DB46-T 700-2025 芒小果普瘿蚊检疫鉴定规范

ICS65.020.0146DB46/T700—2025 12规范性引用文件 1 14方法原理 1 1 1 1 6.1普瘿蚊属形态特征 6.2芒小果普瘿蚊形态特征 6.3与近似种的鉴别 附录A（资料性）芒小果普瘿蚊生物学特性 附录B（资料性）芒小果普瘿蚊成虫形态特征图 附录C（资料性）芒小果普瘿蚊及其近似种鉴别 附录D（规范性）芒小果普瘿蚊的分子检测 参考文献 DB46/T700—2025本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由海南省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本文件主要起草人：韩冬银、王建赟、叶政培、李磊、符悦冠、张方平、赵菁、邱海燕。DB46/T700—2025芒小果普瘿蚊检疫鉴定规范本文件规定了植物检疫中芒小果普瘿蚊的检疫鉴定方法，包括方法原理、器材和试剂、鉴定特征、现场检疫、室内检测、结果判定等要求，描述了标本保存及档案管理等证实方法。本文件适用于芒小果普瘿蚊的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。芒小果普瘿蚊mangofruit-feedinggallmidge学名：ProcontariniafructiculiJiao,Wang,Bu&Kolesik，隶属于双翅目Diptera、瘿蚊科Cecidomyiidae、普瘿蚊属Procontarinia的为害芒果的一种害虫。4方法原理以芒小果普瘿蚊形态特征为主要鉴定依据，COI基因的序列特征为辅助鉴定依据。芒小果普瘿蚊在GenBank系统的序列号为MG637425、MG637426。5器材和试剂PCR仪，电泳仪，紫外分光光度计，凝胶成像系统，冰箱，低温冰箱，制冰机，水浴锅，离心机，标签等。琼脂糖，DNA提取试剂盒，PCR反应试剂盒等。DB46/T700—20256鉴定特征6.1普瘿蚊属形态特征普瘿蚊属成虫形态特征见表1。表1普瘿蚊属成虫形态特征具12个鞭小节，第1和第2鞭小节融合透明，R脉在翅基部1/2靠前处与C脉汇合；R脉较直且在翅端处或翅端稍靠前处与C脉汇合；Cu脉分叉明显分2瓣6.2芒小果普瘿蚊形态特征芒小果普瘿蚊成虫形态特征见表2，成虫特征实物图见图B.1,雄成虫各部位特征示意图见图B.2。表2芒小果普瘿蚊成虫形态特征DB46/T700—2025表2芒小果普瘿蚊成成虫形态特征（续）产卵器较伸长，伸出时约为腹部其他部分的0.55~长椭圆形，半透明，体长0.15mm～0.25mm。6.2.2幼虫幼虫共4龄。黄色至橘黄色。长1.8mm～2.2mm，宽0.5mm～0.6mm。触角锥形，长约为基部宽的1.6～1.8倍。胸叉具2个齿突，齿突基部隆起，2个齿突由一个U形浅凹分开；与胸叉相近的2组侧瘤突均无毛。末节端部圆钝，具8个瘤突，1对较大的瘤突角锥状，在中央的1对小瘤突有微毛。橘褐色。雄虫体长1.0mm，雌虫1.4mm～1.5mm。触角基具微角突；头部的毛短而细。前胸气门不明显，长而粗壮，向前部渐窄，端部略弯曲，气管伸达前端。6.3与近似种的鉴别芒小果普瘿蚊及其近似种鉴别见附录C。7现场检疫现场检疫抽样按照SN/T2122的规定进行。对芒果植株或苗木进行现场检疫时，重点检查幼果、花序和花蕾有无成虫产卵，或者幼虫孵化后蛀食幼果形成的为害蛀孔，有无活虫或死虫，有无老熟幼虫出果的虫孔；筛查带土苗木的土壤是否有老熟幼虫掉入土中化蛹。对现场检疫发现的虫体用镊子或毛笔收集，以指形管保存，加贴标签。8.1镜检将现场采集的可疑幼虫、蛹或成虫送到实验室，在体视显微镜下对其形态特征进行鉴定。对芒小果普瘿蚊进行分子检测，检测方法按附录D的规定执行。DB46/T700—20259结果判定以成虫的形态特征为主要鉴定依据，蛹和幼虫的形态特征作参考，符合6.2的描述可鉴定为芒小果普瘿蚊。分子检测结果所得序列与GenBank系统中芒小果普瘿蚊的已知序列（MG637425、MG637426）相似度大于98%，则可鉴定为芒小果普瘿蚊。