡菜是我们国家历史上传统的有特色的发酵食品之一，历史十分的悠久。在科技尚未如此发达的年代，人们将制作泡菜当作成一种保存新鲜蔬菜的手法，因为其原料种类多，制作方法简单，成本较低，食用方法简单且口感较好。通过微生物进行厌氧发酵，不仅能够较好的保存蔬菜和其中的营养物质，还会产生多种额外的对人体有益的微生物，并且能够提供较好的食用体验，这也大大的提升了泡菜的制作价值。制作泡菜的材料很多，可以是卷心菜，大白菜，萝卜等纤维丰富的蔬菜水果，在制成之后会具有特殊的酸脆可口、清爽开胃、口感丰富特性。泡菜发展历史从时间上来说，我国的泡菜历史悠久，最早在《诗经》中就有记载：“中田有庐,疆场有瓜,是剥是菹,献之皇祖”这样的句子，句中的“庐”和“瓜”就是指的制作泡菜使用的蔬菜，而“剥”和“菹”就是指对蔬菜进行腌渍，然后进献给皇家。由此可见，在当时腌渍蔬菜制作泡菜已经是有存在的历史了。虽然当时的技术可能跟后期的不太一样，但是这也体现了当时人们使用腌渍这样的方法进行保存蔬菜的行为。在北魏时期，著名的我国农业科学家贾思勰写出了《齐民要术》，其中比较全面和系统的较少了北魏以前的泡菜加工方法。例如咸菹法，就是用盐水泡渍蔬菜的方士，还有藏蕨法，即为“蕨一行,盐一行”，在现在看来就是在腌渍的时候，一层菜一层盐的进行蔬菜腌渍制作，即使是现在，人们依然会使用这样的方式进行腌渍泡菜。之后，我国的腌渍蔬菜技术逐渐发展，到了宋元明时期，已经有了长足的进步。在宋朝的孟元老所著的《东京梦华录》中，记载了“姜辣萝卜、生腌木瓜”等词句，明确的记载了当时的腌渍食品的情况，宋朝的著名诗人陆游则写有诗句：“菘芥可菹,芹可羹”，也体现了当时的腌渍食品的普及。而到了明朝，作者邝瑶的作品《便民图算》中则记载了：“切作骰子状,盐腌一宿,晒干,用姜丝、橘丝、莳萝、茴香,拌匀煎滚”这样对于萝卜干的一种腌渍方法[1]。时至今日，随着现代科技的快速发展，人们已经揭开了泡菜这一发酵食品的神秘面纱，并且根据需求发展出了品种繁多，口味各异的各式各样的泡菜产品，使泡菜真正成长成为了一个食品产业。乳酸菌乳酸菌简介随着对于蔬菜发酵机理的深入研究，人们开始逐渐重点研究主力发酵菌种即乳酸菌。乳酸菌并不是生物分类学名词，而是指那种能够将糖进行发酵并且主要产物为乳酸的一种没有芽孢且革兰氏染色呈现阳性的细菌的总称。乳酸菌在自然界的分布极为广泛，种类十分繁多，而且也具有十分重要的学术价值，在生活中也具有十分巨大的应用价值。乳酸菌的生长温度一般在15-45℃最为适宜，耐酸性高。根据菌体细胞形态分类可以分为球菌和杆菌。在发酵过程中乳酸菌对于葡萄糖的利用主要是同型乳酸发酵和异形乳酸发酵。在同型发酵中，乳酸菌利用原料中的葡萄糖生成丙酮酸这样一种中间产物，之后在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸；而异型发酵的主要最终产物除了乳酸外还有乙醇、乙酸、二氧化碳等。而乳酸菌能够在发酵蔬菜的过程中大量存在并且起到重要作用是因为它具有许多特性。比如乳酸菌一般都耐酸且嗜酸，这个特性能够保证乳酸菌在发酵过程中较低的pH值的环境中生活下来并且占据主要菌种的位置，从而减少其他菌种的微生物生长繁殖[2]。而大部分的乳酸菌也具有耐盐性，这让其能在腌制泡菜过程中耐受5％以上的盐浓度。在产品安全方面，一般泡菜产品中都不会含有亚硝酸盐，这是因为大部分在泡菜中常见的乳酸菌都不会含有硝酸盐还原酶，这个特性保证了泡菜产品的安全性。在泡菜的发酵过程中，最先是肠膜明串珠菌进行作用，它进行异形发酵，繁殖速度较快，这是因为它比发酵液中其他种类的菌繁殖周期要短。但是随着发酵的逐渐进行，乳酸菌的繁殖导致发酵液的酸度慢慢的增加，而对酸敏感的明串珠菌会受到抑制甚至逐渐死亡，此时其他耐酸性更好的菌种代替了它成为了主要菌群，之后发酵液中的pH值进一步的下降，从而抑制了其他杂菌的生长繁殖，就此完成了泡菜的发酵过程。由于此时的pH值较低，其他杂菌被控制住后，就有效的保证了泡菜的保存。[3]发酵过程中主要乳酸菌介绍在泡菜发酵制作过程中主要涉及到的乳酸菌中有乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、链球菌属等属的细菌。乳杆菌属细菌是一种细胞呈现杆状，一般为长杆状、短杆状和棒状的细菌，大多为成短链排列。在革兰氏染色中呈现阳性，通常不运动，不具有芽孢。生长繁育中对于营养的要求比较严格，属于化能异养型微生物，生长繁殖过程中需要多种氨基酸、维生素等养分。在好氧情况上，乳杆菌属细菌是厌氧、耐氧性厌氧或者兼性厌氧；比较适合在pH值范围在5.5到6.2内生长，可以在pH≤5的情况下生长，而在偏中性或者偏碱性的条件下生长时其生长繁殖速率会降低。至于温度方面，最适宜的生长温度范围为30℃到40℃之间，但是在2℃到53℃之间都可以生长。在发酵过程中既有同型乳酸发酵也有异形发酵[4]。在泡菜制作中常见的同型发酵菌有德氏乳杆菌、植物乳杆菌，也有异形发酵的短乳杆菌等。链球菌属细菌是一种细胞呈现球形或者卵圆形的细菌，一般成对或者成链状排列。革兰氏染色呈现阳性，也不具备芽孢，一般不运动，生长繁殖过程中也不产生色素。一样属于化能异养型微生物，属于兼性厌氧型，在接触酶反应中呈现阴性，在石蕊牛乳中可以使牛乳凝固但不能还原石蕊，蛋白质分解能力较差。可以通过同型乳酸发酵来产生右旋乳酸，也可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖通过同型发酵乳酸的方式发酵产生L型乳酸。一般在长期发酵蔬菜的发酵后期出现链球菌属细菌。明串珠菌属细菌的菌落一般呈现光滑、圆形，肉眼观察为灰白色，菌落大小一般小于1mm。在液体培养基中培养时，呈现出均匀混浊。细胞本身呈现出球形或者豆状，一般成对或者成链排列。在革兰氏染色中呈现阳性，同样不运动也无芽孢。最适合生长的温度范围是20℃到30℃之间，为兼性厌氧型。一般存在于泡菜发酵的前期，进行异形乳酸发酵。其代表菌种为肠膜明串珠菌。片球菌属的细菌细胞为圆球形，一般成对或者四联排列，很少见到单生者。革兰氏染色呈现阳性，一样无芽孢不运动。属于兼性厌氧型，最适合在25℃到40℃的温度范围内生长。可以对葡萄糖进行发酵产生D乳酸或者L乳酸。在泡菜发酵过程中参与的片球菌属主要有乳酸片球菌、戊糖片球菌等。乳酸菌的分离鉴定方法介绍对于乳酸菌的研究一般有分离和鉴定。