10.1成虫标本保存芒小果普瘿蚊成虫制作成三角纸片标本保存，保存期6个月至永久。10.2卵、幼虫或蛹标本保存卵、幼虫或蛹用蒸馏水清洗后，置于保存液中，保存6个月以上。记录虫体标本来源、采集日期、地点、鉴定方法、镜检图片和结果以及分子检测结果图片、原始数据等信息。专人保管，保存期2年以上。DB46/T700—2025芒小果普瘿蚊生物学特性A.1寄主A.2地理分布菲律宾吕宋岛，广西百色。A.3发生规律该虫喜温暖湿润环境，25℃~30℃、相对湿度70%以上利于其繁殖。干旱或暴雨会抑制种群增长。该虫在广西地区12月中旬至翌年4月下旬，成虫羽化，在芒果嫩梢、花梗、花蕾和幼果上产卵，老熟幼虫掉入土中化蛹，蛹羽化成下一代成虫，再次为害。在芒果初花期至幼果形成期内，该虫可发生数代。荫蔽、通风不良的果园受害较重。A.4为害症状该虫主要为害芒果嫩梢、嫩花梗、花蕾和幼果，致使花穗畸形、枯死，幼果被蛀空并造成落果，芒果园幼果受害率最高可达90%。成虫产卵在嫩梢、花梗、花蕾及幼果上（见图A.1a幼虫孵化后即蛀食幼果，造成落果。初期受害幼果果皮上的产卵点像炭疽病发生初期症状，在放大镜下，受害幼果可见清晰的为害蛀孔（见图A.1b剖开幼果，可见长2mm左右的浅黄色幼虫，有些幼果有多个蛀孔，多条幼虫（见图A.1c）。图A.1芒小果普瘿蚊为害症状A.5传播途经芒小果普瘿蚊成虫飞行能力较弱，不具备远距离扩散能力。主要以幼虫随寄主果实、蛹随寄主附着的土壤，以及卵随寄主的花或子房进行远距离传播。DB46/T700—2025芒小果普瘿蚊成虫形态特征图芒小果普瘿蚊成虫形态特征实物图见图B.1，雄成虫各部位特征示意图见图B.2。图B.1芒小果普瘿蚊成虫形态特征实物图图B.2芒小果普瘿蚊雄成虫各部位特征示意图DB46/T700—2025芒小果普瘿蚊及其近似种鉴别C.1芒小果普瘿蚊及其近似种检索表芒小果普瘿蚊及其近似种检索表见表C.1。表C.1芒小果普瘿蚊及其近似种检索表 DB46/T700—2025芒小果普瘿蚊的分子检测D.1样品前处理用于分子生物学试验的瘿蚊样品在提取DNA之前均应作前处理，卵、幼虫、拟蛹、成虫或部分组织等瘿蚊样品用无菌水冲洗数遍，晾干；干标本、乙醇或福尔马林浸泡的标本先用TE缓冲液（pH8.0）浸D.2瘿蚊基因组总核酸提取D.2.1试剂盒法将瘿蚊样品移入1.5mL离心管或碾钵中,捣碎或加入液氮碾磨,之后实验步骤根据天根基因组DNA提取试剂盒（DP304）的操作说明书操作。瘿蚊基因组DNA溶液置于-20℃冷冻保存。D.2.2提取液法DNA提取按照以下步骤进行：——样品研磨与裂解：将单头瘿蚊置于Parafilm膜上的20μL提取缓冲液(50mmoL/LTris-HCl、1mmol/LEDTA、1%SDS、20mmoL/LNaCl,pH8.0)中，以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，用50μL缓冲液清洗匀浆器4次，合并所有液体；——蛋白质变性：100℃沸水浴加热5min；——洗涤与干燥：加入400μL预冷的75%乙醇洗涤，12000r/min离心15min，弃上清，然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，室温干燥20min；——DNA溶解与保存：每管加入30μL超纯水，充分溶解后于-15μL扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳。然后凝胶成像系统观察分析结果。D.4结果判定琼脂糖凝胶电泳结果待测样品与阳性对照扩增出一条大小为446bp的PCR产物带，空白对照无DNA产物带。将产物进行测序后，结果与GenBank系统中芒小果普瘿蚊的序列相似度大于98%，则可判定为芒小果普瘿蚊。DB46/T700—2025[1]JiaoKL,WangH,WeiDW,etal.AnewspeciesofProcontarinia(Diptera:Cecidomyiidae)damaginZootaxa,2018,4413(2):368-376[2]MoJY,ZhaoG,LiQL,etal.Identificationa