其中分离可以先对发酵泡菜汁液进行稀释，然后在MRS培养基上进行涂平板操作，之后可以挑起单菌落进行革兰氏染色，并进行镜检，从中挑选挑选革兰氏染色阳性的菌种，对其进行反复的培养基纯化培养筛选得到单菌落菌株进行低温保存。目前，对于乳酸菌的鉴定主要是在形态学鉴定，生理生化实验，分子生物学实验上进行研究。其中形态学鉴定的结果一般都比较的粗略，不能作为独立依据对乳酸菌进行分类鉴定，只能作为对于乳酸菌的初步鉴定依据之一。一般来说，形态学鉴定也就是形态特征的鉴定，是指在菌落形态方面，对培养基上分离的菌落形态比如形状，大小，色泽等进行观察，同时对分离的菌株进行革兰氏染色进行细胞形态鉴定，将菌体形态放置到显微镜下进行观察，而大多数的乳酸菌都属于革兰氏阳性。至于生理生化特征的鉴定，主要是对菌株进行特殊的生理特征实验，比如乳酸定性实验，接触酶实验等。接触酶实验是指将需要实验的菌种接种到核实的斜面，在适宜的温度培养18h～24h。[5]使用接种环将培养斜面上的菌落涂于干净的载玻片上，并滴上1滴3％～15％的过氧化氢，主要观察是否有气泡的产生，阳性反应为有气泡产生，反之则为无气泡产生。如果需要鉴定厌氧菌，则需要把斜面培养物暴露在空气中30min再进行检测。同时，对于乳酸菌菌株的发酵性能的测定也是有必要的，在发酵的过程中乳酸菌的生长繁殖受到了许多因素的影响。研究这些因素，有利于提高菌株的活性，从而提高泡菜的品质。目前来说，对于菌株发酵性能的研究主要是集中在发酵时间、产酸速度、产酸量、耐酸耐盐等能力上。一般来说，发酵时间越短发酵效率越高，同时发酵过程中乳酸菌的产酸量就大，从而让制作出的泡菜产品的营养价值提高。产酸量的测量可以通过测试pH值来简略直观的体现。对于乳酸菌的鉴定，主要有四种鉴定手段[6]，其中传统的鉴定方法即把形态学和生理生化特征相结合从而进行鉴定，这种方法能够将菌鉴定到种的级别。这种鉴定方法不仅需要操作人员拥有比较丰富的鉴定经验，还因为鉴定时间长工作量大并且容易被人为因素所干扰，导致鉴定准确性的降低。第二种是采用Biolog自动微生物鉴定系统对菌进行鉴定，此系统利用微生物对于不同的碳源在呼吸代谢上的差异即对碳源的不同反应，使用相应的仪器对反应进行记录，然后把结果输入到系统的软件之中，在系统中的标准菌种数据库进行比对识别，从而鉴定出所测菌种。这是一种快速、便捷的鉴定方法，但是缺点也很明显，仪器及其耗材都比较昂贵，且鉴定的细分性不够高，大多数只能鉴定到属的级别，只有少数才可以鉴定到种的水平。第三种方法是使用分子标记技术对菌种进行鉴定，这项技术是随着分子生物学的发展而产生的一中鉴定手段，利用分子标记技术对泡菜中的乳酸菌进行鉴定比如16SrRNA序列分析进行鉴定，这是一种常见的鉴定手段。这种鉴定方法具有技术成熟、使用便捷的优点。缺点在于很难鉴别到种的水平[7]。第四种方法就是采用分子标记与糖发酵实验相结合的鉴定方士，在分子标记技术鉴定的技术上，与糖发酵实验相结合，两种手段互补，可以将鉴定水平提高到种的水平，是一种比较好的鉴别方法。实验材料和方法实验材料武汉本地市场销售的大白菜，本地家庭自制泡菜主要实验仪器超净工作台，电热恒温培养箱，显微镜，电子天平，酸度计，电热压力蒸汽灭菌锅，超纯水仪主要实验试剂革兰氏染色液，10％硫酸溶液，2％高锰酸钾溶液，氯化钠，生理盐水，滤纸，含氨硝酸银溶液培养基配方MRS培养基及改良MRS培养基。取用蛋白胨12g，牛肉膏10g，无水醋酸钠5g，酵母浸膏5g，吐温-801ml，七水硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二胺2g，四水硫酸锰0.25g，琼脂18g，葡萄糖20g制成1000ml培养基。改良MRS培养基在上述培养基中加入0.75％碳酸钙。实验方法泡菜的实验室自制方法用加热的超纯水配制1000ml的5％氯化钠溶液放凉待用。制作四组不同的自制泡菜。对第一组泡菜的制作：对适量大白菜进行清洗切块，晾干后和发酵容器一起放在电热压力蒸汽灭菌锅中进行121℃持续20分钟的灭菌，灭菌完后待容器和白菜降至室温，加入适量超纯水，以基本填满发酵容器距离瓶口0.5-1cm为限度，在超净操作台中取家庭自泡菜中发酵汁液5ml加入发酵容器中，最后使用橡胶塞和保鲜膜对容器口进行密封操作。第二组泡菜：同样取适量大白菜洗净切块晾干，同样时间灭菌后加入适量的配置好的氯化钠溶液，在超净操作台中取家庭自泡菜中发酵汁液5ml加入，最后使用保鲜膜和橡胶塞对容器口进行密封操作。第三组泡菜：在对大白菜进行洗净后对大白菜进行热开水消毒处理，具体操作是将洗净后的大白菜用开水淋洗一遍，之后切块晾干，放入容器中，加适量超纯水，并在超净工作台加入5ml的家庭泡菜汁液，最后进行密封操作。第四组泡菜：在第三组操作的基础上使用配置好的NaCl溶液替代超纯水，最后密封。把四组泡菜标号序号并全部放入电热恒温培养箱中30℃进行培养，在第三天和第七天进行观察并抽取发酵汁液进行pH值测定记录。表1.四组泡菜制作情况表泡菜序号灭菌锅灭菌开水淋洗超纯水NaCl溶液A是否是否B是否否是C否是是否D否是否是乳酸菌的分离和初步鉴定乳酸菌的分离[8]和初步鉴定[9]：在第八天时对四组泡菜进行肉眼观察以及乳酸菌的分离和初步鉴定。乳酸菌的观察：首先对乳酸菌进行分离和培养，在超净工作台中取5g样品，加入生理盐水中稀释至50ml，之后采用平板涂布的方式将稀释后的样品涂布到MRS培养基以及改良MRS培养基上，放入30℃培养箱中培养2d。之后在改良MRS培养基上寻找有溶钙圈的菌落，挑取形态较好菌落，溶解在载玻片上的生理盐水中进行显微镜观察，之后再对菌落进行革兰氏染色观察。其次进行乳酸的检查，取各组泡菜发酵汁液10ml放于试管中，加入1ml的10％硫酸溶液，再加入1ml的2％高锰酸钾溶液，此时的乳酸转化为乙醛。再把滤纸条在含氨硝酸银溶液中浸湿，横放在试管口上，慢慢的加热试管到沸腾，这时如果有乳酸则会发现乙醛让滤纸变黑，则能说明发酵液中有乳酸的生成。这样即可证明泡菜中的主要菌群为乳酸菌。实验注意事项1.使用电热压力蒸汽灭菌锅之前需要先检查内部存水是否充足，如果不充足需要补充超纯水到最低线之上，在灭菌完成之后需要等到压力表压力显示为零之后才能打开灭菌锅。2.使用超净工作台之前需要进行紫外线至少15分钟的灭菌才可以使用，还需要对手部进行酒精消毒操作才可以操作。3.使用完超净工作台之后要对工作台进行清洁，并收拾好台面。4.制作泡菜时，对于发酵液的移取要保证在超净工作台中操作。发酵所使用的的容器均需在灭菌锅中进行灭菌操作。实验结果观察及pH值测量结果实验结果：对四组泡菜首先进行肉眼观察以及pH值测量，可以得到如下表的结果。表2.泡菜观察及pH值表格编号ABCD气味有腐败的味道腐败的味道较淡无明显腐败味道，有一定的酸味无腐败味道。酸味较浓香混浊度混浊中度混浊较清澈，有悬浊比较清澈，悬浊较少原料保存程度仅有絮状物有些模糊较完整完整是否有生花是是否否pH值（3d）6.36.75.85.5pH值（7d）7.26.85.13.8分离和初步鉴定结果再对泡菜的分离和初步鉴定结果进行总结，可得到下表。表3.泡菜乳酸菌分离和初步鉴定结果编号ABCD菌落形状圆形圆形圆形圆形菌落颜色白色有杂菌白色，杂菌较少白色，杂菌较少白色溶钙圈大小较小较小较小较大滤纸反应变色不明显变色不明显变色变色实验结果分析从泡菜观察及pH值表格中，AB组和CD组的对照可以看出氯化钠的加入可以有效的抑制有害菌群的生长，但不能完全阻止有害菌群的生长。而AC组和BD的对照则显示了使用电热压力蒸汽灭菌锅会导致泡菜制作的失败，在探究其中的原因之后发现：乳酸菌的生长繁殖过程中，对于营养的要求十分的严格，不仅需求糖，还需求维生素、氨基酸等营养物质。而使用电热压力蒸汽灭菌锅会导致大白菜中大量的营养物质被破坏，比如维生素在高温时会被分解，从而导致了在泡菜发酵制作过程中，乳酸菌不能很好的生长繁殖来占据主要菌群位置，让有害菌群有了可乘之机占据了主要菌群，导致了泡菜制作的失败。[10]从泡菜乳酸菌分离和初步鉴定结果表来看，泡菜中的主要菌群确实是乳酸菌，但是由于制作方法的不同，会导致其中的乳酸菌数量变化极其明显。讨论在泡菜发酵制作的过程中，氯化钠的加入与否以及其浓度对于发酵产物品质和安全性有巨大的影响[11]。较高的盐浓度会降低乳酸菌在泡菜发酵时的产酸速度，但是和低盐浓度时相比，最终产物的后期酸度均能达到一样的水平。可以看出，我国的泡菜产业发展是需要不少的改进方法的，比如可以推进企业和种植户进行合作，共建蔬菜原料种植基地，保证蔬菜原料的安全和质量，让企业直接参与到蔬菜种植过程中的种植管理。严格控制种植过程中的化肥农药的使用，保证原料的安全性和质量。同时可建成生产园区，对周围的环境进行保护减少重金属等的污染，并对于产出蔬菜原料定期送至专业部门进行检测，这样可以把生产过程中的污染降到最低[12]。最重要的是要改进腌渍发酵技术，进过实验得知乳酸菌是发酵的主要菌群，因此改进发酵技术可以从乳酸菌入手，乳酸菌可以在发酵过程中产酸使环境的pH值降低来抑制杂菌的生长。所以可以使用人工来接种乳酸菌发酵剂来控制发酵，使产品的质量风味更好，同时还可以减少有害物质比如亚硝酸盐的产生。在生产过后，还需要推广低盐存储技术，物理方法有使用超高压处理、微波处理等，化学方法有添加化学或者生物防腐剂。对于国内的产业大环境而言，最重要的是加强对于基础科学的研究，科技是第一生产力，这句话对于泡菜产业也是适用的，提高产业的科研投入，对产品多进行研发和改进，努力攻克生产难题，可以大幅度的加快泡菜产业的发展[13]。参考文献[1]陈功.试论中国泡菜历史与发展[J].食品与发酵科技,2010,46(03):1-5.[2]陈晟,罗佳瑶,蒋立文等.我国腌渍蔬菜产业现状分析及改进对策[J].中国酿造,2018,37(07):6-10.[3]黄丽慧,张雁,陈于陇等.发酵蔬菜中亚硝酸盐消长规律及调控技